Un pH de Novel In Vitro Live-imagerie phagocytose médiée par dosage de l’Astrocyte utilisant Synaptosomes indicateur conjugué

L’objectif global de cette expérience est de détecter la cinétique d’engloutissement et de dégradation en temps réel des cellules gliales, telles que les astrocytes et les microglies, grâce à l’imagerie en direct in vitro de la phagocytose des synaptosomes conjugués à des indicateurs de pH. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont la phagocytose des cellules gliales est régulée dans les cerveaux sains et malades. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de surveiller et d’analyser efficacement la cinétique phagocytaire en temps réel des cellules gliales grâce à l’imagerie en direct de cellules cultivées in vitro.

Cette méthode peut également être utilisée pour dépister les facteurs et les composés qui régulent la capacité d’engloutissement et de dégradation des cellules gliales. Commencez par centrifuger les échantillons de synaptosomes décongelés pendant trois à quatre minutes à 21 092 g et quatre degrés Celsius. Après avoir aspiré les surnageants, remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de carbonate de sodium à 0,1 molaire par tube, en ajoutant deux microlitres d’indicateur de pH à chaque échantillon après qu’ils aient été soigneusement mélangés.

Après un léger vortex, protégez les solutions de la lumière avec des couvercles en papier d’aluminium et placez les échantillons dans un agitateur rotatif en agitant doucement pendant deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajoutez un millilitre de PBS de Dulbecco, ou DPBS, et recueillez les synaptosomes par centrifugation, en remettant en suspension la pastille dans un millilitre de DPBS frais par lavage. Après la dernière centrifugation, remettre en suspension la pastille de synaptosome non fonctionnelle dans 200 microlitres de DPBS complété par 5 % de DMSO.

Pour l’imagerie en direct de l’engloutissement des synaptosomes, retirez d’abord le surnageant de chaque puits d’une culture d’astrocytes confluents, puis lavez rapidement les cellules trois fois avec un millilitre de DPBS par lavage. Après le dernier lavage, ajoutez 300 microlitres de milieu basique astrocytaire immunopané et cinq microlitres de synaptosomes conjugués à l’indicateur de pH, ainsi que tout facteur supplémentaire pouvant moduler la phagocytose des cellules gliales. Laisser les synaptosomes se déposer au fond des puits et se fixer aux récepteurs de la phosphatidylsérine sur les astrocytes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Après 40 minutes, jetez les surnageants et lavez rapidement mais doucement les puits trois fois avec un millilitre de DPBS par lavage. Après le dernier lavage, ajoutez 500 microlitres de milieu frais complété par les facteurs d’intérêt aux puits appropriés et transférez la plaque sur un instrument d’imagerie en direct. Sélectionnez les positions d’imagerie, ajustez la mise au point, le temps d’exposition, la luminosité et la puissance des LED, et réglez le format d’image, l’intervalle de temps et le nombre total de cycles pour l’imagerie en direct selon les critères expérimentaux.

Ensuite, commencez l’imagerie en direct des expériences de phagocytose. Au point final expérimental approprié, ouvrez un programme d’analyse imagine et importez la séquence d’images en accéléré. Convertissez les images en niveaux de gris 8 bits et lancez une soustraction d’arrière-plan avec un rayon de barre roulante de 50 pixels.

Ensuite, ouvrez le plug-in Time Series Analyzer V3 et faites glisser la région d’intérêt dans le plug-in. Dans le gestionnaire de la région qui vous intéresse, cliquez sur Ajouter. Dans le plug-in Time Series V3, cliquez sur Obtenir l’intensité totale.

Ensuite, enregistrez les résultats et intégrez les données. Après leur préparation, les synaptosomes expriment la phosphatidylsérine sur leurs membranes externes, suggérant une perte de fonction, et qui peut être reconnue par les récepteurs de la phosphatidylsérine sur les astrocytes et la microglie. Lorsque les synaptosomes conjugués à l’indicateur de pH sont phagocytés, ils émettent des fluorescents rouge vif.

Pour quantifier la phagocytose des cellules gliales, l’aire du signal de fluorescence rouge, ou indice phagocytaire, peut être mesurée. Bien que les astrocytes soient efficaces pour phagocyter un grand nombre de synaptosomes conjugués à des indicateurs de pH, les microglies sont plus rapides à engloutir et à dégrader les synaptosomes. Il est intéressant de noter que les facteurs sécrétés par les astrocytes, qui sont contenus dans le milieu conditionné par les astrocytes, sont essentiels à l’augmentation de la phagocytose médiée par les astrocytes et la microglie.

De plus, les astrocytes knock-out MEGF10 de souris ont démontré une capacité phagocytaire significativement altérée par rapport aux cellules de type sauvage. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences et de la biologie des cellules gliales pour explorer les mécanismes impliqués dans la modulation de la phagocytose des cellules gliales en tant que méthode potentielle pour traiter divers troubles neurologiques.