Une Identification sur le réseau neuronale d’ovocytes adulte souris développemental compétent ou incompétent

L’objectif global de cette procédure est l’identification d’occytes ayant une capacité de développement postérieure à l’aide d’un outil non invasif. Le principal avantage de cette méthode est qu’en observant simplement les mouvements des ovocytes se produisant pendant la maturation in vitro, on peut évaluer le potentiel de développement des gamètes femelles. Cette technique est basée sur l’imagerie time-lapse couplée à la vélocimétrie par image de particules, une analyse basée sur un réseau de neurones.

Ici, nous décrirons les étapes prises pour démontrer que les ovocytes de souris, lors de la transition du stade vésical germinal au stade de métaphase deux, présentent un profil différent desdits mouvements plasmiques significativement corrélé à leur compétence ou incompétence développementale. Selon l’Organisation mondiale de la santé, l’infertilité est une pathologie qui touche environ 20 % des couples et en outre, un tiers des femmes subissant un traitement contre le cancer sont à risque d’insuffisance ovarienne prématurée. Cela correspond à environ 300 000 ou 30 000 femmes dans des pays comme les États-Unis ou l’Italie respectivement.

La conception de procédures non invasives pour l’identification de la compétence développementale de l’ovocyte contribuerait à améliorer le succès global des issues de la grossesse. Ici, nous donnons des détails sur les étapes les plus critiques de la procédure telle qu’elle a été développée pour la souris, afin de la rendre facilement disponible pour être testée et utilisée pour d’autres espèces de mammifères telles que les bovins ou les humains. Les ovaires sont transférés dans une boîte de Pétrie contenant du milieu M2 préchauffé et équilibré et 37 degrés centigrades et cinq pour cent de CO2.

Si l’oviducte et un peu de graisse sont encore présents autour de l’ovaire, ils doivent être enlevés. Ensuite, en tenant l’ovaire avec une pince à épiler, sa surface est perforée à l’aide d’une aiguille stérile 1G. Les ovaires ponctionnés sont retirés du milieu M2 et, à l’aide d’une micropipette tirée à la main, nous faisons notre premier pas vers un nouveau milieu M2 propre, puis pipetés pendant quelques secondes jusqu’à ce que les cellules du cumulus entourant l’ovocyte soient complètement éliminées.

Ensuite, les ovocytes sont transférés en gouttes de 20 microlitres de milieu M2 et si certaines cellules du cumulus persistent, elles sont complètement éliminées par plusieurs passages de goutte en goutte jusqu’à ce que les cellules du cumulus soient complètement éliminées. Afin de préparer Hoechst 33342 à une concentration finale de 0,05 microgramme par mil, nous commençons par une solution douce de Hoechst à une concentration de cinq milligrammes par mil, préparée en pbs unique, puis nous la diluons encore jusqu’à ce que la concentration requise soit obtenue. Des microgouttes de 3,5 microlitres de solution Hoechst sont placées au fond d’un couvercle de boîte de Pétrie et chaque ovocyte dilué est ensuite transféré dans une seule goutte de Hoechst, en prenant soin de réduire l’exposition à la lumière pendant le processus de coloration de Hoechst, en recouvrant la boîte avec un couvercle sombre.

Après une coloration de dix minutes, les ovocytes sont observés au microscope fluorescent avec une lumière UV. Sur la base de la conformation de la chromatine, ils sont classés soit comme nucléole entouré, SN, s’ils présentent un anneau de chromatine x-positive autour du nucléole, soit comme nucléole non entouré, NSN, si le nucléole n’a pas d’anneau de chromatine x-positive et que la chromatine globale semble dispersée dans le nucléole. Quatre gouttes de deux microlitres de milieu alpha mem sont déposées sur une boîte de Pétrie à fond en verre en prenant soin de maintenir les gouttes à une distance spécifique, les gouttes sont recouvertes d’huile minérale préchauffée et équilibrée et un total de trois à quatre ovocytes sont transférés dans chaque goutte.

La boîte de Petrie est transférée dans la chambre d’incubation d’un microscope à laps de temps, ce qui permet de maintenir pendant longtemps la température à 37 degrés centigrades et cinq pour cent de CO2 et un éclairage avec une lumière LED rouge. Avant l’analyse time-lapse, à l’aide du logiciel BioStation, les coordonnées de chaque goutte sont définies afin d’automatiser le passage d’une goutte à l’autre pendant la routine time-lapse. Les images en accéléré sont prises à des intervalles de huit minutes pour un total de 15 heures.

Les films enregistrés sont ensuite analysés à l’aide du logiciel CellPave, qui permet de détecter les mouvements cytoplasmiques exprimés en termes de vecteurs de vitesse. Tout d’abord, avec l’outil CellPave, le périmètre de chaque ovocyte est délimité manuellement. Ensuite, le logiciel calcule la vitesse du mouvement cytoplasmique se produisant dans la comparaison entre deux images consécutives en time-lapse et l’exprime en plaçant une flèche colorée dont l’intensité et la longueur de la couleur définissent la vitesse et la direction des mouvements.

L’histogramme sous l’ovocyte que l’on voit ici décrit la vitesse globale du mouvement cytoplasmique tout au long de la période d’enregistrement de 15 heures d’un ovocyte SN. Le même type d’analyse est effectué sur un ovocyte de NSN. Remarquez le retard du pic d’extrusion du globule polaire montré par l’ovocyte NSN par rapport à l’ovocyte SN.

Le bas de l’écran montre le schéma temporel de la vitesse de mouvement cytoplasmique de l’ovocyte. La vitesse est calculée en comparant deux images consécutives. Les données brutes de vitesse de mouvement cytoplasmique sont ensuite exportées vers une feuille Excel rapportant, sur les lignes, la séquence de Frens, et sur les colonnes, l’ovocyte unique analysé.

Sur le côté gauche, les données d’un ovocyte SN, tandis que sur le côté droit, celles d’ovocytes NSN. Les données des ovocytes SN ou NSN sont ensuite divisées en 10 sous-groupes. Neuf sont utilisés pour l’entraînement, de couleur verte.

Et un pour les tests à l’aveugle, de couleur rouge. Cette procédure est répétée 10 fois au total. À chaque fois en changeant l’échantillon de test à l’aveugle.

Les données sont ensuite examinées par le biais d’un réseau de neurones artificiels par anticipation, ou FANN. Le FANN est conçu pour analyser l’ensemble des trames time-lapse, ici appelées Neurones d’Entrée"Ces derniers sont connectés à trois neurones cachés, eux-mêmes liés à deux neurones de sortie. Une sortie donne la probabilité que l’entrée soit un ovocyte compétent.

L’autre, au contraire, que l’entrée est un ovocyte incompétent. La comparaison entre les deux résultats permet de prédire la compétence dula mentale de l’ovocyte avec une précision de 91,03 %. La technique a été mise en place pour les ovocytes de souris comme illustré ici.

Cependant, le futur rappel consiste à le tester sur des ovocytes humains. En fait, les procédures non invasives de l’analyse de la qualité des ovocytes sont particulièrement requises dans le domaine des technologies de reproduction artificielle.