Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

L’objectif global de cette expérience est de détecter la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 à l’aide de SDS-PAGE avec une étiquette de liaison au phosphate. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la maladie de Parkinson, telles que la façon dont les mutations de la maladie LRRK2 affectent la phosphorylation de Rab10. Le principal avantage de cette technique est qu’on peut avoir une estimation approximative de la stœchiométrie de la phosphorylation de Rab10 à l’aide d’un simple western blot.

De nombreuses étapes de ce protocole sont assez standard et sont décrites de manière suffisamment détaillée par le protocole textuel accompagnant cette vidéo. Ici, nous voulons vous montrer les étapes qui bénéficient le plus de l’enseignement visuel. Préparez des plaques de cellules HEK293 transfectées comme décrit dans le protocole texte.

Avec les plaques sur de la glace, aspirez et jetez le support. Ensuite, ajoutez soigneusement deux millilitres de DPBS dans le coin de chaque plaque et basculez les plaques pour étaler la solution. Retirez et jetez ensuite le DPBS.

Ensuite, ajoutez à chaque plaque 100 microlitres de tampon de lyse. Inclinez la plaque et utilisez un grattoir pour étaler le tampon et libérer le lysat cellulaire. Ensuite, aspirez les lysats et transférez-les dans des tubes de microfuge pré-refroidis sur de la glace et attendez 10 minutes.

Ensuite, collectez les lysats cellulaires exempts de débris en centrifugeant les tubes et en transférant les surnageants dans de nouveaux tubes sur de la glace. Mesurez ensuite les concentrations en protéines des lysats clairs à l’aide du test Bradford. Pour les données de concentration, préparez des échantillons de 100 microlitres de lysats pour l’analyse du gel.

Préparez des lysats plus denses pour mesurer le Rab10 endogène par rapport à l’hémagglutinine Rab10 surexprimée. Terminez la préparation des échantillons en les incubant à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, conservez les échantillons à une température inférieure à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin pendant six mois ou plus.

Pour commencer, préparez les cellules SDS-PAGE selon le protocole texte. Ensuite, chargez le gel dans le réservoir et fixez-le avec des pinces à liant. Ensuite, remplissez le réservoir avec un tampon de coulée et éliminez les bulles d’air dans les puits et sous le gel à l’aide d’une aiguille attachée à une seringue.

Ajoutez maintenant du chlorure de manganèse aux échantillons et faites-les tourner pour éliminer les précipités. Chargez ensuite le gel avec des volumes égaux d’échantillon, 10 microgrammes de protéines pour analyser l’hémagglutinine surexprimée Rab10 ou 30 microgrammes de protéines pour analyser l’endogène Rab10. Chargez les voies vides avec un tampon d’échantillon contenant du chlorure de manganèse.

Complétez également le marqueur de poids moléculaire avec un tampon et du chlorure de manganèse pour lui donner le même volume que les échantillons. Commencez maintenant à faire fonctionner le gel à 50 volts. Après l’empilement d’échantillons, augmentez la tension à 120 pour obtenir la séparation.

Lorsque le front du colorant atteint le bas des gels, coupez la tension. Ensuite, lavez le gel trois fois comme suit. Chargez le gel de séparation dans un bain de tampon de transfert propre avec de l’EDTA et du SDS ajoutés.

Ensuite, laissez-le basculer sur un shaker pendant 10 minutes à température ambiante. Après trois lavages, effectuez un autre lavage à l’aide d’un tampon de transfert avec SDS ajouté, mais sans EDTA. Transférez ensuite le gel à l’aide d’un réservoir humide.

Chargez le réservoir dans une boîte à mousse remplie d’eau glacée, connectez le réservoir à une alimentation électrique et démarrez le transfert. Un long transfert avec un refroidissement efficace est essentiel à la procédure. Après le transfert, vérifiez le transfert en colorant la membrane avec du Ponceau S, suivi d’un lavage au TBST selon le protocole textuel.

Ensuite, appliquez un bloc. Plongez le blot dans du TBST laiteux et basculez-le sur un shaker pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirez et jetez la solution bloquante et appliquez la solution d’anticorps primaire.

Maintenant, secouez la membrane pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaires. Ensuite, lavez la membrane avec du TBST frais trois fois comme auparavant.

Après les lavages, plongez le blot dans une solution d’anticorps secondaire et incubez la membrane sur un rocker pendant environ une heure à température ambiante. Après l’incubation, lavez à nouveau la membrane avec du TBST trois fois. Développez maintenant la membrane.

Ajoutez un millilitre de solution ECL à une grande feuille de pellicule plastique. Ensuite, posez la membrane dans l’ECL et retournez-la rapidement pour mouiller les deux côtés. Ensuite, soulevez la membrane et laissez-la s’écouler.

Après l’égouttage, laissez un bord toucher une serviette en papier pendant environ cinq secondes pour aider à évacuer l’excès de solution. Ensuite, enveloppez la membrane dans un film transparent rigide sans plis et transférez-la dans un plateau noir pour l’imagerie. Les cellules HEK293 ont été transfectées avec de l’hémagglutinine Rab10 de type sauvage et 3xFLAG-LRRK2.

Des kinases de type sauvage inactives dans les mutations familiales de la maladie de Parkinson de LRRK2 ont été testées. La co-surexpression de LRRK2 et de Rab10 a entraîné un changement majeur de bande dans le gel P-tag. En revanche, la co-expression avec un mutant inactif de la kinase n’a entraîné aucun changement dans la mobilité de Rab10, ce qui implique que la kinase est la cause du décalage de bande.

De plus, comme prévu, les mutations familiales de la MP ont toutes augmenté le décalage de bande. Le système de gel P-tag a également été utilisé pour analyser des cellules de fibroblastes embryonnaires albinos 3T3-Swiss de souris traitées avec un inhibiteur de LRRK2. Le décalage de bande correspondant à Rab10 endogène phosphorylé a disparu lorsque les cellules ont été traitées avec GSK2578215A.

Le même test a également été réalisé à l’aide de cellules humaines A549. Dans ces expériences, l’efficacité de l’inhibiteur de LRRK2 a été validée à l’aide de l’anticorps anti-p sérine 935 LRRK2, qui est un marqueur bien établi de l’inhibition de LRRK2. Une fois maîtrisée, cette technique ne nécessite que 14 minutes supplémentaires par rapport à une procédure de western blot régulière qui consiste à laver les gels avant le transfert.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la spectrométrie de masse peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la phosphorylation du même résidu de Rab10. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la maladie de Parkinson pour explorer les niveaux endogènes de phosphorylation de Rab10 dans les cellules cultivées ainsi que dans les tissus. N’oubliez pas que travailler avec des microcystines ajoutées au tampon de lyse peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de la préparation des lysats cellulaires.