Name: Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez une méthode de détection de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 utilisant SDS-PAGE avec une balise de liaison du phosphate. Cette technique permet d'estimer la stœchiométrie de phosphorylation dans les cellules HEK293 et d'étudier l'impact des mutations de LRRK2 liées à la maladie de Parkinson.

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Nous remercions le Dr Takeshi Iwatsuboa (Université de Tokyo, Japon) aimablement les plasmides codant pour 3xFLAG-LRRK2 WT et mutants. Nous remercions également m. Dario Alessi (Université de Dundee, Royaume-Uni) aimablement IML-2 et le plasmide codant HA-Rab10. Ce travail a été soutenu par la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant nombre JP17K08265 (G.I.).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une méthode facile et robuste de détecter Rab10 phosphorylation par LRRK2 niveaux endogènes basé sur la méthodologie P-tag. Parce que l’anticorps actuellement disponibles contre phosphorylés Rab10 fonctionne uniquement avec des protéines surexprimée15, la présente méthode utilisant la balise P SDS-PAGE est la seule façon d’évaluer les concentrations endogènes de la phosphorylation de Rab10. En outre, la présente méthode permet l’estimation de la stoechiométrie de la phosphorylat...

PD est l’un des maladies neurodégénératives plus répandues, affectant principalement les neurones dopaminergiques dans le midbrain, ce qui entraîne un dysfonctionnement des systèmes moteurs dans personnes âgées1. Alors que la plupart des patients développent des PD de manière sporadique, il y a des familles qui héritent de la maladie. Mutations dans plusieurs gènes ont été retrouvées à être assemblé avec le FPD2. Un des gènes responsables de FPD est LRRK2, dans lequel huit mutations faux-sens (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S et I2020T), liées à un FPD principalement héréditaire appelé PARK8 ont été jusqu'à présent signalé3,4,5. Plusieurs association pangénomique (GWAS) des patients atteints de la MP sporadiques ont également recensée variations génomiques du locus LRRK2 comme un facteur de risque pour PD, suggérant que l’anomalie dans le fonctionnement du LRRK2 est une cause fréquente de neurodégénérescence dans deux sporadiques et PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 est une grosse protéine (2 527 acides aminés), consistant en un domaine riche en leucine, un liant le GTP de Ras du domaine des protéines complexes (ROC), un C-terminal du domaine, un domaine kinase de sérine/thréonine protéine et un domaine de WD409ROC (COR). Les mutations de FPD huit localiser dans ces domaines fonctionnels ; N1437H et R1441C/G/H/S dans le domaine ROC, Y1699C dans le domaine de la CDR, G2019S et I2020T dans le domaine kinase. Car la mutation G2019S, que l'on trouve le plus souvent de mutation du PD patients10,11,12, augmente l’activité de la kinase de LRRK2 par 2-3 fois in vitro13, on fait l’hypothèse que l’augmentation anormale du phosphorylation de fonction LRRK2 est toxique pour les neurones. Cependant, il a été impossible d’étudier si la phosphorylation des substrats de LRRK2 physiologiquement pertinents est altérée dans les patients Parkinsoniens familial/sporadiques en raison du manque de méthodes évaluant dans les échantillons de patients dérivées.
La phosphorylation des protéines est généralement détectée par immunotransfert ou dosage immuno-enzymatique (ELISA) utilisant des anticorps reconnaissant spécifiquement l’État phosphorylé de protéines ou par spectrométrie de masse. Toutefois, la stratégie de l’ancienne parfois impossible d’appliquer à cause des difficultés dans la création d’anticorps spécifiques à la phosphorylation. Un marquage métabolique des cellules avec phosphate radioactif est une autre option à examiner les niveaux physiologiques de la phosphorylation quand la phosphorylation propres anticorps ne sont pas facilement disponibles. Toutefois, elle nécessite une grande quantité de matières radioactives et implique donc un équipement spécialisé pour la radioprotection14. L’analyse par spectrométrie de masse est plus sensible par rapport à ces méthodes immunochimiques et est devenu populaire dans l’analyse de la phosphorylation des protéines. Cependant, la préparation de l’échantillon est fastidieux et coûteux instruments sont requis pour l’analyse.
Un sous-ensemble de la famille Rab GTPase, y compris Rab10 et Rab8 a été récemment rapporté que des substrats physiologiques directs pour LRRK2 basée sur le résultat d’une analyse de phosphoproteomic à grande échelle15. Ensuite, nous avons démontré que la phosphorylation de Rab10 a été augmentée de mutations de FPD dans les fibroblastes embryonnaires de souris et dans les poumons des souris16de knockin. Dans ce rapport, nous avons choisi d’employer une électrophorèse de gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)-méthode dans laquelle une molécule de P-tag est co polymérisée en gel SDS-PAGE (balise P SDS-PAGE) pour détecter les niveaux endogènes de la phosphorylation de Rab10, fondée sur parce qu’un anticorps très sensible spécifique pour Rab10 phosphorylés manquait encore. Nous n’avons pas réussi à détecter la phosphorylation de Rab8 endogène en raison de la faible sélectivité des anticorps actuellement disponibles pour Rab8 total. Par conséquent, nous avons décidé de mettre l’accent sur la phosphorylation de Rab10. LRRK2 phosphoryle Rab10 à Thr73 localiser au milieu de la région hautement conservée « switch II ». Haute conservation des sites de phosphorylation des protéines Rab est peut-être une des raisons pour lesquelles phosphospecific anticorps reconnaissant les protéines Rab distinctes sont difficiles à faire.
La phosphorylation de Rab8A par LRRK2 inhibe la liaison du Rabin8, un facteur d’échange de nucléotide de guanine (FEM) qui active la Rab8A en échangeant le PIB lié avec GTP15. La phosphorylation de Rab10 et Rab8A par LRRK2 inhibe aussi la liaison des inhibiteurs de la dissociation du PIB (GDIs), qui sont essentiels à l’activation des protéines Rab en extrayant Rab PIB lié aux protéines des membranes15. Collectivement, c’est l’hypothèse que la phosphorylation des protéines Rab par LRRK2 les empêche d’activation bien que le mécanisme moléculaire précis et les conséquences physiologiques de la phosphorylation demeurent flous.
P-tag SDS-PAGE a été inventé par Kinoshita et al. , en 2006 : dans cette méthode, acrylamide était par covalence associée à P-tag, une molécule capturant des phosphates avec une haute affinité, qui copolymérisés en SDS-PAGE gélifie17. Parce que les molécules de P-tag dans un gel SDS-PAGE retardent sélectivement la mobilité électrophorétique des protéines phosphorylées, P-tag SDS-PAGE peut séparer des protéines phosphorylées de ceux non-phosphorylés (Figure 1). Si la protéine d’intérêt est phosphorylé sur les résidus de multiples, on observera une échelle des bandes correspondant aux formes phosphorylées différemment. Dans le cas de Rab10, nous n'observons qu’une bande décalée, indiquant que Rab10 est phosphorylé uniquement à Thr73. L’avantage majeur de P-tag SDS-PAGE immunoblotting avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation est que Rab10 phosphorylés peuvent être détectées par immunotransfert avec des anticorps non spécifiques à la phosphorylation (c.-à-d., reconnaissance Rab10 total) Après avoir été transféré sur la membrane, qui est généralement plus spécifiques, sensibles et disponible de sources commerciales et universitaires. Un autre avantage d’utiliser la balise P SDS-PAGE, c’est qu’on peut obtenir une estimation approximative de la stoechiométrie de la phosphorylation, ce qui est impossible par immunotransfert avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation ou par marquage métabolique des cellules avec radioactif phosphates.
Hormis l’utilisation peu coûteuse balise P acrylamide et quelques modifications mineures liées à celui-ci, la présente méthode pour la détection de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 suit un protocole général d’immunoblotting.Par conséquent, il devrait être simple et facilement exécutable dans les laboratoires où immunoblotting est une pratique habituelle, avec tous les types d’échantillons, y compris des homogénats tissulaires, lysats cellulaires et protéines purifiées.

<table><tbody><tr><td><Réactifs forts></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>maison</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 dans de l’eau MilliQ et stérilisé par autoclave</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique de sodium 12-Water</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % Trypsine (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Diluer 10 fois avec du DPBS stérile pour la préparation d’une solution</td></tr> <tr><td>de travailDulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal</td><td>bovin BioWest</td><td>S1560</td><td>Inactivé à la chaleur à 56 &deg ; C pour 30 min</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine HCl MAX, Linéaire, Mw 40 000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td> Une <td>solution mère a été préparée dans 20 mM d’HEPES-NaOH pH 7,0 à 1 mg/mL, puis le pH a été ajusté à 7,0 avec</td></tr><tr><td>du NaOH Diméthylsulfoxyde</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyéthylène(10) Octylphényléther</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Équivalent au Triton X-100</td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Acide glycérophosphorique Sel disodique Pentahydraté</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate décahydraté</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Dissoudre un comprimé dans 1 mL d’eau, qui peut être conservé à -20 &deg ; C pendant un mois. Utilisez-le à une dilution de 1:50 pour la lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de liaison au phosphate acrylamide</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-tag acrylamide</td></tr><tr><td>40 % (p/v) solution d’acrylamide</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrylamide :Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>Solution à 10 % (p/v) a été préparée en dissolvant la poudre de persulfate d’ammonium dans de l’eau MilliQ</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Marqueur de poids moléculaire utilisé dans le protocole</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Membrane nitrocellulosique</td></tr><tr><td>Durapore Membrane Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>Membrane PVDF</td></tr><tr><td>Papiers filtres No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>polyoxyéthylènesmonolaurate d’orbitan</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Laboratoires Difco</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>Solution ECL (Sensibilité normale)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>Solution ECL (Haute sensibilité)</td></tr><tr><td>Solution de coloration CBB</td><td>maison</td><td></td><td>1 g de CBB R-250, 50 % (v/v) de méthanol, 10 % (v/v) d’acide acétique dans 1 L d’eau MilliQ</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>Décoloration CBB solution</td><td>maison</td><td></td><td>12 % (v/v) de méthanol, 7 % (v/v) d’acide acétique dans 1 L d’eau MilliQ</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA Sigma-Aldrich</td><td></td><td>11583816001</td><td>Utilisé à 0,2 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr>anticorps <td>anti-Rab10</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Utilisé à 1:1000 pour l’immunoblotting. La spécificité a été confirmée par CRISPR KO dans Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>anticorps anti-pSer935</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Utilisé à 1 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr><td>anticorps anti-LRRK2</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Utilisé à 1 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr><td>anticorps anti-&alpha ;-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Utilisé à 1 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr><td>anticorps anti-GAPDH</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Utilisé à 0,02 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Utilisé à 0,16 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Utilisé à 0,16 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Inhibitors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>La solution mère a été préparée dans du DMSO à 10 mM et stockée à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Fourni par le Dr Dario Alessi (Université de Dundee)</td><td></td>La <td>solution mère a été préparée dans du DMSO à 10 mM et stockée à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>Fourni par Dr Dario Alessi (Université de Dundee)</td><td></td><td>Ce plasmide exprime le Rab10 humain marqué amino-terminal HA.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochimie, 46 : 1380&ndash ; 1388 (2007). Ce plasmide exprime amino-terminalement LRRK2 humain de type sauvage marqué 3xFLAG.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochimie, 46 : 1380&ndash ; 1388 (2007). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant inactif de la kinase K1906M marquée 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Ce papier. Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant FPD N1437H marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimie, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441C FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441G FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441H FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Ce papier. Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441S FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant Y1699C FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime de manière amino-terminale le mutant FPD G2019S marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimie, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant I2020T FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed</td><td></td></tr><tr><td>Auto</td><td>Pipette Drummond</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash ; 10 &mu ; L</td></tr><tr><td>Micropipette P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash ; 200 &mu ; L</td></tr><tr><td>Micropipette P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash ; 1000 &mu ; L</td></tr><tr><td>Pointes pour micropipette P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Pointes stériles</td></tr><tr><td>pour micropipette P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>Pointes stériles</td></tr><tr><td>pour micropipette P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>disporable stérile 5 mL</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Pipette disporable stérile</td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Pipette disporable stérile</td></tr><tr><td>de 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>Hématocytomètre</td> stérile <td>Sunlead</td><td>Glass A126</td><td>Microscope Neubeuer amélioré</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Pour la culture</td></tr> <tr><td>tissulaireMélangeur Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Racleurs à cellules</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 mL</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuses</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Non destiné à la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash ; PAGE réservoirs</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs de transfert</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de gel (crantées)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de gel (unies)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Entretoises en silicone</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>Peignes 17 puits</td><td>Nihon Eido</td><td>Sur</td><td></td> mesure</tr><tr><td>Pinces à reliure</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Centrale électrique 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>Alimentation pour SDS&ndash ; PAGE et transfert</td></tr><tr><td>Grands bateaux de pesée</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Conteneurs en plastique</td><td>AS ONE</td><td>PS CASE No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Agitateur à bascule</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Boîte en mousse de styrène</td><td>générique</td><td></td><td>Les dimensions intérieures doivent correspondre à un réservoir de transfert (200 x 250 x 250 mm).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Un imageur équipé d’une caméra CCD refroidie pour la détection de l’ECL</td></tr></tbody></table>

rab10 détection de phosphorylation par lrrk2 l’activité à l’aide de sds-page avec une balise de phosphate-binding

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations de leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) ont été démontrées d’être liée à la maladie de Parkinson familiale (FPD). Étant donné que l’activation anormale de l’activité de la kinase de LRRK2 a été impliquée dans la pathogénie de PD, il est essentiel d’établir une méthode permettant d’évaluer les niveaux physiologiques de l’activité de la kinase de LRRK2. Des études récentes ont révélé que LRRK2 phosphoryle des membres de la famille Rab GTPase, y compris Rab10, dans des conditions physiologiques. Bien que la phosphorylation de Rab10 endogène par LRRK2 dans des cellules cultivées puisse être détectée par spectrométrie de masse, il a été difficile de le détecter par immunotransfert en raison de la sensibilité médiocre d’anticorps de phosphorylation spécifiques actuellement disponibles pour Rab10. Nous décrivons ici une simple méthode de détecter les niveaux endogènes de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 basée sur immunoblotting utilisant sur gel de polyacrylamide sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) combinée avec une étiquette de liaison phosphate (P-tag), qui N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-méthyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Le présent protocole non seulement fournit un exemple de la méthode utilisant la balise P mais permet également l’évaluation de comment les mutations comme inhibiteur traitement/administration ou tout autre facteur modifie la signalisation en aval de LRRK2 dans les cellules et tissus .

Surexpression système : Phosphorylation des HA-Rab10 de 3 × drapeau-LRRK2 dans HEK293 cellules :
Les cellules HEK293 ont été transfectées avec 0,266 µg d’HA-Rab10 sauvage et 1,066 µg de 3 × drapeau-LRRK2 (mutant sauvage, kinase-inactive (K1906M), ou des mutants FPD). La phosphorylation de Rab10 a été étudiée par P-tag SDS-PAGE, suivi par immunotransfert à l’aide d’un anti-HA anticorps (Figure 2). 10 µg...

La présente étude décrit une méthode simple de détecter des taux endogènes de la phosphorylation de Rab10 de leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

L’objectif global de cette expérience est de détecter la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 à l’aide de SDS-PAGE avec une étiquette de liaison au phosphate. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la maladie de Parkinson, telles que la façon dont les mutations de la maladie LRRK2 affectent la phosphorylation de Rab10. Le principal avantage de cette technique est qu’on peut avoir une estimation approximative de la stœchiométrie de la phosphorylation de Rab10 à l’aide d’un simple western blot.De nombreuses étapes de ce protocole sont assez standard et sont décrites de manière suffisamment détaillée par le protocole textuel accompagnant cette vidéo. Ici, nous voulons vous montrer les étapes qui bénéficient le plus de l’enseignement visuel. Préparez des plaques de cellules HEK293 transfectées comme décrit dans le protocole texte.Avec les plaques sur de la glace, aspirez et jetez le support. Ensuite, ajoutez soigneusement deux millilitres de DPBS dans le coin de chaque plaque et basculez les plaques pour étaler la solution. Retirez et jetez ensuite le DPBS.Ensuite, ajoutez à chaque plaque 100 microlitres de tampon de lyse. Inclinez la plaque et utilisez un grattoir pour étaler le tampon et libérer le lysat cellulaire. Ensuite, aspirez les lysats et transférez-les dans des tubes de microfuge pré-refroidis sur de la glace et attendez 10 minutes.Ensuite, collectez les lysats cellulaires exempts de débris en centrifugeant les tubes et en transférant les surnageants dans de nouveaux tubes sur de la glace. Mesurez ensuite les concentrations en protéines des lysats clairs à l’aide du test Bradford. Pour les données de concentration, préparez des échantillons de 100 microlitres de lysats pour l’analyse du gel.Préparez des lysats plus denses pour mesurer le Rab10 endogène par rapport à l’hémagglutinine Rab10 surexprimée. Terminez la préparation des échantillons en les incubant à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, conservez les échantillons à une température inférieure à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin pendant six mois ou plus.Pour commencer, préparez les cellules SDS-PAGE selon le protocole texte. Ensuite, chargez le gel dans le réservoir et fixez-le avec des pinces à liant. Ensuite, remplissez le réservoir avec un tampon de coulée et éliminez les bulles d’air dans les puits et sous le gel à l’aide d’une aiguille attachée à une seringue.Ajoutez maintenant du chlorure de manganèse aux échantillons et faites-les tourner pour éliminer les précipités. Chargez ensuite le gel avec des volumes égaux d’échantillon, 10 microgrammes de protéines pour analyser l’hémagglutinine surexprimée Rab10 ou 30 microgrammes de protéines pour analyser l’endogène Rab10. Chargez les voies vides avec un tampon d’échantillon contenant du chlorure de manganèse.Complétez également le marqueur de poids moléculaire avec un tampon et du chlorure de manganèse pour lui donner le même volume que les échantillons. Commencez maintenant à faire fonctionner le gel à 50 volts. Après l’empilement d’échantillons, augmentez la tension à 120 pour obtenir la séparation.Lorsque le front du colorant atteint le bas des gels, coupez la tension. Ensuite, lavez le gel trois fois comme suit. Chargez le gel de séparation dans un bain de tampon de transfert propre avec de l’EDTA et du SDS ajoutés.Ensuite, laissez-le basculer sur un shaker pendant 10 minutes à température ambiante. Après trois lavages, effectuez un autre lavage à l’aide d’un tampon de transfert avec SDS ajouté, mais sans EDTA. Transférez ensuite le gel à l’aide d’un réservoir humide.Chargez le réservoir dans une boîte à mousse remplie d’eau glacée, connectez le réservoir à une alimentation électrique et démarrez le transfert. Un long transfert avec un refroidissement efficace est essentiel à la procédure. Après le transfert, vérifiez le transfert en colorant la membrane avec du Ponceau S, suivi d’un lavage au TBST selon le protocole textuel.Ensuite, appliquez un bloc. Plongez le blot dans du TBST laiteux et basculez-le sur un shaker pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirez et jetez la solution bloquante et appliquez la solution d’anticorps primaire.Maintenant, secouez la membrane pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaires. Ensuite, lavez la membrane avec du TBST frais trois fois comme auparavant.Après les lavages, plongez le blot dans une solution d’anticorps secondaire et incubez la membrane sur un rocker pendant environ une heure à température ambiante. Après l’incubation, lavez à nouveau la membrane avec du TBST trois fois. Développez maintenant la membrane.Ajoutez un millilitre de solution ECL à une grande feuille de pellicule plastique. Ensuite, posez la membrane dans l’ECL et retournez-la rapidement pour mouiller les deux côtés. Ensuite, soulevez la membrane et laissez-la s’écouler.Après l’égouttage, laissez un bord toucher une serviette en papier pendant environ cinq secondes pour aider à évacuer l’excès de solution. Ensuite, enveloppez la membrane dans un film transparent rigide sans plis et transférez-la dans un plateau noir pour l’imagerie. Les cellules HEK293 ont été transfectées avec de l’hémagglutinine Rab10 de type sauvage et 3xFLAG-LRRK2.Des kinases de type sauvage inactives dans les mutations familiales de la maladie de Parkinson de LRRK2 ont été testées. La co-surexpression de LRRK2 et de Rab10 a entraîné un changement majeur de bande dans le gel P-tag. En revanche, la co-expression avec un mutant inactif de la kinase n’a entraîné aucun changement dans la mobilité de Rab10, ce qui implique que la kinase est la cause du décalage de bande.De plus, comme prévu, les mutations familiales de la MP ont toutes augmenté le décalage de bande. Le système de gel P-tag a également été utilisé pour analyser des cellules de fibroblastes embryonnaires albinos 3T3-Swiss de souris traitées avec un inhibiteur de LRRK2. Le décalage de bande correspondant à Rab10 endogène phosphorylé a disparu lorsque les cellules ont été traitées avec GSK2578215A.Le même test a également été réalisé à l’aide de cellules humaines A549. Dans ces expériences, l’efficacité de l’inhibiteur de LRRK2 a été validée à l’aide de l’anticorps anti-p sérine 935 LRRK2, qui est un marqueur bien établi de l’inhibition de LRRK2. Une fois maîtrisée, cette technique ne nécessite que 14 minutes supplémentaires par rapport à une procédure de western blot régulière qui consiste à laver les gels avant le transfert.Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la spectrométrie de masse peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la phosphorylation du même résidu de Rab10. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la maladie de Parkinson pour explorer les niveaux endogènes de phosphorylation de Rab10 dans les cellules cultivées ainsi que dans les tissus. N’oubliez pas que travailler avec des microcystines ajoutées au tampon de lyse peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de la préparation des lysats cellulaires.

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Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l'activité kinase de cette protéine s'est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce...

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

Cette vidéo présente une technique de quantification sensible de la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test pull-down à molécule unique. La fonctionnalisation de la polyéthylène glycol-biotine et l’utilisation d’anticorps marqués augmentent la détection de la tyrosine phosphorylée avec spécificité.

Dosage par pull-down d’une seule molécule pour l’analyse de la phosphorylation des protéines : une technique à haut débit pour quantifier la phosphorylation des protéines dans le lysat cellulaire

Répétition riche en leucine kinases 1 et 2 (et LRRK1 LRRK2) sont des protéines à domaines multiples qui codent à la fois GTPase et domaines de kinase et qui sont phosphorylées dans les cellules. Ici, nous présentons un protocole d'étiqueter LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec 32 P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer leur niveau global de phosphorylation cellulaire.

Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

Nous décrivons ici une procédure permettant une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps phosphospécifiques.

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

Les tests de compétition peptidique sont largement utilisés dans une variété d'expériences moléculaires et immunologiques. Cet article décrit une méthode détaillée pour un test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro et les procédures de validation associées, qui peuvent être utiles pour trouver des sites de phosphorylation spécifiques.

Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

Les mutations dans le gène riche de leucine de répétition de kinase 2 (LRRK2) causent la maladie héréditaire de Parkinson. Nous avons développé une méthode facile et robuste pour évaluer la phosphorylation LRRK2-contrôlée de Rab10 dans les neutrophiles périphériques humains de sang. Ceci peut aider à identifier des individus avec l’activité accrue de voie de kinase de LRRK2.

Isolement humain de neutrophile de sang périphérique pour interroger la voie de kinase LRRK2 associée de Parkinson en évaluant la phosphorylation de Rab10

L’objectif de ce protocole est à étiqueter, enrichir et identifier les substrats de la protéine-kinase CK2 auprès d’un échantillon biologique complex tel qu’un lysat cellulaire ou l’homogénat tissulaire. Cette méthode s’appuie sur des aspects uniques de la CK2 biologie à cet effet.

Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente

Nous avons caractérisé une nouvelle protéine de kinase utilisant des approches biochimiques robustes : analyse de blot occidental avec un anticorps spécifique consacré sur différentes lignées et tissus de cellules, interactions par des expériences de coimmunoprecipitation, activité de kinase détectée par l'ouest Blot à l'aide d'un anticorps spécifique au phospho et par l'étiquetage ATP de32P.

Caractérisation au niveau moléculaire à l'aide d'approches biochimiques robustes d'une nouvelle protéine Kinase

Ce protocole décrit la quantification rapide et très sensible de Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) des données de capteur en utilisant un analyseur portable FRET-mesure. Le dispositif a été utilisé pour détecter le maltose dans une plage de température critique qui maximise la sensibilité de détection, ce qui permet une évaluation pratique et efficace de la teneur en sucre.

Hautement sensible et rapide avec détection par fluorescence avec un analyseur FRET Portable

Cette étude décrit les techniques biophysiques, biochimiques et moléculaires permettant de caractériser l'activité de chaperon d'Escherichia coli HdeB dans des conditions de pH acides. Ces méthodes ont été appliquées avec succès pour d'autres chaperons acide de protection tels que HdeA et peuvent être modifiés pour travailler pour d'autres chaperons et des conditions de stress.

Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Découvrez une méthode de détection de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 utilisant SDS-PAGE avec une balise de liaison du phosphate. Cette technique permet d'estimer la stœchiométrie de phosphorylation dans les cellules HEK293 et d'étudier l'impact des mutations de LRRK2 liées à la maladie de Parkinson.

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

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