Name: Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez le suivi 3D en temps réel de particules uniques pour la virologie en utilisant un microscope à fluorescence. Cette méthode permet d'observer continuellement des virions individuels avec une résolution temporelle élevée malgré des conditions de photons limités.

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Ce travail a été soutenu par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le numéro R35GM124868 de la sentence et de Duke University.

1. configurer la mise en page et alignement
<ol>
	<li>Installation et collimation de l’excitation de suivi laser<ol>
		<li>Fixer le laser sur la table optique à l’aide d’une monture de construction artisanale. La monture est une plaque d’aluminium simple avec trous pour la tête du laser et la table optique. Le laser doit être fermement fixé à une monture en métal pour la stabilité et la dissipation thermique. Pour ce travail, utiliser un laser à état solide 488 nm pour l’éclairage (Figure 1), bien que la longueur d’onde peut être sélectionné pour convenir à un fluorophore particulière ou d’expérimenter. Un facteur critique est que la longueur d’onde laser correspondre à la gamme de travail 2D-NEM, qui est déterminée principalement par la plaque nervurée entre les deux déflecteurs (Figure 1: W2). Le laser à 488 nm peut exciter efficacement la verte ou jaune protéine fluorescente (GFP/YFP), qui sont les étiquettes fluorescentes communes dans les expériences de cellules vivantes.</li>
		<li>Ajuster la hauteur du faisceau laser et la direction à l’aide d’une paire de miroirs diélectriques (Figure 1: M). Veillez à ce que le faisceau laser est parallèle à la table optique et l’ajuster à une hauteur adéquate. Remarque : La hauteur doit être choisie selon la plateforme microscope. Cette hauteur doit être maintenue pour tous les miroirs suivants utilisés dans le présent protocole, bien qu’il ne sera pas explicitement déclaré.</li>
		<li>Collimater la poutre avec une paire de lentilles (Figure 1: L1 et L2). La longueur focale des objectifs doivent être choisie avec soin pour éviter le spot laser étant coupé par l’ouverture de la 2D-EOD. Découpage est évident par un changement dans la forme du faisceau laser après avoir traversé la 2D-EOD. La qualité de collimation ici est très importante car les aberrations seront amplifiées par les lentilles et toute divergence se dégraderait les performances de la déviation 2D-EOD. Idéalement, collimater le faisceau en concentrant le faisceau jusqu'à un point situé au moins à 20 mètres.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placer un sténopé (Figure 1: PH) de taille appropriée à la mise au point de la première lentille de collimation (Figure 1: L1).<ol>
		<li>Choisissez un sténopé de taille appropriée. La taille du trou d’épingle peut être choisie selon le calcul suivant : 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Où λ est la longueur d’onde du laser, f est la focale de l’objectif premier, et D est le diamètre du faisceau d’entrée.</li>
		<li>Monter le sténopé sur une scène de translation 3D afin qu’il puisse être placé précisément au foyer de la première lentille de collimation.</li>
		<li>Ajustez la position de la trou d’épingle. Placez un mesureur de puissance de laser après le trou d’épingle et ajustez la position de trou d’épingle dans XYZ pour optimiser l’affichage du compteur électrique. Si on observe un anneau de diffraction, il bloque avec un iris placé avant la 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation de polariseur de Glan-Thompson<ol>
		<li>Mettre le polariseur de Glan-Thompson (Figure 1: GP) après la seconde lentille de collimation (Figure 1: L2) pour nettoyer la polarisation du faisceau laser. Tourner le polariseur pour trouver une transmission maximale avec le wattmètre.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation du DOE<ol>
		<li>Utiliser 2 SEMP (Figure 1: EOD1 &amp; EOD2) pour faire dévier le laser dans les directions X et Y. Optimiser la transmission de laser en ajustant le lacet, tangage et hauteur de chaque NEM.</li>
		<li>Aligner les deux SEMP à l’égard de l’autre en utilisant le repère d’alignement fourni par le fabricant sur le côté de chaque déflecteur.</li>
		<li>Appliquer un motif de test pour le contrôleur de la 2D-EOD pour inspecter la sortie de l’EOD. Cela peut être tournée de chevalier (Figure 2) via le FPGA décrites ci-dessous ou une simple onde sinusoïdale produite par un générateur de fonction. Pour des performances optimales, la déviation par chaque déflecteur devrait être parallèle au sens de le X ou de Y de la NANOPOSITIONNEUR piezo. Cette orientation est dictée par la direction angulaire des déflecteurs autour de l’axe de transmission. Pour faire pivoter le sens de débattement sans bouger le 2D-NEM, placer un prisme colombe après la 2D-EOD pour aligner les axes de déviation pour les axes de NANOPOSITIONNEUR piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation de plaque demi-onde<ol>
		<li>Posez une plaque de demi-onde (Figure 1: W1) entre le polariseur de Glan-Thompson (Figure 1: GP) et la polarisation du faisceau 2D-jeo pour aligner le laser entrant avec les axes de la déflexion de la 2D-EOD. Placez un objectif de longue focal (300 mm) après la 2D-EOD et placer une caméra sCMOS à la mise au point du laser. Activez ensuite la 2D-EOD pour générer tour du chevalier décrite ci-dessous (Figure 2). Tournez la plaque demi-onde jusqu'à ce qu’une distribution de laser uniformément carré est observée sur la caméra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation d’un faisceau dépensant lentille paire et paire de lentille de relais<ol>
		<li>Placez une paire de lentilles (Figure 1: L3 et L4) après la 2D-EOD pour élargir le faisceau pour combler l’ouverture arrière de la lentille de l’objectif (Figure 1: Lo) et une autre paire de lentilles (Figure 1: L5 et L6) à Relais du plan focal de l’objectif de microscope. N’oubliez pas de laisser assez d’espace entre ces deux paires de lentilles que la lentille du TAG sera installée entre eux dans une étape ultérieure.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installer le filtre dichroïque, séparateur de faisceau de 10/90, en se concentrant lentille, APD, objectif et filtre d’émission de fluorescence pour compléter le parcours de détection.<ol>
		<li>Installer le filtre dichroïque (Figure 1: DC) afin de refléter le laser vers l’objectif. Aligner le laser pour aller tout droit à travers le centre de la lentille de l’objectif à l’aide de deux Iris sur le dessus et le fond d’un tube de longue focale.</li>
		<li>Installer un séparateur de faisceau de 10/90 (Figure 1: BS) par dont 10 % de la lumière est réfléchie pour l’imagerie par une caméra sCMOS (décrit ci-dessous) et 90 % de la traverse à l’APD pour le suivi.</li>
		<li>Aligner la DGPA. Concentrer le laser sur un lamelle couvre-objet de la lentille de l’objectif. Utilisez la réflexion de la lamelle couvre-objet pour aligner des éléments tout en aval en mettant une lamelle à la mise au point objective et en vérifiant l’intensité de l’affichage de la DPA. Après le séparateur de faisceau, installer la DGPA concentrant (Figure 1: L7) suivie de l’APD sur une scène de translation 3D. Placez la lentille de telle sorte que la réflexion du laser de l’objectif passe par le centre de la lentille.</li></ol></li></ol>La position de l’APD peut être optimisée en ajustant la position 3D afin de maximiser l’intensité de la réflexion du laser sur la lamelle couvre-objet. La position de l’APD est à la position optimale lors d’un déplacement de la position du détecteur dans une direction quelconque diminue l’intensité.
		<li>Installer un filtre d’émission de fluorescence longpass (Figure 1: F) avant le séparateur de faisceau pour enlever la lumière réfléchie et épars.</li>
	
	
	<li>Installation de la lentille de TAG<ol>
		<li>Placer la lentille TAG entre les deux paires de lentilles (entre Figure 1: L4 et L5) comme mentionné avant et illustré à la Figure 1. Régler le lacet, tangage, hauteur et position latérale de sorte que le faisceau passe perpendiculairement à travers le prisme du centre du TAG.</li>
	</ol>
	</li>

2. préparation de l’échantillon.
<ol>
	<li>Préparation de la particule fixe<ol>
		<li>Diluer les perles fluorescentes de 190 nm à ~ 5 × 108 perles/mL dans du PBS. Ajouter 400 µL de solution de perles sur une lamelle couvre-objet et le montage sur le porte-échantillon de la scène piézoélectrique (le volume de billes dépendra le porte-échantillon ; le diamètre de la chambre de porte échantillon utilisé ici est de 18 mm). Pour les perles utilisées ici, PBS entraîne les particules de se déposer sur la lamelle couvre-objet.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation de particules mobiles gratuit<ol>
		<li>Diluer les perles fluorescentes de 110 nm à ~ 5 × 108 perles/mL avec de l’eau distillée. Ajouter 400 µL de solution de perles sur un lamelle couvre-objet et montez sur le porte-échantillon de la scène piézoélectrique.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimiser les paramètres de suivi
<ol>
	<li>Balayage de trame fixé les particules<ol>
		<li>Mettre un échantillon de particules fixe sur le microscope.</li>
		<li>Allumer le laser micropositionneur contrôleur, piezo NANOPOSITIONNEUR contrôleur, contrôleur d’objectif TAG et contrôleur de NEM. Notez que l’ordre n’est pas critique. Exécutez le NANOPOSITIONNEUR piezo en boucle fermée.</li>
		<li>Raster scan l’échantillon dans XYZ à l’aide d’un programme de logiciel numérisation personnalisée (Figure S3, logiciel disponible sur demande auprès des auteurs), qui actionne le 2D-EOD à tour un chevalier (Figure 2), recueille le compte de la DPA, pousse le piezo NANOPOSITIONNEUR et effectue le calcul de position (Figure S2). La taille de palier est de 40 nm et la plage de balayage est de 2 µm.<ol>
			<li>Pour placer la lamelle à la mise au point de l’objectif, enlever le filtre d’émission de fluorescence et utilisez la réflexion du laser de la lamelle couvre-objet pour maximiser l’intensité du signal en fonction de la position Z de l’autre. Après avoir placé l’échantillon dans le plan focal, introduire à nouveau le filtre d’émission de fluorescence.</li>
			<li>Ouvrez le programme de numérisation. Définir la plage de balayage et de la taille d’étape en tapant le numéro dans le « démarrer », « finir » et « étape ». Tout d’abord définir une large gamme de balayage et la taille de palier pour localiser une particule (par exemple, 10 x 10 µm estimés avec la taille de palier 200 nm). Après avoir trouvé la particule, rétrécir la plage de balayage et diminuer la taille de palier (par exemple, 2 x 2 µm estimés avec la taille de palier 100 nm). Cliquez sur le bouton « scan » pour effectuer un scan 3D raster pour trouver l’objet fluorescent.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Paramètres de lentille de TAG (voir aussi la Figure 3)<ol>
		<li>Cliquez sur le logiciel de commande de lentilles de TAG. Cliquez sur « connect », « sous tension » dans l’ordre.</li>
		<li>Pour modifier la phase de sortie du signal déclencheur, il est nécessaire de changer le mode de déclenchement de sortie. Tout d’abord modifier le mode de « RGB » à « Multiplane » et puis remodifier. Maintenant, la phase peut être changé (Figure 3 b).</li>
		<li>Régler la phase de sortie à 0 °, 90 ° et 270 °. Alors que les trois phases qui couvrent l’espace des phases peuvent être utilisés, ces trois sont trouvent à travailler bien empiriquement (Figure 3C).</li>
		<li>Sélectionnez le paramètre de fréquence de 68 500 Hz.</li>
		<li>Pour trouver la fréquence optimale, il est souvent nécessaire de changer la fréquence de recherche. Cliquez sur « avancé », « réglage ». Changer le ' Max. FREQ(Hz)' de la colonne 0 de 70 000 Hz à 71 500 Hz. Cela peut être réglé pour quelle gamme de fréquences est approprié. Cliquez sur « Enregistrer d’étalonnage », « quitter calibrage » (Figure 3d).</li>
		<li>Pour rendre le nouvel étalonnage efficace, passer la résonance à une autre fréquence (par exemple, 189 150 Hz) et ensuite commuté sur le paramètre de fréquence de 68 500 Hz (Figure 3e).</li>
		<li>Changer l’amplitude progressivement à 35 %. Cliquez sur « Verrouiller la résonance ». Une fois la fréquence est verrouillée, cliquez sur « Débloquer résonance » (Figure 3e). L’objectif de TAG est prêt à l’emploi maintenant.</li>
		<li>Pour calibrer, modifier les paramètres qui sont utilisés dans l’estimation pour rendre la position estimée égale à la position réelle, comme illustré à la Figure 4e, f. entrée de la gamme de balayage de x, y, et z puis cliquez sur le « scan » bouton pour analyser l’échantillon dans XYZ pour déplacer le particules à travers le faisceau laser mobile. La position de la particule comme il est scanné par le biais de la mise au point du laser devrait convenir avec la position de la particule estimatif déterminée par la boucle d’estimation de position (Figure S1). La relation entre la position estimée et la position réelle (Figure 4D) peut être extraites d’images de position estimée (Figure 4f). Si les positions sont en désaccord, ajuster les valeurs de position de laser (ch.k) utilisé dans la boucle d’estimation de position (Figure S1).</li>
		<li>Aligner la lentille de la balise<ol>
			<li>Lorsque le contrôleur de lentille de TAG est désactivée, le raster scanné images de particules (décrits ci-dessous) avant d’installer la lentille TAG et après que installation TAG lentille devrait regarder identique. Ensuite, exécuter le pile de particules fluorescentes Z numérisation en déplaçant l’objectif avec le NANOPOSITIONNEUR de z pour régler la position et l’angle de lentille TAG (Figure 4). Régler la position de la lentille de TAG jusqu'à ce qu’il n’y a aucune dérive dans les images de particules dans le plan XY dans la direction Z, qui est atteinte quand il n’y a aucun changement dans la position XY de la particule en fonction de la position Z (Figure 4D). Le système de suivi est prêt à l’emploi après l’alignement de la lentille de TAG.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installation de sCMOS caméra de surveillance de particules<ol>
		<li>Installer une caméra de sCMOS pour visualiser les particules alors qu’ils sont suivis. Installer la sCMOS qu’une fois tous les composants du système de poursuite ont été installés et optimisés.</li></ol></li></ol>Charger un échantillon de particules fluorescentes fixe sur le microscope et exécutez le programme de suivi pour verrouiller une particule dans le volume focal objectif. Ensuite, installez la lentille de distance focale de 100 mm (Figure 1: L8) et sCMOS. Ajustez la position de sCMOS afin que l’image de la particule se concentre à l’endroit le plus petit et plus brillants.
	
	

4. en temps réel suivi 3D de diffuser librement des nanoparticules
<ol>
	<li>Mettre le 110 nm libre déplacement échantillon de particules sur le microscope.</li>
	<li>Allumez, laser, micro-positionneur contrôleur, piezo NANOPOSITIONNEUR contrôleur, contrôleur d’objectif TAG et contrôleur de NEM. Exécutez le NANOPOSITIONNEUR piezo en boucle ouverte. Configurez le logiciel de lentille de TAG selon l’étape 3.2.</li>
	<li>Ouvrez et exécutez le logiciel de suivi (disponible sur demande auprès des auteurs). Régler la position de paramètres d’estimation sur leurs valeurs optimisées, qui ont été trouvés dans la Section 3.</li>
	<li>Pour placer la lamelle à la mise au point de l’objectif, enlever le filtre d’émission de fluorescence et utilisez la réflexion du laser de la lamelle couvre-objet pour maximiser l’intensité du signal en fonction de la position Z de l’autre. Après avoir trouvé la lamelle, augmenter la mise au point position 15 µm pour concentrer le laser de la lamelle couvre-objet et dans la solution. Introduire à nouveau le filtre d’émission de fluorescence.</li>
	<li>Définissez les constantes de commande incorporé. Les constantes de commande incorporé peuvent être définies à partir de faible valeur et augmente progressivement jusqu'à ce que les oscillations sont visibles dans les affichages de position de la particule. Une fois que les oscillations soient respectées, définir les constantes de commande incorporé à 80 % de la valeur causant les oscillations. Valeurs typiques sera d’environ 0,012 pour le « gain intégral « XY et 0,004 pour le Z « gain intégral ».</li>
	<li>Définir les seuils de suivi au « Seuil de la piste » et « Piste Minimum » et commencer l’expérience de suivi en cliquant sur « Recherche » et « Auto Track ». Le seuil pour le suivi de terminaison a la valeur légèrement supérieur à la concentration de fond et le seuil de déclenchement de suivi est environ deux fois supérieur à l’arrière-plan. Ici, le seuil de déclenchement de suivi se situe entre 3 kHz et le seuil pour mettre fin à la trajectoire est de 1,5 kHz.</li>
</ol>

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<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Bien que beaucoup de variétés de particule unique 3D, méthodes de suivi est apparues ces dernières années, robuste suivi en temps réel de diffusion 3D haute vitesse au taux de comptage de photons de faible avec une simple configuration est encore un défi, qui limite son application aux important biologique problèmes. La méthode 3D-DyPLoT décrit dans cette adresses ces défis de plusieurs façons. Tout d’abord, les voies de l’excitation et la détection sont simplifiés grandement par rapport aux autres implémentations rendan...

L’émergence des techniques avancées d’imagerie a ouvert une fenêtre pour visualiser la structure toujours plus détaillée des phénomènes cellulaires, tout le chemin jusqu’au niveau moléculaire. Méthodes telles que la reconstruction optique stochastique microscopie (tempête)1,2,3, localisation photoactivation microscopie (PALM)4,5,6,7 , structurée illumination microscopie (SIM)8,9,10,11et a stimulé des émissions appauvrissement microscopie (STED)12,13, 14 ont largement dépassé la limite de diffraction à livrer des détails sans précédent dans la structure et la fonction des cellules vivantes. Toutefois, complète compréhension de la façon dont ces systèmes comportent nécessite des informations dynamiques ainsi que des informations structurelles. Les méthodes de Super-résolution énumérés ci-dessus impliquent un compromis entre la résolution spatiale et résolution temporelle, limitant la précision temporelle avec laquelle les processus dynamiques peuvent être sondées. Une méthode qui fournit la haute précision spatiale et la résolution temporelle est RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Ici, nous font une distinction entre les traditionnelles 3D-SPT30 et traditionnel de RT-3D-SPT. 3D-SPT nécessite simplement une série chronologique de données d’images en trois dimensions (ce qui peuvent être acquis soit à l’aide d’un microscope confocal ou un microscope à épifluorescence compte tenu de la configuration de droite). Dans traditionnel 3D-SPT, les coordonnées de la particule sont déterminées après la collecte de données en recherchant la particule dans la pile de chaque image et en concaténant les emplacements dans les volumes successifs pour créer une trajectoire. Pour ces méthodes, l’ultime résolution temporelle est déterminée par le taux d’imagerie volumétrique. Pour les microscopes confocaux, c’est facilement sur l’échelle de secondes à quelques dizaines de secondes. Pour les méthodes épifluorescence, dans laquelle le chemin optique est manipulé afin que les informations d’emplacement axial peuvent être extraite, la résolution temporelle est limitée par le temps d’exposition ou l’affichage de caméra. Ces méthodes épifluorescente sont limitées à la plage sur laquelle axiales renseignements peuvent être recueillis, bien que les progrès récents dans la phase de plan de Fourier masques conception et optique adaptative étend ces gammes de 10 microns ou plus31,32 , 33 , 34.
En revanche, le RT-3D-SPT ne dépend pas acquérir une pile d’images 3D et de trouver des particules après coup. Au lieu de cela, localisation en temps réel les informations est extraites par l’intermédiaire de détecteurs monopoint et rétroaction est appliquée à efficacement « verrouiller » la particule du volume focal de l’objectif grâce à l’utilisation d’un stade piézoélectrique highspeed. Cela permet une mesure continue de la position de la particule limitée seulement par le nombre de photons peuvent être collectées. En outre, cette méthode permet interrogatoire spectrale de la particule lorsqu’elle se déplace sur de longues plages. RT-3D-SPT en vigueur oblige de travaux s’apparente à un piège optique sans force pour objets nanométriques, dans lequel la particule est continuellement sondée et mesurée en temps réel sans nécessiter de grandes puissances ou optique. Étant donné que RT-3D-SPT fournit un moyen de l’interrogatoire continu des objets vite diffusif (jusqu'à 20 µm2/s),25,29 en trois dimensions à photon faible nombre taux20,29, 35, elle devrait fournir une fenêtre dans les processus biologiques rapides ou transitoires tels que le transport intracellulaire de marchandises, liaison ligand-récepteur et la dynamique extracellulaire des virions unique. Toutefois, à ce stade, l’application de la RT-3D-SPT a été limitée à la poignée de groupes de travail pour faire progresser cette technologie.
Un des obstacles sont la complexité de la mise en page optique requis par les méthodes de RT-3D-SPT, qui sont variés. Pour la plupart des méthodes, la rétroaction optique est fournie par un stade piézoélectrique. Comme les mouvements petite particule fait à X, Y, ou Z, lectures de détecteurs monopoint sont converties en fonctions de l’erreur et nourris à haute vitesse à un NANOPOSITIONNEUR piézoélectrique, qui en déplace l’échantillon pour contrer efficacement les mouvement de la particule, verrouillant en place par rapport à l’objectif. Pour mesurer les petits mouvements de positions x, Y et Z, soit plusieurs détecteurs (4 ou 5 selon la mise en œuvre)15,18,21 , soit plusieurs spots d’excitation (2-4, la partie inférieure qui peut être appliquée si un amplificateur à verrouillage est utilisé pour extraire des X et position Y en utilisant une rotation laser spot)25,28 s’appliquent. Le chevauchement de ces taches de détection et d’émission multiples compliquent les systèmes à aligner et à entretenir.
Ici, nous présentons une méthode de verrouillage de cible à grande vitesse 3D-SPT avec un design optique simplifié appelé 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utilise un 2D-EOD et un TAG lentille36,37,38 pour déplacer dynamiquement une tache laser focalisé dans le volume focal objective à un rythme élevé (50kHz XY, 70kHz Z). Combinant la position de foyer de laser et de l’heure d’arrivée de photon permet la position 3D de la particule à obtenir rapidement même au taux de comptage de photons de faible. 2D-jeo actionne la mise au point du laser à tour modèle39 avec une taille de carrés de 1 x 1 µm dans le plan X-Y un chevalier et l’objectif de TAG déplace le focus de laser dans le sens axial avec une plage de 2 à 4 µm. La position de la particule 3D est obtenue avec une estimation de position optimisée algorithme29,40 en 3D. Le contrôle du 3D dynamique mouvement laser spot, photon de l’avalanche photodiode (APD), calcul de position de la particule en temps réel, retour de scène piézoélectrique et enregistrement des données sont exécutées sur un field programmable gate array (FPGA).Dans ce protocole, nous expliquent comment construire un microscope 3D-DyPLoT étape par étape, y compris un alignement optique, étalonnage avec particules fixes et enfin libre suivi de particules. Comme une démonstration, 110 perles fluorescentes nm ont été suivis en permanence dans l’eau pour les minutes à la fois.
La méthode décrite ici est un choix idéal pour n’importe quelle application où il est souhaitable de suivre en permanence une sonde fluorescente se déplaçant rapidement à des niveaux faibles de lumière, y compris les virus, les nanoparticules et vésicules comme des endosomes. Contrairement aux méthodes précédentes, il n’y a qu’une seule excitation et la voie de détection unique, ce qui rend simple alignement et entretien. En outre, la zone de détection grande permet ce microscope ramasser facilement diffuser rapidement les particules, tandis que la capacité de suivre les niveaux de signal faible (jusqu'à 10 kHz) rend cette méthode idéale pour les applications de basse lumière29.

<table><tbody><tr><td>Déflecteur électro-optique 2D&nbsp ;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 Alimentation requise</td></tr><tr><td>pour EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Convertit la sortie FPGA en haute tension pour EOD</td></tr><tr><td>TAG&nbsp ; Lentille</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Utilisé pour dévier le laser le long de la direction axiale</td></tr><tr><td>du nanopositionneur piézoélectrique XY</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Utilisé pour déplacer l’échantillon afin de verrouiller la particule dans le volume focal de l’objectif vers l’intérieur&nbsp ;</td></tr><tr><td>Nanoposiitoner piézoélectrique Z</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Utilisé pour déplacer l’objectif afin de suivre la particule diffusante</td></tr><tr><td>Micropositionneur</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Utilisé pour positionner grossièrement l’échantillon et évaluer</td></tr><tr><td>l’objectif Objectif</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>Ouverture numérique élevée requise pour une meilleure sensibilité. 100X, 1,49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS caméra</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Utilisé pour surveiller la position de la particule</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Réduction du nombre d’obscurité bénéfique Réseau</td></tr> de <tr><td>portes programmables sur le terrain</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>National Instruments LabVIEW</td> Laser <td>d’excitation</td><td></td></tr><tr><td>de suivi</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>L1 Lentille</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Sténopé</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polariseur</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Plaque demi-onde</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lentille</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lentille</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>L4 Lentille</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lentille</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroïque Miroir</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640RPC</td><td></td></tr><tr><td>DC Filtre d’émission de fluorescence</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 séparateur de faisceau</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules fluorescentes 190 nm</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules fluorescentes 110 nm</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr> Microscope <tr><td>SM1D12D</td><td></td> <td>Iris</td><td>Thorlabs</td></tr><tr><td></td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour un suivi en temps réel 3d seule particule

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Une seule particule tridimensionnelle en temps réel suivi (RT-3D-SPT) a le potentiel pour faire la lumière sur les processus rapides et 3D dans les systèmes cellulaires. Bien que diverses méthodes de RT-3D-SPT ont été présentés ces dernières années, haute vitesse de suivi 3D diffusant des particules à des taux de comptage de photons de faible reste un défi. En outre, des configurations de RT-3D-SPT sont généralement complexes et difficiles à mettre en œuvre, limitant leur application généralisée aux problèmes biologiques. Ce protocole présente un système de RT-3D-SPT nommé 3D dynamique Photon localisation Tracking (3D-DyPLoT), qui permet de suivre les particules à haute vitesse par diffusion (jusqu'à 20 µm2/s) au taux de comptage de photons de faible (jusqu'à 10 kHz). 3D-DyPLoT emploie un déflecteur d’electro-optiques 2D (2D-EOD) et une lentille de gradient acoustique accordable (TAG) d’entraînement axé sur un seul laser spot dynamiquement en 3D. Combiné avec un algorithme d’estimation de position optimisée, 3D-DyPLoT pouvez verrouiller sur les particules unique avec suivi haute vitesse et la précision de localisation haute. En raison de l’excitation unique et mise en page de chemin d’accès détection simple, 3D-DyPLoT est robuste et facile à mettre en place. Ce protocole décrit comment construire 3D-DyPLoT étape par étape. Tout d’abord, la disposition optique est décrite. Ensuite, le système est calibré et optimisé par une perle fluorescente de 190 nm avec la NANOPOSITIONNEUR piézoélectrique de balayage. Enfin, pour illustrer la 3D en temps réel suivi de capacité, 110 perles fluorescentes nm sont suivis dans l’eau.

Fixe particule balayage (Figure 4) et diffusant librement 110 nm fluorescent suivi (Figure 5) ont été effectuées selon le protocole ci-dessus. La particule de numérisation a été réalisée en déplaçant les photons NANOPOSITIONNEUR et bin piézoélectriques tandis que calculer simultanément de la particule estimé position à chaque point dans l’analyse. L’image de balayage montre un carré de même intensité (Figure ...

Détails de ce protocole la construction et l’exploitation d’un microscope de suivi en temps réel 3D seule particule capable de suivi échelle nanométrique fluorescent sondes à grande vitesse par diffusion et taux de comptage de photons de faible.

Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

L’objectif global de ce protocole est de mettre en œuvre un microscope 3D de suivi de particules uniques en temps réel. Le principal avantage de cette technique est qu’un seul objet diffusant à l’échelle nanométrique peut être surveillé en continu avec une résolution temporelle limitée aux photons. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, telles que le suivi d’un seul virion tout au long du processus d’infection.Préparez l’appareil sur une table optique. Cette configuration est prête pour l’étalonnage. Les composants clés comprennent un laser à semi-conducteurs de 488 nanomètres, deux déflecteurs électro-optiques qui se trouvent le long de la trajectoire du faisceau, une lentille à gradient acoustique accordable et une platine d’échantillonnage avec des micro et nano positionneurs.Ce schéma de configuration fournit des détails supplémentaires. Voici le trajet du faisceau laser vers l’étage d’échantillonnage. Les déflecteurs électro-optiques et la lentille acoustique accordable se trouvent le long de la trajectoire du faisceau.Ces dispositifs pilotent dynamiquement le spot laser au stade de l’échantillon. Les photons de l’échantillo

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Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

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