Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

L’objectif global de ce protocole est de mettre en œuvre un microscope 3D de suivi de particules uniques en temps réel. Le principal avantage de cette technique est qu’un seul objet diffusant à l’échelle nanométrique peut être surveillé en continu avec une résolution temporelle limitée aux photons. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, telles que le suivi d’un seul virion tout au long du processus d’infection.

Préparez l’appareil sur une table optique. Cette configuration est prête pour l’étalonnage. Les composants clés comprennent un laser à semi-conducteurs de 488 nanomètres, deux déflecteurs électro-optiques qui se trouvent le long de la trajectoire du faisceau, une lentille à gradient acoustique accordable et une platine d’échantillonnage avec des micro et nano positionneurs.

Ce schéma de configuration fournit des détails supplémentaires. Voici le trajet du faisceau laser vers l’étage d’échantillonnage. Les déflecteurs électro-optiques et la lentille acoustique accordable se trouvent le long de la trajectoire du faisceau.

Ces dispositifs pilotent dynamiquement le spot laser au stade de l’échantillon. Les photons de l’échantillon sont comptés par une photodiode d’avalanche. Une caméra surveille la position de la particule.

La position de l’échantillon est réglée à l’aide de micro et nano contrôleurs. Un réseau de portes programmables sur le terrain contrôle le spot laser, le calcul de la position des particules en temps réel, la rétroaction de la platine et le comptage des photons. Deux échantillons doivent être préparés.

La première nécessite des billes fluorescentes de 190 nanomètres diluées dans une solution saline tamponnée au phosphate. À l’aide d’une lamelle, préparer un échantillon de particules fixes. Placez 400 microlitres de la solution de billes sur la lamelle.

Maintenant, produisez l’échantillon de particules en mouvement libre. Il nécessite des billes fluorescentes de 110 nanomètres diluées dans de l’eau. Créez un échantillon de particules en mouvement libre en plaçant 400 microlitres de la solution sur une lamelle.

Apportez l’échantillon de particules fixe au microscope pour le montage. L’échantillon se trouve sur le nanopositionneur XY. Allumez le laser, le photodétecteur, les contrôleurs pour les éléments de ligne de faisceau et pour les positionneurs.

Faites fonctionner le positionneur Piezo nano en boucle fermée. Ensuite, retirez le filtre d’émission de fluorescence situé devant le photodétecteur. Ensuite, faites varier la position z de l’échantillon à l’aide du micropositionneur.

Comme la position varie, utilisez le photodétecteur pour surveiller l’intensité de la réflexion du laser. Maximisez l’intensité pour identifier le plan focal de l’objectif. Avec l’échantillon dans le plan focal, remplacez le filtre d’émission de fluorescence.

Maintenant, travaillez avec le logiciel de contrôle de l’ordinateur. Utilisez un logiciel personnalisé pour numériser l’échantillon. Tout d’abord, définissez une grande plage de balayage, la différence entre le début et la fin.

Ici, la plage est de 10 micromètres en Y et de 10 micromètres en X.Définissez également une grande taille de pas dans chaque direction. Ici, 200 nanomètres. Réglez les deux champs Z sur la position précédemment identifiée du plan focal.

Appuyez sur le balayage pour lancer le balayage raster. Démarrez le balayage. Le logiciel pilote les déflecteurs électro-optiques lors d’une visite nocturne, collecte les comptages du photodétecteur, pilote le nanopositionneur et effectue des calculs de position.

Le balayage trouvera une particule identifiable dans le logiciel grâce à une fluorescence plata. Pour chaque site du balayage, le logiciel déterminera également des estimations de la position des particules en X et Y, par rapport au centre du balayage du déflecteur d’objets électroélectriques. Après avoir trouvé la particule, réduisez la plage de balayage autour d’elle à deux micromètres en X et Y.Réduisez également la taille du pas pour les deux à 100 nanomètres.

Ajoutez une plage de balayage dans la direction Z de deux micromètres pour bracketer la mise au point fluorescente. Réglez la taille du pas Z sur 200 nanomètres. Lancez le balayage matriciel 3D pour trouver la mise au point fluorescente.

Les données produites par le balayage montrent le plan focal avant la mise sous tension de la lentille à gradient acoustique réglable. Passez au travail avec le réglage de la lentille acoustique accordable dans son logiciel de contrôle. Tout d’abord, cliquez sur connecter, puis allumez-le.

Allez dans la section de contrôle d’impulsion et de gate, changez le mode de déclenchement de sortie de RVB à multi-plans. Ensuite, remettez-le en RVB pour permettre de changer la phase de sortie. Utilisez les curseurs pour régler la phase de sortie entre zéro degré, 90 degrés et 270 degrés.

Ensuite, allez dans la section de contrôle de fréquence. Là, sélectionnez une fréquence de résonance de 68 500 hertz. Déplacez-vous vers le haut de l’écran et cliquez sur Avancé.

Ensuite, choisissez l’onglet des paramètres. Sur le nouvel écran, recherchez la fréquence maximale de la colonne zéro. Ajustez-le pour modifier la plage de recherche de fréquence.

Cliquez, enregistrez l’étalonnage, puis quittez l’étalonnage. Revenez aux commandes de fréquence et modifiez la fréquence de résonance. Remettez-le immédiatement à 68 500 hertz pour que l’étalonnage prenne effet.

Dans la section de contrôle de l’amplitude, utilisez le curseur pour augmenter lentement l’amplitude à 35 %Après cela, cliquez sur verrouiller la résonance. Lorsque la fréquence est verrouillée, cliquez sur déverrouiller la résonance. Revenez au logiciel de balayage matriciel.

Entrez deux plages de balayage micrométriques centrées sur la particule en X et Y.Utilisez une taille de pas de 100 nanomètres. Centrez la particule dans une plage de quatre micromètres en Z, avec une taille de pas de 200 nanomètres. Dans l’image de balayage qui en résulte, la région d’éclairage représentant la particule est d’environ un micromètre de large.

Sur cette base, ajustez le paramètre d’échelle XY de sorte que les positions estimées en X et Y varient de moins 0,5 à 0,5 micromètre. Après une procédure similaire avec l’échelle Z, réglez le positionneur nano sur la position zéro. Coupez l’alimentation du positionneur nano avant de continuer.

Remplacez l’échantillon de particules fixe par l’échantillon de particules en mouvement libre. Ensuite, assurez-vous que tout l’équipement est allumé. Exécutez le positionneur Piezo nano en boucle ouverte.

Sur l’ordinateur, réglez le logiciel de l’objectif à gradient acoustique accordable comme précédemment. Retirez le filtre d’émission de fluorescence du chemin d’accès au photodétecteur. Trouvez le plan focal en faisant varier la position Z de l’échantillon et en maximisant l’intensité de la réflexion laser, à partir de la lamelle.

Après avoir trouvé le plan focal, augmentez la position de mise au point de 15 micromètres dans la solution. Remplacez le filtre d’émission de fluorescence. Ouvrez le logiciel de suivi personnalisé.

Définissez les paramètres d’estimation de position sur les valeurs trouvées lors de l’optimisation. Maintenant, réglez les constantes de contrôle intégrales, qui dictent la vitesse de réponse du positionneur nano. Commençons par la constante X.

Entrez une valeur faible et augmentez-la lentement. Lorsque les oscillations commencent dans la lecture de la position des particules, notez la valeur de la constante de contrôle. Réduire la constante de contrôle intégral à environ 70 % de sa valeur au début de l’oscillation.

Répétez les étapes avec les constantes de contrôle Y et Z. Réglez le déclencheur pour commencer à suivre le seuil de la piste à trois kilohertz. Réglez le minimum de piste, le déclencheur pour terminer le suivi, à 1,5 kilohertz.

Démarrez l’expérience en cliquant sur Rechercher, puis sur Suivi automatique. Cette vidéo montre le résultat de l’utilisation du microscope de localisation de photons dynamique tridimensionnel pour suivre le mouvement diffusif d’une nanoparticule fluorescente de 110 nanomètres dans l’eau. La position de la particule, mesurée à l’aide de la lecture de position du nanopositionneur, est indiquée sur les axes 3D.

L’encart est la lecture de la caméra scientifique sur la mousse de mer. Il démontre que la particule est maintenue, bloquée dans le volume focal, par le système de suivi. La particule a été suivie et sa position a été enregistrée pendant plus de deux minutes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 50 minutes, si le système est correctement aligné et les paramètres d’étalonnage définis. Après son développement, cette technique aidera les chercheurs dans le domaine de l’administration de médicaments à explorer les voies d’internalisation et de transport du fret cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension du fonctionnement d’un microscope 3D à chasse à particules uniques à temps zéro.