Name: Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Découvrez la visualisation de la formation de biofilms de Candida albicans en temps réel grâce à un dispositif de microfluidique automatisé. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des agents antimicrobiens et de tester des mutants génétiques.

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Nous remercions tous les membres du laboratoire Nobile pour discussions utiles sur des essais de biofilm. Cette étude a été financée par les instituts nationaux d’octroi de la santé (NIH) R21 AI125801 (au juge). D.L.R. était soutenue par une bourse de doctorat de l’University of California Institute pour le Mexique et les États-Unis (UC-MEXUS) et Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

<ol><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Fox, E. P., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+EP+%22Candida+albicans%3A+Symptoms%2C+Causes+and+Treatment+Options%22">Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options</a>. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li>
<li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li>
<li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li>
<li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li>
<li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li>
<li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Baker, K. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/atbench2.htm">At the bench: A laboratory navigator</a>. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile est des fondateurs de BioSynesis, Inc., une société qui développe des inhibiteurs et des diagnostics de c. albicans biofilms.

Le dosage de biofilm microfluidique personnalisable décrit ici permet la visualisation de la formation de biofilm dans en temps réel à un niveau de cellule unique lorsqu’il est exposé à un taux fixe à flux laminaire et une température constante. Il constitue un moyen puissant pour étudier le développement des biofilms dans sauvage et les souches mutantes, et les effets des traitements d’agent antimicrobien sur les biofilms dans des conditions qui simulent les conditions physiologiques observés en milieu clinique. Contrai...

Candida albicans est membre commensaux de la flore humaine, mais c’est aussi un pathogène opportuniste, capable de causer des infections fongiques superficielles et sévère1,2. Un trait majeur de virulence de c. albicans est sa capacité à forme résilient et biofilms résistantes aux médicaments, les communautés de cellules ont adhéré à une surface et enfermé dans une matrice extracellulaire matière1,3. C. albicans biofilms sont très structurés, contenant plusieurs couches de plusieurs types de cellules (tour de bourgeonnement levure-forme des cellules, cellules pseudohyphes ovales et des cellules des hyphes tubulaires)4. C. albicans biofilms développement commence par l’adhérence des cellules de levure-forme ronde à une surface (semis du biofilm), suivie par la prolifération de ces cellules sur la surface, et puis la maturation du biofilm immature structurer dans un complètement formé des biofilms qui sont entouré d’un matériel de matrice extracellulaire4. Les biofilms à maturité est principalement composé de cellules des hyphes allongées qui forment des réseaux denses et d’interconnexion, fournissant la stabilité architecturale au biofilm4. Tout au long du cycle de vie de biofilm, autour de la levure de bière cellules quittent les biofilms à maturité et peuvent voyager dans d’autres régions du corps pour provoquer la diffusion des infections ou semences nouvelles biofilms autres sites4,5. C. albicans peuvent former des biofilms sur les surfaces biotiques, telles que des surfaces muqueuses et tout au long des tissus de l’hôte et sur des surfaces abiotiques, tels que les cathéters, les stimulateurs cardiaques, les prothèses dentaires et les prothèses articulaires. En raison des propriétés récalcitrantes des biofilms, ils sont extrêmement difficiles à éradiquer, et dans de nombreux cas la stratégie du seul traitement efficace est la suppression du dispositif infecté4. Il est donc crucial d’étudier la formation de biofilm dans des conditions similaires à celles observées en milieu clinique.
Il y a plusieurs critiques en vivo modèles animaux utilisés pour l’étude de c. albicans biofilm formation6,7,8; Toutefois, ces études peuvent être coûteux et fastidieux et sont limités par le nombre de souches et des agents antimicrobiens qui peuvent être testés à un moment donné. In vitro biofilm dosages, d’autre part, permettre l’évaluation rapide et à haut débit de composés antifongiques et souches mutantes et sont beaucoup plus rentables et éthiques que tests de biofilm transportés hors des animaux modèles9, 10,11,12,13,14. Nous décrivons ici un essai in vitro avec que nous avons développé et optimisé pour observer la formation de biofilm dans le temps sous flux laminaire en utilisant un microfluidique personnalisable appareil14,15. Le dosage permet la visualisation de chaque étape de la formation de biofilm, y compris l’étape initiale d’adhésion, la prolifération cellulaire, biofilm maturation et dispersion des cellules. L’essai est également utile pour visualiser les modifications de la morphologie cellulaire au cours du développement d’un biofilm.
Plaques de microtitration, qui sont généralement utilisés pour in vitro l’essais de biofilm, tout en haut débit, ne permettent pas pour des conditions d’écoulement contrôlé. Systèmes de piles à flux laminaire traditionnel permettent pour l’évaluation continue de la formation de biofilm dans des conditions d’écoulement contrôlé, mais ceux-ci sont souvent beaucoup de temps pour mettre en place et tendent à avoir limité le débit et contrôle de plage dynamique. Le dispositif microfluidique utilisé ici permet de surmonter ces limitations en combinant les plaques à haut débit (contenant 48 puits) avec une chambre à flux laminaire intégré et est hautement reproductible, polyvalent et personnalisable.
Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisé disponible dans le commerce pour évaluer la formation de biofilm d’une sauvage c. albicans souche, les effets d’un agent antifongique connu sur le développement d’un biofilm et biofilm les défauts de formation dans deux souches mutantes (bcr1Δ/Δ et efg1 Δ/Δ) qui étaient préalablement déclarées avoir biofilm in vitro et in vivo16,17,18. Le protocole décrit peut être utilisé pour tester l’efficacité des agents antimicrobiens en inhibant la formation de biofilm au cours du développement d’un biofilm et d’identifier les gènes nécessaires pour le développement du biofilm normale de criblage des bibliothèques mutants.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Dispositif microfluidique automatisé pour l’analyse de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Plaque 48 puits 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>Plaque microfluidique</td></tr><tr><td>Logiciel de montage</td><td>Fluxion</td><td>Version 7.8.4.0</td><td>Logiciel d’analyse de visualisation</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Yeast Extract</td><td>Critère</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Nutriment Bouillon</td><td>Criterion</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Mannitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Criterion</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation stériles</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri avec couvercle transparent</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Lentille Papier</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque et Cuvette Spectrophotomètre</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de la formation de biofilms candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans est le plus commun champignon pathogène de l’homme, provoquant environ 15 % des cas de septicémie nosocomiales. Un attribut de virulence majeur de c. albicans est sa capacité à forme biofilms, les communautés structurées de cellules attachées aux surfaces biotiques et abiotiques. C. albicans biofilms peuvent se former sur les tissus de l’hôte, telles que les couches muqueuses et sur les dispositifs médicaux, tels que les cathéters, les stimulateurs cardiaques, les prothèses dentaires et prothèses conjointes. Biofilms posent des défis cliniques importants parce qu’ils sont très résistants aux perturbations physiques et chimiques et peuvent agir comme réservoirs de graines disséminées des infections. Divers essais in vitro ont été utilisés pour étudier la formation de biofilm de c. albicans , tels que des essais de plaque de microtitration, poids sec, les analyses de viabilité de cellules et microscopie confocale à balayage de laser. Tous ces tests sont essais de point d’arrêt simple, où la formation de biofilm est évaluée à un moment précis. Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la formation de biofilm dans en temps réel en utilisant un dispositif microfluidique automatisé dans des conditions d’écoulement laminaire. Cette méthode permet l’observation de la formation de biofilm comme le biofilm se développe au fil du temps, en utilisant des conditions personnalisables qui imitent ceux de l’hôte, telles que celles rencontrées dans les cathéters vasculaires. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les défauts de biofilm de mutants génétiques ainsi que les effets inhibiteurs des agents antimicrobiens sur le développement du biofilm en temps réel.

Nous avons effectué le test de biofilm microfluidique décrit ici en utilisant un type sauvage souche de c. albicans dans des conditions de deux milieux (RPMI-1640 et Spider média), la souche sauvage en présence de la drogue connue antifongique amphotéricine B (16 µg/mL) en milieu RPMI, et deux souches mutantes déjà signalé avoir un vice dans la formation de biofilm (bcr1Δ/Δ et efg1 Δ/Δ) dans les milieux de l’araignée.
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Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

L’objectif global de ce protocole est de visualiser la formation du biofilm de Candida albicans en temps réel dans des conditions physiologiques de l’hôte. Cette méthode permet d’observer la formation du biofilm au fur et à mesure de son développement en temps réel et peut être utilisée pour tester l’efficacité d’agents antimicrobiens ou pour évaluer des mutants génétiques. Cette technique peut être utilisée pour cribler l’activité thérapeutique potentielle contre les biofilms à haut débit et leur efficacité peut être mesurée, visualisée et comparée aux traitements actuels.Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour analyser la formation de biofilms dans plusieurs conditions différentes qui intéressent les chercheurs. Bien que cette méthode ait été développée spécifiquement pour étudier la formation du biofilm de Candida albicans, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes formant un biofilm, y compris d’autres espèces fongiques ainsi que des bactéries. Pour commencer, préparez des cultures en colonie unique de différentes souches de C. albicans à partir de cellules plaquées sur de l’extrait de levure, du peptone dextrose ou de la gélose moyenne YPD selon les pratiques microbiologiques standard.Ensuite, allumez le système microfluidique qui comprend le contrôleur, les deux blocs d’alimentation, le microscope, la caméra et l’ordinateur attachés au système. Une fois l’ordinateur chargé, ouvrez le logiciel qui contrôle le système. Localisez le numéro de code-barres de la plaque utilisée et entrez le numéro lorsque le logiciel vous le demande.Ensuite, dans le module de commande, réglez la température du système microfluidique sur 37 degrés Celsius. Ensuite, cliquez sur les puits d’entrée I1, I7, I13 et I19 et faites circuler de l’air stérile à travers les tubes de la plaque d’interface pendant cinq minutes pour éliminer toute condensation. Lorsque toute la condensation s’évapore, placez la plaque microfluidique à 48 puits 0-20 dyne sur la platine du microscope.Pour une expérience de formation de biofilm de 12 heures, commencez par ajouter 600 microlitres de milieu préchauffé dans les puits d’entrée. Abaissez lentement la plaque d’interface nettoyée sur la plaque microfluidique à 48 puits. Faites ensuite glisser légèrement la plaque d’interface vers la gauche jusqu’à ce que les tubes soient positionnés au-dessus des puits d’entrée et de sortie et soient verrouillés en position.Dans la section de contrôle du cisaillement du logiciel, réglez le mode d’écoulement sur constant et réglez le cisaillement maximal sur un dyne par centimètre carré. Cliquez ensuite sur les puits d’entrée avec le média pour commencer le flux de média des puits d’entrée vers les puits de sortie afin d’amorcer le canal. Après cinq minutes d’écoulement, cliquez sur le bouton d’arrêt dans la section de contrôle de la plaque de puits du logiciel.Retirez ensuite la plaque d’interface et observez les puits de la plaque microfluidique. Seule une petite goutte de fluide doit être visible dans les puits de sortie. Pour tester des souches de C. albicans de type sauvage et mutant, ajoutez 50 microlitres de culture cellulaire SC5314 de type sauvage dans un milieu d’araignée à deux puits de sortie, ajoutez le mutant bcr1 dans un milieu d’araignée à deux puits de sortie et ajoutez le mutant EFG1 dans un milieu d’araignée à deux puits de sortie.Replacez la plaque d’interface sur la plaque microfluidique et verrouillez le couvercle en place. De retour dans la section de contrôle du cisaillement du logiciel, réglez le mode d’écoulement sur constant et réglez le cisaillement maximum sur deux dyne par centimètre carré. Cliquez sur les puits de sortie avec les cellules pour commencer l’écoulement du milieu de la sortie aux puits d’entrée pour commencer l’ensemencement de C. albicans.Au bout de trois secondes, cliquez sur le bouton d’arrêt dans la section de contrôle de la plaque de puits pour empêcher les cellules d’entrer dans les puits d’entrée. Laissez les cellules rester immobiles sans flux pendant 10 à 20 minutes dans le canal de visualisation pour une adhésion initiale de la cellule. Dans la fenêtre du module d’imagerie, ouvrez le module d’acquisition multidimensionnelle et cliquez sur l’onglet platine dans le menu de gauche.Dans la section de l’étape, chargez la liste des étapes principales pour la plaque microfluidique dyne 0-20 à 48 puits. Ensuite, ouvrez les modules de réglage de rechargement de l’échantillon et de déplacement de l’étage en position absolue. Dans le module de réglage de la recharge de l’échantillon, appuyez sur le bouton en direct pour voir un aperçu de l’image avec un réticule.À l’aide du joystick, positionnez la plaque de puits de manière à ce que la pointe de la flèche adjacente au canal de visualisation quatre s’aligne avec le réticule du logiciel. Allez ensuite dans le menu Déplacer l’étape vers la position absolue et appuyez sur le bouton de réglage de l’origine. Ensuite, retournez au module de réglage du rechargement de l’échantillon, cliquez sur la section du point de référence initial dans le menu de gauche et chargez le fichier pour la plaque microfluidique dyne 0-20 à 48 puits.Sur la section de la platine du module d’acquisition multidimensionnelle, double-cliquez sur la position de la platine 22.2 pour rapprocher la platine de visualisation du microscope et la mise au point de la caméra du marqueur de flèche en visualisant le canal 22. Ensuite, utilisez le joystick pour positionner la plaque de puits de sorte que la pointe de la flèche adjacente au canal de visualisation 22 s’aligne avec le réticule. Copiez la coordonnée Y du module d’acquisition multidimensionnelle en position Y de.2 dans l’onglet Mettre à jour les points de référence du module de réglage du rechargement des échantillons. Enfin, dans l’onglet de mise à jour des positions d’étape du module de réglage de rechargement d’échantillon, cliquez sur appliquer à la liste d’étapes MDA. Dans la fenêtre du module d’imagerie, utilisez le module d’acquisition multidimensionnelle et cliquez sur l’onglet Enregistrer dans le menu de gauche.Sélectionnez ensuite le nom de fichier de l’expérience et le dossier dans lequel stocker les images acquises sur l’ordinateur. Ensuite, cliquez sur l’onglet timelapse et configurez-le pour acquérir 145 images au total cinq minutes entre chaque image. Ensuite, dans l’onglet Longueurs d’onde, réglez le nombre de longueurs d’onde sur une et capturez à 50 % en fond clair et à 50 % avec un temps d’exposition de 12 à 20 millisecondes.Réglez le gain sur 0,6 et le numériseur sur 20 milliHertz. Après avoir défini le focus comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement, sélectionnez acquérir pour commencer à capturer des images de pré-vidage des cellules collées pour toutes les sous-étapes. Dans la section de contrôle du cisaillement, réglez le mode d’écoulement sur constant et le cisaillement maximal sur un dyne par centimètre carré.Cliquez ensuite sur les puits d’entrée pour commencer l’écoulement du fluide des puits d’entrée vers les puits de sortie afin de supprimer toutes les cellules non adhérentes. Après cinq minutes, cliquez sur le bouton d’arrêt dans la section de contrôle de la plaque de puits. Permettez d’acquérir une deuxième série d’images, puis dans la section de contrôle du cisaillement, ajustez le débit de cisaillement maximal à 0,5 dyne par centimètre carré et confirmez le changement.Dans la fenêtre du module d’imagerie, sélectionnez l’onglet Outils d’analyse et cliquez sur Examiner les données multidimensionnelles dans le menu déroulant. Cliquez ensuite sur sélectionner le fichier de base. Cela ouvrira la fenêtre des utilitaires d’ensemble de données multidimensionnels.Ensuite, cliquez sur le bouton de sélection du répertoire et choisissez le dossier qui a été utilisé pour enregistrer l’expérience. Dans la liste des jeux de données, sélectionnez le journal du fichier d’expérience. Une fois le journal chargé, cliquez sur le bouton d’affichage.Sélectionnez la longueur d’onde en cliquant sur les options dans le menu des longueurs d’onde de gauche et choisissez la position de la scène à afficher dans un menu déroulant. Choisissez l’image à charger à partir des numéros situés en haut du module en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le numéro de l’image. Sélectionnez ensuite toutes les images afin de réaliser une vidéo timelapse.Les images sélectionnées s’ouvriront sous forme de vidéo dans une nouvelle fenêtre. Cliquez sur l’onglet Fichier dans la fenêtre du module d’imagerie et choisissez Enregistrer sous dans le menu déroulant. Enregistrez la vidéo résultante dans le format de fichier par défaut.Enfin, ouvrez et chargez le fichier vidéo enregistré dans l’image J.In l’image J, cliquez sur l’onglet Fichier, puis cliquez sur Enregistrer sous. Choisissez AVI dans le menu déroulant et convertissez le fichier en fichier AVI à l’aide de la conversion JPEG réglée sur 10 images par seconde. Dans des conditions de type sauvage dans les milieux RPMI 1640, plusieurs cellules ont fortement adhéré au canal.Ils forment des hyphes et un biofilm épais peut être observé avec des hyphes et des cellules de levure intercalaires. Vers la fin de l’expérience microfluidique, le biofilm de type sauvage remplit complètement ce canal d’observation. La présence d’amphotéricine B, cependant, a un effet prononcé sur la réduction de la formation de biofilm.Plus précisément, l’adhérence des cellules est diminuée et plusieurs cellules peuvent être vues s’écouler avec le flux de cisaillement du média. Les cellules de contrôle de type sauvage, cette fois cultivées dans un milieu d’araignée, ont formé un biofilm similaire à celui qui vient d’être montré en croissance dans RPMI. Deux mutants défectueux en biofilm ont également été cultivés dans ce milieu.Les deux souches présentent une formation de biofilm sévèrement réduite par rapport au témoin. Dans cette population cellulaire, les cellules adhérentes ne forment pas d’hyphes et le biofilm qui en résulte est gravement défectueux. Cette autre souche est à la fois défectueuse dans la formation du biofilm et dans sa capacité à adhérer au canal.Une fois maîtrisée, cette expérience peut être mise en place en moins d’une heure. En utilisant cette méthode, on peut en apprendre beaucoup sur un certain nombre d’aspects différents de la formation du biofilm, notamment l’adhésion cellulaire initiale, la maturation du biofilm et la dispersion cellulaire. Ce protocole est hautement personnalisable et polyvalent.Il peut être ajusté pour évaluer différentes espèces microbiennes à travers les règnes. Les débits, les températures, les temps d’incubation et les milieux peuvent également être utilisés pour étudier les biofilms d’espèces mixtes. Nous recommandons vivement ce test de biofilm microfluidique en tant qu’essai in vitro à utiliser avant les tests in vivo sur les animaux.D’après notre expérience, les résultats de ce test sont très bien corrélés avec les tests de biofilm in vivo existants.

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Candida albicans Formation d’un biofilm dans un modèle murin in vivo

Cette vidéo décrit une méthode de culture et d’analyse qualitative des biofilms bactériens sur les hyphes fongiques à l’aide de la microscopie. Les biofilms bactériens se forment fréquemment sur les surfaces fongiques et impliquent de nombreux processus d’interaction bactério-fongique, tels que la coopération métabolique, la compétition ou la prédation.

Procédé de préparation d’échantillons pour visualiser des bactéries formant un biofilm sur des hyphes fongiques

Des protocoles pour l’étude de la formation de biofilms dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux sont discutés. Le dispositif microfluidique se compose d’un réseau de micro-piliers et la formation de biofilms par Pseudomonas fluorescens dans ce dispositif est étudiée.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Nous présentons une procédure expérimentale de développement du biofilm de Candida albicans dans un modèle sous-cutané de souris. Les biofilms fongiques ont été quantifiés en déterminant le nombre d’unités formant des colonies et par une imagerie de bioluminescence non invasive, où la quantité de lumière produite correspond au nombre de cellules viables.

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Nous décrivons le montage, exploitation, et le nettoyage d’un appareil à débit conçu pour la formation de biofilms fongiques d’image en temps réel sous flux. Nous également fournissons et discuter des algorithmes quantitatifs pour être utilisé sur les images acquises.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

Pour visualiser et quantifier les caractéristiques internes des biofilms Candida albicans, nous préparons des spécimens intacts fixes qui sont clarifiés par l’appariement des indices réfractifs. Ensuite, la microscopie de section optique peut être utilisée pour obtenir des données d’image tridimensionnelles bien que toute l’épaisseur du biofilm.

Clarification et imagerie Candida albicans Biofilms

Découvrez la visualisation de la formation de biofilms de Candida albicans en temps réel grâce à un dispositif de microfluidique automatisé. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des agents antimicrobiens et de tester des mutants génétiques.

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

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