Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

L’objectif global de ce protocole est de visualiser la formation du biofilm de Candida albicans en temps réel dans des conditions physiologiques de l’hôte. Cette méthode permet d’observer la formation du biofilm au fur et à mesure de son développement en temps réel et peut être utilisée pour tester l’efficacité d’agents antimicrobiens ou pour évaluer des mutants génétiques. Cette technique peut être utilisée pour cribler l’activité thérapeutique potentielle contre les biofilms à haut débit et leur efficacité peut être mesurée, visualisée et comparée aux traitements actuels.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour analyser la formation de biofilms dans plusieurs conditions différentes qui intéressent les chercheurs. Bien que cette méthode ait été développée spécifiquement pour étudier la formation du biofilm de Candida albicans, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes formant un biofilm, y compris d’autres espèces fongiques ainsi que des bactéries. Pour commencer, préparez des cultures en colonie unique de différentes souches de C. albicans à partir de cellules plaquées sur de l’extrait de levure, du peptone dextrose ou de la gélose moyenne YPD selon les pratiques microbiologiques standard.

Ensuite, allumez le système microfluidique qui comprend le contrôleur, les deux blocs d’alimentation, le microscope, la caméra et l’ordinateur attachés au système. Une fois l’ordinateur chargé, ouvrez le logiciel qui contrôle le système. Localisez le numéro de code-barres de la plaque utilisée et entrez le numéro lorsque le logiciel vous le demande.

Ensuite, dans le module de commande, réglez la température du système microfluidique sur 37 degrés Celsius. Ensuite, cliquez sur les puits d’entrée I1, I7, I13 et I19 et faites circuler de l’air stérile à travers les tubes de la plaque d’interface pendant cinq minutes pour éliminer toute condensation. Lorsque toute la condensation s’évapore, placez la plaque microfluidique à 48 puits 0-20 dyne sur la platine du microscope.

Pour une expérience de formation de biofilm de 12 heures, commencez par ajouter 600 microlitres de milieu préchauffé dans les puits d’entrée. Abaissez lentement la plaque d’interface nettoyée sur la plaque microfluidique à 48 puits. Faites ensuite glisser légèrement la plaque d’interface vers la gauche jusqu’à ce que les tubes soient positionnés au-dessus des puits d’entrée et de sortie et soient verrouillés en position.

Dans la section de contrôle du cisaillement du logiciel, réglez le mode d’écoulement sur constant et réglez le cisaillement maximal sur un dyne par centimètre carré. Cliquez ensuite sur les puits d’entrée avec le média pour commencer le flux de média des puits d’entrée vers les puits de sortie afin d’amorcer le canal. Après cinq minutes d’écoulement, cliquez sur le bouton d’arrêt dans la section de contrôle de la plaque de puits du logiciel.

Retirez ensuite la plaque d’interface et observez les puits de la plaque microfluidique. Seule une petite goutte de fluide doit être visible dans les puits de sortie. Pour tester des souches de C. albicans de type sauvage et mutant, ajoutez 50 microlitres de culture cellulaire SC5314 de type sauvage dans un milieu d’araignée à deux puits de sortie, ajoutez le mutant bcr1 dans un milieu d’araignée à deux puits de sortie et ajoutez le mutant EFG1 dans un milieu d’araignée à deux puits de sortie.

Replacez la plaque d’interface sur la plaque microfluidique et verrouillez le couvercle en place. De retour dans la section de contrôle du cisaillement du logiciel, réglez le mode d’écoulement sur constant et réglez le cisaillement maximum sur deux dyne par centimètre carré. Cliquez sur les puits de sortie avec les cellules pour commencer l’écoulement du milieu de la sortie aux puits d’entrée pour commencer l’ensemencement de C. albicans.

Au bout de trois secondes, cliquez sur le bouton d’arrêt dans la section de contrôle de la plaque de puits pour empêcher les cellules d’entrer dans les puits d’entrée. Laissez les cellules rester immobiles sans flux pendant 10 à 20 minutes dans le canal de visualisation pour une adhésion initiale de la cellule. Dans la fenêtre du module d’imagerie, ouvrez le module d’acquisition multidimensionnelle et cliquez sur l’onglet platine dans le menu de gauche.

Dans la section de l’étape, chargez la liste des étapes principales pour la plaque microfluidique dyne 0-20 à 48 puits. Ensuite, ouvrez les modules de réglage de rechargement de l’échantillon et de déplacement de l’étage en position absolue. Dans le module de réglage de la recharge de l’échantillon, appuyez sur le bouton en direct pour voir un aperçu de l’image avec un réticule.

À l’aide du joystick, positionnez la plaque de puits de manière à ce que la pointe de la flèche adjacente au canal de visualisation quatre s’aligne avec le réticule du logiciel. Allez ensuite dans le menu Déplacer l’étape vers la position absolue et appuyez sur le bouton de réglage de l’origine. Ensuite, retournez au module de réglage du rechargement de l’échantillon, cliquez sur la section du point de référence initial dans le menu de gauche et chargez le fichier pour la plaque microfluidique dyne 0-20 à 48 puits.

Sur la section de la platine du module d’acquisition multidimensionnelle, double-cliquez sur la position de la platine 22.2 pour rapprocher la platine de visualisation du microscope et la mise au point de la caméra du marqueur de flèche en visualisant le canal 22. Ensuite, utilisez le joystick pour positionner la plaque de puits de sorte que la pointe de la flèche adjacente au canal de visualisation 22 s’aligne avec le réticule. Copiez la coordonnée Y du module d’acquisition multidimensionnelle en position Y de.

2 dans l’onglet Mettre à jour les points de référence du module de réglage du rechargement des échantillons. Enfin, dans l’onglet de mise à jour des positions d’étape du module de réglage de rechargement d’échantillon, cliquez sur appliquer à la liste d’étapes MDA. Dans la fenêtre du module d’imagerie, utilisez le module d’acquisition multidimensionnelle et cliquez sur l’onglet Enregistrer dans le menu de gauche.

Sélectionnez ensuite le nom de fichier de l’expérience et le dossier dans lequel stocker les images acquises sur l’ordinateur. Ensuite, cliquez sur l’onglet timelapse et configurez-le pour acquérir 145 images au total cinq minutes entre chaque image. Ensuite, dans l’onglet Longueurs d’onde, réglez le nombre de longueurs d’onde sur une et capturez à 50 % en fond clair et à 50 % avec un temps d’exposition de 12 à 20 millisecondes.

Réglez le gain sur 0,6 et le numériseur sur 20 milliHertz. Après avoir défini le focus comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement, sélectionnez acquérir pour commencer à capturer des images de pré-vidage des cellules collées pour toutes les sous-étapes. Dans la section de contrôle du cisaillement, réglez le mode d’écoulement sur constant et le cisaillement maximal sur un dyne par centimètre carré.

Cliquez ensuite sur les puits d’entrée pour commencer l’écoulement du fluide des puits d’entrée vers les puits de sortie afin de supprimer toutes les cellules non adhérentes. Après cinq minutes, cliquez sur le bouton d’arrêt dans la section de contrôle de la plaque de puits. Permettez d’acquérir une deuxième série d’images, puis dans la section de contrôle du cisaillement, ajustez le débit de cisaillement maximal à 0,5 dyne par centimètre carré et confirmez le changement.

Dans la fenêtre du module d’imagerie, sélectionnez l’onglet Outils d’analyse et cliquez sur Examiner les données multidimensionnelles dans le menu déroulant. Cliquez ensuite sur sélectionner le fichier de base. Cela ouvrira la fenêtre des utilitaires d’ensemble de données multidimensionnels.

Ensuite, cliquez sur le bouton de sélection du répertoire et choisissez le dossier qui a été utilisé pour enregistrer l’expérience. Dans la liste des jeux de données, sélectionnez le journal du fichier d’expérience. Une fois le journal chargé, cliquez sur le bouton d’affichage.

Sélectionnez la longueur d’onde en cliquant sur les options dans le menu des longueurs d’onde de gauche et choisissez la position de la scène à afficher dans un menu déroulant. Choisissez l’image à charger à partir des numéros situés en haut du module en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le numéro de l’image. Sélectionnez ensuite toutes les images afin de réaliser une vidéo timelapse.

Les images sélectionnées s’ouvriront sous forme de vidéo dans une nouvelle fenêtre. Cliquez sur l’onglet Fichier dans la fenêtre du module d’imagerie et choisissez Enregistrer sous dans le menu déroulant. Enregistrez la vidéo résultante dans le format de fichier par défaut.

Enfin, ouvrez et chargez le fichier vidéo enregistré dans l’image J.In l’image J, cliquez sur l’onglet Fichier, puis cliquez sur Enregistrer sous. Choisissez AVI dans le menu déroulant et convertissez le fichier en fichier AVI à l’aide de la conversion JPEG réglée sur 10 images par seconde. Dans des conditions de type sauvage dans les milieux RPMI 1640, plusieurs cellules ont fortement adhéré au canal.

Ils forment des hyphes et un biofilm épais peut être observé avec des hyphes et des cellules de levure intercalaires. Vers la fin de l’expérience microfluidique, le biofilm de type sauvage remplit complètement ce canal d’observation. La présence d’amphotéricine B, cependant, a un effet prononcé sur la réduction de la formation de biofilm.

Plus précisément, l’adhérence des cellules est diminuée et plusieurs cellules peuvent être vues s’écouler avec le flux de cisaillement du média. Les cellules de contrôle de type sauvage, cette fois cultivées dans un milieu d’araignée, ont formé un biofilm similaire à celui qui vient d’être montré en croissance dans RPMI. Deux mutants défectueux en biofilm ont également été cultivés dans ce milieu.

Les deux souches présentent une formation de biofilm sévèrement réduite par rapport au témoin. Dans cette population cellulaire, les cellules adhérentes ne forment pas d’hyphes et le biofilm qui en résulte est gravement défectueux. Cette autre souche est à la fois défectueuse dans la formation du biofilm et dans sa capacité à adhérer au canal.

Une fois maîtrisée, cette expérience peut être mise en place en moins d’une heure. En utilisant cette méthode, on peut en apprendre beaucoup sur un certain nombre d’aspects différents de la formation du biofilm, notamment l’adhésion cellulaire initiale, la maturation du biofilm et la dispersion cellulaire. Ce protocole est hautement personnalisable et polyvalent.

Il peut être ajusté pour évaluer différentes espèces microbiennes à travers les règnes. Les débits, les températures, les temps d’incubation et les milieux peuvent également être utilisés pour étudier les biofilms d’espèces mixtes. Nous recommandons vivement ce test de biofilm microfluidique en tant qu’essai in vitro à utiliser avant les tests in vivo sur les animaux.

D’après notre expérience, les résultats de ce test sont très bien corrélés avec les tests de biofilm in vivo existants.