Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

L’objectif global de ce dispositif expérimental est de délimiter les principales couches de régulation de l’ARN et de l’ADN afin de découvrir les principaux mécanismes moléculaires qui se produisent en réponse à un stimulus ou à un traitement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans de nombreux domaines biologiques différents, tels que les réponses immunitaires en général, mais aussi les réponses moléculaires au traitement médicamenteux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous permet d’afficher simultanément plusieurs couches de régulation des gènes au fil du temps.

Par conséquent, il est important d’utiliser le même pool de cellules pour chaque méthode. D’une manière générale, ces trois protocoles impliquent d’abord de manipuler des cellules d’intérêt à différents points temporels. Après chaque manipulation, les cellules sont regroupées et divisées en trois groupes, un pour chaque test.

Cette section de la vidéo décrit l’étiquetage et la purification des transcrits les plus récemment produits à l’aide du marquage 4sU. Chaque protocole produit finalement des échantillons prêts pour le séquençage. Tout d’abord, recherchez la concentration requise de 4sU et le temps d’incubation nécessaire pour la lignée cellulaire d’intérêt.

Par exemple, 200 micromolaires 4sU sont utilisés sur les lymphocytes T pendant une heure. Séparez le pool de cellules après le traitement dans une boîte distincte pour chaque méthode et point temporel. Ensuite, décongelez complètement le nombre requis d’aliquotes 4sU, ajoutez le 4sU directement dans le milieu cellulaire et incubez les cultures comme indiqué.

Ensuite, collectez les cellules marquées au 4sU dans des tubes en polypropylène. Ensuite, centrifugez les cellules. Remettez la pastille en suspension dans TRIzol à environ trois millions de cellules par millilitre et incubez les cellules dans TRIzol à température ambiante pendant cinq minutes.

Préparez maintenant 30 à 80 microgrammes d’ARN, ou plus, en utilisant la méthode de Radle et compagnie. Ensuite, mélangez la réaction de biotinylation spécifique du thiol dans cet ordre. Commencez par de l’eau sans nucléases, puis un tampon 10 fois, puis de l’ARN et enfin de la biotine-HPDP.

Ensuite, mélangez avec le pipetage et incuber. Procédez à l’étape de nettoyage pour produire des échantillons d’ARN biotinylé nouvellement transcrit mélangé à de l’ARN préexistant non marqué. Ensuite, chauffez les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, placez-les immédiatement sur de la glace. Une fois que chaque échantillon a refroidi, ajoutez 100 microlitres de billes de streptavidine et incubez-les à température ambiante avec rotation pendant 15 minutes. Maintenant, isolez les billes décorées d’ARN nouvellement transcrit à l’aide d’une colonne magnétique, puis éluez l’ARN dans 11 microlitres d’eau sans nucléase pour la séquence.

Cette section décrit comment isoler les ARN qui sont activement traduits. Le séquençage de ces transcrits étudie le translatosome dynamique. Couplé aux données de séquençage de l’ARN, ce test permet de calculer le renouvellement de l’ARN et les taux de traduction.

Commencez par ajouter du cycloheximide à la suspension et mélangez-le à l’aide d’inversions. Après une minute à température ambiante, centrifugez les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec au moins 10 millilitres de PBS complété par du cycloheximide. Ensuite, aspirez le milieu et remplacez-le par 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire de mammifère pour 10 millions de cellules.

Triturez le mélange pour lyser les cellules à l’aide d’une aiguille de calibre 20 à 25. Ensuite, transférez le lysat cellulaire dans un tube pré-refroidi de 1,50 millilitre et incubez le lysat sur de la glace pendant 10 minutes avec des inversions périodiques. Après 10 minutes, centrifugez le lysat et transférez le surnageant dans un tube froid de 1,5 millilitre.

Ensuite, préparez une dilution de 1 à 10 du lysat dans de l’eau sans nucléase et mesurez l’absorbance à 260 nanomètres. Ensuite, créez des aliquotes de 200 microlitres de lysat non dilué et traitez chacune avec 7,5 unités de nucléase pour chaque unité d’absorbance. Laissez la nucléase réagir pendant 45 minutes, puis terminez la réaction en utilisant 15 microlitres d’inhibiteur de RNase, ou stockez-la à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, purifiez l’ARN RPF à l’aide d’un kit commercial, puis procédez à une déplétion de l’ARNr, également à l’aide d’un kit. Ensuite, effectuez une purification PAGE sur 500 nanogrammes d’ARN RPF isolé. Après avoir préparé les échantillons à charger dans le gel, dénaturez-les, ce dernier et les témoins, avec une incubation de cinq minutes à 95 degrés Celsius.

Ensuite, analysez les échantillons à 180 volts pendant environ 75 minutes et évaluez les résultats. Pour le prélèvement de tranches de gel, percez des trous au fond d’un tube de 0,5 millilitre à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 20. Ensuite, excise les tranches de gel correspondant à la région nucléotidique de base 28 à 30 et transférez-les dans les tubes préparés de 0,5 millilitre.

Incluez un échantillon du témoin ARN et un échantillon du témoin négatif pour vérifier la contamination. Ensuite, chargez les petits tubes d’échantillon bouchés dans des tubes de microcentrifugation plus grands. Ensuite, centrifugez les assemblages pour déchiqueter le gel et transférez l’échantillon dans le tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez de l’eau, de l’acétate d’ammonium et du SDS dans les tubes d’échantillon pour éluer l’ARN dans une réaction nocturne à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez un kit commercial pour fabriquer une banque d’ADNc à partir du petit ARN et procédez au séquençage de la banque d’ADNc. Le ChIP-seq est utilisé pour cartographier la liaison d’un facteur de transcription d’intérêt dans l’ensemble d’un génome.

Combiné aux données du profilage des ribosomes et de l’étude de tous les nouveaux transcrits, ChIP-seq révèle l’impact réel de la liaison des facteurs de transcription. Pour commencer, réticulez les échantillons cellulaires à l’aide de formaldéhyde jusqu’à une concentration finale de 1 %Après 10 minutes à température ambiante avec un léger balancement, arrêtez la réaction en augmentant la concentration de glycine à 0,125 molaire. Ensuite, collectez les cellules et lavez-les trois fois avec du PBS glacé, puis congelez la pastille de cellule à moins 80 degrés Celsius.

Plus tard, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de lyse cellulaire glacé avec des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés, et incubez les cellules sur de la glace pendant 10 minutes. Après 10 minutes, faites tourner les cellules, aspirez le surnageant et répétez l’ajout et l’incubation du tampon de lyse. Ensuite, utilisez la sonication pour générer une chromatine cisaillée entre 200 et 1 000 paires de bases.

Ensuite, couplez la chromatine à des billes magnétiques enrobées d’anticorps et éluez les complexes protéine-ADN dans 50 microlitres de tampon d’élution. Ensuite, ajoutez les cinq microlitres de RNase à 40 % et le tampon d’élution, et incubez l’échantillon pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez une unité de protéinase K et 20 microgrammes de glycogène à l’échantillon, et incubez-le pendant deux heures.

Ensuite, déplacez l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant la nuit pour inverser la réticulation. Le lendemain, placez l’échantillon contre l’aimant pendant au moins 30 secondes, puis collectez le surnageant, qui contient l’ADN d’intérêt. Ensuite, purifiez l’ADN, utilisez la PCR quantitative pour la vérification et séquencez l’ADN.

Le marquage 4sU peut stresser les cellules et conduire à l’apoptose. La coloration à l’annexine V et au 7-AAD a été utilisée pour identifier les cellules apoptotiques et mortes. Après avoir marqué les cellules Th1 avec du 4sU à l’aide de traitements de 30 ou 60 minutes, les cellules ne sont pas mortes ni soumises à l’apoptose.

L’intégrité de l’ARN a toujours été vérifiée avant le séquençage à l’aide d’un test standard, car cela est d’une grande importance lors du traitement de l’ARN. Les banques amplifiées avaient une gamme saine de nucléotides. Les dimères d’adaptateur excessifs ont nécessité une purification supplémentaire par PAGE.

Trop de modèle ou trop de cycles entraîne des nucléotides lourds, des produits enduits et des produits dimères adaptateurs Le cisaillement de la chromatine s’est avéré plus efficace lorsque la fraction principale de la chromatine cisaillée était d’environ 1 000 paires de bases ou légèrement moins. La PCR quantitative a été utilisée pour tester l’applicabilité de l’anticorps au séquençage par immunoprécipitation de la chromatine. Les amorces de contrôle négatif sont destinées aux gènes non exprimés dans les cellules d’intérêt.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de faire un plan détaillé de la configuration expérimentale, y compris un calendrier pour savoir quand ajouter 4sU et quand récolter les cellules pour chaque méthode. Vérifiez toujours à l’avance les conditions optimales de marquage du 4sU en testant à l’avance l’impact du 4sU sur la viabilité cellulaire et la réponse au stress. En résumé, cette approche nous permet de visualiser tous les événements de régulation des gènes qui peuvent se produire au cours d’un processus d’activation cellulaire.

Cette méthode pourrait également être utilisée pour les cellules immunitaires primaires et leur réponse à un stimuli ou à un médicament.