La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases cancéreuses sur le rôle de la colonisation pulmonaire dans la réalisation des métastases cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est que les cellules cancéreuses extravasées précoces peuvent être visualisées dans les poumons pendant les métastases cancéreuses. Cheng-Han Yang, un étudiant en doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Lorsque la culture de cellules tumorales a atteint 70 à 80 % de confluence, lavez la culture deux fois dans deux millilitres de PBS stérile par lavage, et ajoutez un millilitre de 0,5 % de trypsine-EDTA dans la boîte de culture. Retirez immédiatement 800 microlitres de surnageant et placez la boîte de culture à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes jusqu’à ce que la majorité des cellules se soient détachées de la plaque. Ajoutez un millilitre de milieu frais, complété par 10 % de FBS pour arrêter la réaction et utilisez une pipette de 1000 microlitres pour mélanger vigoureusement la solution cellulaire.

Transférez la suspension unicellulaire résultante dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre et collectez les cellules par centrifugation. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille de cellules tumorales dans 1,5 millilitre de milieu complété par 20 % de FBS, et faites pivoter les cellules pendant deux heures, à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, compter les cellules viables par exclusion au bleu de trypan et les recueillir par centrifugation.

Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS stérile pour une deuxième centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de PBS complétés par 10 % de FBS et 20 micro millilitres de CFSE. Après dix minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité, centrifugez les cellules et remettez en suspension la pastille dans quatre millilitres de milieu complété par un pour cent de FBS pour une autre centrifugation. Après le dernier lavage, remettez les cellules en suspension à cinq fois dix à la sixième cellules tumorales par millilitre de milieu frais sans concentration de FBS, et placez les cellules sur de la glace.

Ensuite, réchauffez la queue d’une souris mâle C570 Black Six âgée de quatre à six semaines pendant cinq à dix minutes pour dilater les veines de la queue et utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26 et demi pour bien mélanger les cellules jusqu’à ce qu’une suspension de cellule unique soit obtenue. Chargez soigneusement la seringue avec 200 microlitres de cellules et placez la souris dans une contention. Injectez ensuite tout le volume de cellules dans la lumière d’une veine de queue dilatée.

Au moment post-injection approprié, faites une incision longitudinale de la peau et du tissu sous-cutané de l’abdomen à la poitrine et ouvrez la cavité pleurale pour exposer le cœur et les poumons. À l’aide de sutures chirurgicales stériles, ligaturez les veines caves supérieure et inférieure pour empêcher le reflux de la solution de profusion et utilisez des ciseaux pour faire une fissure de deux à quatre millimètres dans le ventricule gauche afin de faciliter le drainage du perfusat des poumons. Ensuite, utilisez une seringue de trois millilitres pour injecter du PBS dans le ventricule droit et utilisez une aspiration continue pour retirer la solution drainée jusqu’à ce que les poumons passent d’une couleur rougeâtre à complètement pâle.

Prenez soin de bien fixer la veine cave supérieure et inférieure pour une perfusion pulmonaire réussie. Après avoir prélevé les poumons, placez les lobes dans un support pulmonaire sur mesure dans un plat de six centimètres et fixez les poumons sur la texture réticulée du support. Couvrez et humidifiez les lobes avec du PBS et placez la boîte de culture sur la platine d’imagerie d’un microscope confocal.

Sélectionnez l’objectif 5x et tournez la roue à filtres sur NIBA. À l’aide d’un laser de 488 nanomètres, excitez le CFSE pour permettre une visualisation claire des cellules tumorales marquées en bleu fluorescent dans les lobes pulmonaires. Tournez la roue à filtres sur R690 pour numériser avec une vitesse de balayage de deux microsecondes par pixel et optimiser le gain de tension élevé et les niveaux de décalage.

Capturez ensuite cinq images fluorescentes de 12 x cinq 12 pixels à l’aide d’une vitesse de balayage de 10 microsecondes par pixel. En utilisant la méthode de coloration, comme nous venons de le démontrer, les cellules tumorales sont efficacement marquées avec CFSE de manière dose-dépendante. Avec l’intensité de fluorescence du marquage, atteignant presque un plateau en six fois 10 à la cinquième cellules de carcinome pulmonaire de Lewis par millilitre à la concentration de 20 micromolaires.

La perfusion pulmonaire avant la récolte, comme nous venons de le démontrer, débarrasse le système vasculaire pulmonaire des cellules tumorales circulantes non spécifiquement hachées avant l’analyse d’imagerie. La microscopie confocale à fluorescence révèle la présence des cellules tumorales colonisatrices marquées au CFSE dans les lobes pulmonaires récoltés et perfusés. L’utilisation d’un logiciel d’analyse d’images approprié pour convertir les images fluorescentes en noir et blanc facilite la quantification de la colonisation pulmonaire.

L’administration intraveineuse de cellules de carcinome pulmonaire de Lewis exprimant la fibronectine ou la fibronectine brouillée exprimant la fibronectine démontre un nombre significativement plus faible de cellules exprimant la fibronectine dans le tissu pulmonaire prélevé 38 et 45 heures après l’injection, soulignant le rôle de la fibronectine dans la colonisation du lobe pulmonaire et le développement tumeur. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de perfuser soigneusement les poumons afin que les cellules non attachées puissent être emportées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des métastases cancéreuses pour explorer la colonisation pulmonaire par des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris à zéro gramme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer par fluorescence les suspensions de cellules tumorales, d’inoculer par voie intraveineuse les cellules tumorales perfuser les poumons de souris et d’utiliser la microscopie confocale à fluorescence pour imager les cellules tumorales métastasées.