Name: In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Apprenez à surveiller l'expression des gènes horloge circadienne en temps réel dans le noyau suprachiasmatique de souris librement mobiles. Cette méthode par fluorescence fonctionne en conditions clair-obscur et obscurité totale.

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Nous remercions les membres du laboratoire de Zhang pour prévoyant la fourniture d’assistance technique de stimuler les discussions et les membres du laboratoire de Zhan. Cette recherche a été financée par des subventions 31500860 (de C.Z.) de la FNSC, 2012CB837700 (de C.E.A et C.Z.) du programme 973 de le M.O.S.T. de Chine et par le financement de l’administration municipale de Pékin. C.E.A a été appuyée par les chinois « Programme de recrutement d’Experts de jeunesse Global ».

Toutes les procédures dans le présent protocole ont été effectués avec l’approbation de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Institut National des Sciences biologiques, Pékin, conformément à la réglementation gouvernementale de la Chine.
1. construction du Reporter Cry1 Fluorescence
Remarque : Des études antérieures de rythme circadiens en utilisant le système de bioluminescence2,12,13 fusible un promoteur circadiens avec une déstabilisation luciférase (dLuc) pour induire l’expression rythmique dLuc . Pour développer un reporter de fluorescence, déstabilisé luciférase a été remplacée par la protéine déstabilisé par fluorescence (dVenus) pour induire l’expression rythmique dVenus . La génération de la P (Cry1)-d reporter deVénus est décrit ci-dessous, la construction qui est actuellement soumise au Addgene et sera bientôt disponible pour utilisation académique.
<ol><li>Amplifier le promoteur de Cry1 souris fonctionnelle (+328 pour la région de la-1208 PB du gène Cry1 , site de début de transcription désigné comme '' -1 ''). Utilisation de l’enzyme PCR (KOD Plus Neo), amorces F1 et R1 (voir tableau 2), du génome de la souris comme un modèle et PCR du fabricant Protocole afin d’amplifier le fragment d’ADN Cry1 promoteur.</li>
	<li>Amplifier l’intron 336 du gène Cry1 , ce qui est important pour la fonction horloge circadienne de Cry114. Utiliser l’enzyme PCR, les amorces F2 et R2, le génome de la souris comme un modèle et protocole PCR du fabricant afin d’amplifier le fragment d’ADN intron 336.</li>
	<li>Amplifier la Vénus. Utiliser l’enzyme PCR, les amorces F3 et R3, plasmide pVENUS-N1 comme un modèle et protocole PCR du fabricant afin d’amplifier le fragment d’ADN de Vénus .</li>
	<li>Amplifier le fragment d’ADN de la NLS-D2. Utiliser l’enzyme PCR, les amorces F4 et R4, plasmide pcDNA3.3-d2eGFP comme un modèle et protocole PCR du fabricant afin d’amplifier le fragment d’ADN de la NLS-D2.</li>
	<li>Synthétiser les fragment d’ADN 1 comme l’exon 1.</li>
	<li>Synthétiser les fragment d’ADN 2 comme l’éditeur de liens entre intron 336 et le fragment d’ADN de Vénus .</li>
	<li>Couper le pAAV-EF1a-double floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-plasmide vecteur HGHpA avec les enzymes MluI et EcoRI. Utilisez le Gel Extraction Kit pour purifier le plus grand fragment d’ADN. Utilisez le protocole par le fabricant.</li>
	<li>En utilisant un mélange de l’Assemblée de Gibson et de son protocole standard, assembler tous les fragments d’ADN ensemble pour produire le journaliste-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1). Utilisez le protocole par le fabricant.</li>
</ol>2. la production de Virus Adeno-associé15
<ol><li>Préparer le plasmide suivant les stocks de l’ADN : 31,25 µg de pRV1, 31,25 µg de pH21, 125 µg de pFdelta6 et 62,5 µg de pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>Préparer cinq plats de 15 cm de cellules 293 t et attendez que les cellules deviennent 90 % anastomosé.</li>
	<li>Transfecter les plasmides dans les cellules de 297T selon le protocole de réactif de transfection. Pour chaque plat, utilisez 6,25 µg de pRV1, 6,25 µg de pH21, 25 µg de pFdelta6, 12,5 µg de pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA et 120 µL de réactif de transfection.</li>
	<li>72 h après la transfection, détacher les cellules de chaque plaque à l’aide d’une arme de la pipette ; récolter les cellules dans deux tubes de 50 mL.</li>
	<li>Les cellules à 800 g pendant 10 min a granulé et éliminer le surnageant. Laver les cellules en plaçant des 20 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque tube ; les cellules à 800 g pendant 10 min a granulé et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les granulés en NaCl 150 mM et 20 mM Tris solution, pH 8,0 ; utiliser 25 mL de solution/tube. Ajouter 1,25 mL de désoxycholate de sodium 10 % fraîchement préparée (en dH2O) dans chaque tube. Ajouter benzonase nucléase à une concentration finale de 50 unités par mL et bien mélanger. Incuber à 37 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 3000 g pendant 15 min. S’assurer que tous les débris a été supprimé en poussant le mélange à travers un filtre de seringue de 0,45 µm ; Cette étape permettra d’éviter un blocage des colonnes de l’héparine.</li>
	<li>Configurer les colonnes de l’héparine à l’aide d’une pompe péristaltique ; régler le débit de 1 mL/min, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air n’est introduits dans les colonnes.</li>
	<li>Equilibrer les colonnes avec 10 mL d’un 150 mM NaCl, 20 mM Tris solution, pH 8,0. Ajouter la solution contenant le virus à chaque colonne. Laver les colonnes avec 20 mL d’un 100 mM NaCl, 20 mM Tris solution, pH 8,0. Puis, à l’aide d’une seringue de 5 mL, laver les colonnes avec 1 mL d’un 200 mM NaCl et 20 mM Tris solution pH 8,0, suivies par 1 mL d’un 300 mM NaCl et solution de Tris de 20 mM, pH 8,0.</li>
	<li>Utiliser une seringue de 5 mL pour éluer le virus avec 3 mL d’un 400 mM NaCl, solution de Tris de 20 mM, pH 8,0, suivi de 4 mL d’un 450 mM NaCl, solution de Tris de 20 mM, pH 8,0 et enfin par un 3 mL d’un 500 mM NaCl , solution de Tris de 20 mM, pH 8,0. Recueillir les matières extraites.</li>
	<li>Pour la concentration de virus recombinant adéno-associés (rAAV), charger les matières extraites, 4 mL à la fois, dans les unités de filtration centrifuge avec un poids moléculaire 100 000 coupure. Centrifuger chaque échantillon de 4 mL à 2000 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter le cheminement.</li>
	<li>Lorsque toutes les matières extraites ont été exécutés par les unités de filtration centrifuge, ajouter 4 mL de PBS et centrifuger le mélange dans environ 250 μL. Supprimer rAAVs (titre viral devrait être d’environ 2-8 x 1012 particules virales / mL) des unités de filtration centrifuge, partie aliquote et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. À ce stade, le virus peut être conservé pendant plusieurs mois.</li>
</ol>3. le rAAV Injection et Insertion de fibre optique dans le SCN de souris adultes
<ol><li>Injection de fluorescence circadienne porteurs de journaliste rAAVs dans le SCN<ol>
<li>Charger 5 µL du rAAV (le titre du virus est d’environ 2-8 x12 10 virions / mL) dans une seringue à injection.</li>
		<li>Anesthésier une souris adulte (C57BL/6 en arrière-plan pour 2 à 5-mois,) avec Nembutal (80 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Recherchez une profondeur suffisante de l’anesthésie en l’absence d’une réponse d’orteil-pincée.</li>
		<li>Utiliser des ciseaux pour enlever la fourrure de la tête de la souris, puis montez la souris dans un appareil stéréotaxique. Fournir une source de chaleur pour animaux anesthésiés via une couverture circulation d’eau chaude ou un autre dispositif de chauffage. NOTE : Également utiliser des tondeuses électriques ou crème dépilatoire pour enlever la fourrure.</li>
		<li>Nettoyer le site de la chirurgie avec les agents de désinfection appropriés. Par exemple, cela pourrait inclure l’eau stérile ou alcool et iode, bétadine, ou diluer chlorhexidine en alternant les gommages. Répéter au moins 3 fois. Drapé du site chirurgical.</li>
		<li>Utilisez les ciseaux pour pratiquer une incision dans le cuir chevelu et exposer le crâne.</li>
		<li>Ajuster l’appareil stéréotaxique afin que bregma et lambda sont dans le même plan horizontal ; faire deux points symétriques de bregma dans le même plan horizontal.</li>
		<li>Utiliser un coton-tige stériles imbibés dans 4 % H2O2/h2O se corroder le périoste du cerveau. Puis utilisez un coton-tige propre et stérile afin de dégager et de sécher la surface du crâne.</li>
		<li>À l’aide d’un micro foret, faites un trou d’environ 1 mm à 0,46 postérieure et 0,25 mm de diamètre latéral au bregma.</li>
		<li>
fi Utilisez un coton-tige stériles avec la solution saline physiologique pour effacer des fragments d’os de la surface exposée du cerveau.</li>
		<li>Insérer une seringue à injection dans le cerveau, s’assurant que l’extrémité de la seringue à injection soit 0,46 mm postérieure et latérale de 0,25 mm à bregma et 5,7 mm de profondeur de la surface du crâne.</li>
		<li>Injecter 500 nL du rAAV (50 nL min-1) dans le SCN, laissant la seringue à injection en place pendant 10 min après l’injection afin d’assurer une diffusion complète du rAAV.</li>
		<li>Retirer doucement la seringue à injection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insérez la fibre optique dans la zone de la SCN.<ol>
<li>À l’aide d’un couteau de fibre optique, couper une fibre 17 mm de longueur, en s’assurant que chaque côté de la fibre optique est lisse.</li>
		<li>Insérez la bague en céramique de la fibre optique et fixer la fibre optique d’une férule céramique avec du peroxyde de méthyl éthyl cétone (colle AB), veiller à ce que les surfaces de la fibre optique et une bague en céramique affleurent.</li>
		<li>Nettoyer la fibre avec un froid stérilisant solution ou oxyde d’éthylène.</li>
		<li>Après l’injection du rAAV (étape 3.1.11), insérez la fibre optique en céramique contenant de l’embout dans le SCN.</li>
		<li>Fixer la bague en céramique et fibre optique sur le crâne à l’aide de résine dentaire et laisser pour sécher.</li>
		<li>Enduire la surface de la résine dentaire arrière vernis à ongles. Répéter la procédure décrite en 3.1.2 à 3.2.5, omettant l’injection réelle du rAAV pour contrôle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soins post-opératoires<ol>
<li>Fournir des souris avec des analgésiques postopératoires, tels que la buprénorphine 2 mg/kg de poids corporel, par voie sous-cutanée, deux fois par jour.</li>
		<li>Placez la souris dans une cage de récupération alors qu’ils sortent de l’anesthésie.</li>
		<li>Souris domestiques individuellement sous une condition de lumière/obscurité de 12 h (l’intensité lumineuse ~ 100 lux au fond de la cage) avec nourriture/eau disponible ad libitum. Il convient d’attribuer huit jours avant le plus loin l’expérimentation afin de permettre des temps de récupération suffisant tout en assurant l’expression optimale de fluorescence du Rapporteur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in vivo Fluorescence Signal de surveillance et collecte de données
<ol><li>Huit jours après la chirurgie, raccorder la fibre sur la tête de la souris avec l’analyseur de signal de fluorescence (e.g., Gene Observer). Vérifier le signal de fluorescence dans le SCN des souris témoins pour établir le signal de fond. Procéder à l’observation et la mesure de ce signal en utilisant le moniteur de signal de fluorescence.</li>
	<li>Évaluer le signal de fluorescence des souris de laboratoire avec la même opération de la souris de contrôle. Exclure les souris qui ont reçu le vecteur viral, mais qui affichent uniquement le signal de fond de l’analyse, car cela indique probablement que l’extrémité de la fibre optique a raté le RCS. Après ces premières mesures, regagner leurs domicile cages pendant encore 3 semaines afin de permettre le signal de fluorescence stabiliser souris.</li>
	<li>Après 3 semaines, connectez les souris avec l’analyseur de signal de fluorescence. Mesurer la fluorescence pendant 15 s toutes les 10 min, à une fréquence de 100 Hz. Au cours de ces mesures, les souris évoluent librement dans leur cage avec nourriture/eau disponible ad libitum. Utiliser une intensité de la lumière au fond de la cage de ~ 100 lux et a la puissance du laser à la pointe de la fibre optique entre 15-20 µW.</li>
	<li>Après l’achèvement de tous les enregistrements, perfuse des souris atteintes de paraformaldéhyde à 4 % et retirer et couper le cerveau pour vérifier le placement de la fibre optique. Exclure les souris de l’analyse si l’extrémité de la fibre optique n’est pas correctement implantée dans le SCN.</li>
</ol>5. présentation et analyse de données
<ol><li>Signal de fluorescence mesure toutes les 10 min pendant 15 s, à une fréquence de 100 Hz, pour obtenir 1500 points de données. La moyenne de ces points 1500 se traduit par le signal de fluorescence à n’importe quel moment donné. Traçage des moyennes multiples au fil du temps produit une courbe de signal-à-temps qui correspond au rythme transcriptionnel de Cry1 sous un État léger de contrôle dans le SCN de déplacer librement les souris.</li>
</ol>

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li>
<li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+preparation%2C+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35055628">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li>
<li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310(2015).</li>
<li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+PER2%3A%3ALUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li>
<li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).</li>
<li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li>
<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Contrairement à l’ex vivo des méthodes, telles que la tranche culture4,5, RT-PCR16et in situ hybridation17, qui exigent que les animaux soient tuées, l' in vivo enregistrement méthode permet chercheurs pour étudier l’expression des gènes circadiens chez un animal vivant. Ainsi, cette technologie offre la possibilité d’évaluer l’effet des différentes perturbations physiques (p. ex....

Chez les mammifères, le noyau suprachiasmatique (SCN) régit les rythme circadien de l’organisme entier pour coordonner la réponse de l’individu à exogène de changements environnementaux (p. ex., lumière, température, stress, etc.)1. Composants d’horloge de base se composent de PAR1-3, 2-Cry1, horlogeet Bmal1et jouent un rôle central dans la régulation de l’horloge circadienne de chaque cellule. Chaque cellule dans le SCN contient l’activateur de la transcription, horloge/BMAL1, qui agit comme un hétérodimère pour induire l’expression de PER et CRY. Le PER / CRY complexe inhibe alors la fonction d’horloge/BMAL1 pour former une boucle de rétroaction de transcription-traduction qui prend environ 24h au complet2,3.
Des études antérieures sur le RCS ont principalement employé l’ex vivo SCN tranche culture méthode4,5,6 et, bien que cette approche a fourni des renseignements précieux, ses limites ont entravé notre capacité à obtenir des données concernant l’influence des autres noyaux du cerveau sur le RCS, ainsi que l’effet de stimuli exogènes (par exemple, lumière) sur cellules résidant dans cette région critique. En 2001, groupe de Hitoshi Okamura fut le premier à utiliser le système de bioluminescence de l’expression génique in vivo moniteur horloge circadienne dans le SCN en se déplaçant librement souris7. Groupe de Ken-ichi Honma a passé les dernières années développer davantage la bioluminescence in vivo système d’enregistrement dans le SCN8,9,10. Ensemble, ces études ont fourni des chercheurs avec la possibilité de surveiller l’horloge circadienne dans l’obscurité totale ou après une impulsion de lumière. Cependant, parce que la bioluminescence est trop faible pour permettre une surveillance continue durant le cycle de lumière/obscurité, associée au fait que la lumière est le signal prédominant requis pour l’entraînement de SCN-mediated des horloges circadiennes11, il est demande croissante pour le développement de méthodes expérimentales qui surmonter les limitations associées à enregistrement de bioluminescence. Le présent rapport décrit un système basés sur la fluorescence qui a été construit pour surveiller l’horloge circadienne du SCN en vivo en se déplaçant librement des souris. Cette méthode facile à utiliser permet une surveillance continue durant le cycle de lumière/obscurité et permet l’observation à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le SCN en temps réel et à haute résolution temporelle.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmide</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmide</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmide</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Seringue</td><td>Filtre EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0,45&nbsp ; et micro ; m&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colonnes d’héparine</td><td>HiTrap gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&nbsp ;</td></tr><tr><td>Filtre centrifuge Amicon ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp ; UFC810024</td><td>100 000 MWCO</td></tr><tr><td>Nucléase benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Produire une solution fraîche pour chaque</td></tr><tr><td>appareil stéréotaxique de souris</td><td>en lot B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td></td></tr><tr><td>Réactif appareil stéréotaxique</td><td>souris B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Fibre optique</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0,39 NA et Oslash ; 200 et micro ; </td></tr><tr><td>Pompe à microseringue</td> m <td>Nanoliter 2000 Injecteur, WPI</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>virole en céramique</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&thinsp ; &mu ; m D.I., 2,5 mm D.E.</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkÉquipement Optics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo suivi de l’expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de reporters de fluorescence

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Cette technique combine fibre optique médiée par fluorescence enregistrements avec la livraison précise de reporters de gène recombinant virus adeno-associé basé. Cet nouvelle et facile à utiliser en vivo fluorescence surveillance système a été développé pour enregistrer le rythme transcriptionnel du gène de l’horloge, Cry1, dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de déplacer librement les souris. Pour ce faire, un journaliste de fluorescence de transcription Cry1 a été conçu et emballé en virus Adeno-associé. Purifié, concentré de virus a été injecté dans la SCN, suivie de l’introduction d’une fibre optique, qui a été ensuite fixée sur la surface du cerveau de la souris. Les animaux ont été retournés à leurs cages maison et jouir d’un délai de 1 mois de convalescence postopératoire assurer suffisamment expression du Rapporteur. Fluorescence a été enregistré puis en se déplaçant librement souris via un en vivo surveillance système qui a été construit dans notre établissement. Pour l' en vivo système d’enregistrement, un laser à 488 nm a été couplé avec un 1 × 4-séparateur de faisceau qui divise la lumière en quatre sorties d’excitation de laser de puissance égale. Cette configuration a permis d’enregistrer simultanément des quatre animaux. Chacun des signaux émis par fluorescence ont été recueillie via un tube photomultiplicateur et une carte d’acquisition de données. En revanche à la précédente bioluminescence in vivo horloge circadienne technique d’enregistrement, cette fluorescence in vivo système d’enregistrement permet l’enregistrement de l’expression génique horloge circadienne pendant le cycle de lumière.

Fluorescence journaliste Cry1 était Voir la Figure1 a. En utilisant l’approche détaillée ci-dessus, 500 nL du rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 a été injecté avec succès dans le SCN d’une souris adulte et exposé expression robuste de Vénus (Figure 1 b, 1C). Les signaux de fluorescence enregistrés dans des conditions de foncé/dark (DD) (Figure 2) et 12h / 12h ...

Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Cette méthode permet de surveiller l’expression des gènes de l’horloge circadienne en temps réel et à haute résolution temporelle chez des souris se déplaçant librement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fonctionne à la fois dans des conditions claire-obscurité et sombre-obscurité, qui sont d’une importance cruciale pour l’étude de l’horloge circadienne. À l’aide d’un couteau à fibre optique, coupez une fibre de 17 millimètres de longueur.S’assurer que chaque côté de la fibre optique est lisse. Insérez la fibre optique dans la virole en céramique et fixez la fibre optique à une virole en céramique avec du peroxyde de méthyléthylcétone. S’assurer que les surfaces de la fibre optique et de la virole en céramique sont affleurantes.Nettoyez la fibre optique à l’aide d’un coton-tige imbibé de 75 % d’ethnie. Et gardez-le propre jusqu’à ce qu’il soit prêt à être inséré. Commencez la procédure d’injection en chargeant d’abord cinq microlitres d’AAV recombinant dans une microseringue.Ensuite, après avoir anesthésié une souris adulte à l’aide d’un protocole approuvé par l’établissement, vérifiez que la profondeur de l’anesthésie est suffisante en l’absence de réponse par p

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La procédure de préparation des tranches contenant les souris adulte hypothalamique suprachiasmatique noyau (SCN), et un moyen rapide de la culture des tissus SCN dans un état de culture organotypique, sont rapportés. En outre, la mesure de l'expression de la protéine horloge oscillatoires gènes en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase est décrite.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

L'horloge circadienne régule environ un tiers du transcriptome Arabidopsis, mais le pourcentage de gènes qui se nourrissent de nouveau dans timekeeping reste inconnue. Ici, nous visualisons une méthode pour évaluer rapidement les phénotypes circadiens dans toute lignée mutante d'Arabidopsis en utilisant l'imagerie luminescente d'un journaliste circadien transitoirement exprimé en protoplastes.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.

Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Cette étude introduit des stratégies chimiogénétiques et basées sur la lumière violette pour permettre un décalage de phase circadien fiable en journée.

Induire les décalages de phase circadiens diurnes à l’aide d’approches chimiogénétiques et spectrales

Apprenez à surveiller l'expression des gènes horloge circadienne en temps réel dans le noyau suprachiasmatique de souris librement mobiles. Cette méthode par fluorescence fonctionne en conditions clair-obscur et obscurité totale.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

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