Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

L’objectif global de ce modèle préclinique humain dérivé de tissu tumoral réséqué chirurgicalement est d’obtenir l’établissement d’une culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé du patient. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la physiopathologie du sarcome des tissus mous et représente un outil préclinique important pour prédire la réponse au traitement. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un modèle préclinique entièrement humain.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement du sarcome des tissus mous, car ce modèle préclinique peut être testé avec des médicaments innovants conventionnels pour étudier leur activité et leur mécanisme d’action. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du sarcome des tissus mous, elle peut également être appliquée à l’étude de l’interaction entre les cellules cancéreuses et les tissus mous. Les personnes novices dans cette méthode auront du mal à cause de l’hétérogénéité des tissus tumoraux et de l’isolement des cellules tumorales.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la sélection initiale des cellules du sarcome des tissus mous et les étapes de la CD nécessitent une certaine expérience avant d’atteindre la compétence. Les échantillons de tumeur doivent être reçus dans un récipient d’urine stérile de 100 millilitres avec 50 millilitres de milieu DMEM à faible teneur en glucose scellé avec un film de paraffine. Les échantillons peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant un maximum de trois heures après la résection de la tumeur.

Stérilisez le capot de culture tissulaire avec 70 % d’éthanol et stérilisez les pinces à épiler en acier INOX avec 70 % d’éthanol. Retirez le film de paraffine du récipient d’urine et jetez-le. Nettoyez l’extérieur du récipient d’urine avec de l’éthanol à 70 %.

Ouvrez une boîte de Pétri carrée, puis ouvrez le récipient d’urine et utilisez la pince à épiler INOX en acier stérilisé pour transférer les échantillons de tumeur dans la boîte. Ajoutez du PBS et lavez l’échantillon de tumeur deux fois. Après le lavage, déchiquetez finement l’échantillon de tumeur en morceaux d’une à deux millimètres.

Transférez un quart de l’échantillon total dans un tube de deux millilitres. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif TRIzol dans le tube et congelez immédiatement à moins 80 degrés Celsius. Recueillez le reste du matériel tumoral finement déchiqueté dans un tube de 15 millilitres et ajoutez quatre millilitres de solution de collagénase de type un.

Diluez ensuite la solution de collagénase de type un avec quatre millilitres de milieu de culture, fermez le tube et scellez-le avec un film de paraffine. Incuber à 37 degrés Celsius sur un agitateur roulant pendant 15 minutes pour activer la digestion. Au bout de 15 minutes, placez le tube avec le shaker à température ambiante et laissez-le reposer toute la nuit.

Le lendemain, filtrez doucement la suspension cellulaire à travers un filtre stérile de 100 microns dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, lavez le filtre avec un milieu de culture et centrifugez le filtrat à 225 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant en inversant le tube et remettez les cellules en suspension avec un à deux millilitres de milieu de culture.

Après avoir effectué un comptage cellulaire et calculé le nombre de cellules, plaquez les cellules dans une culture monocouche standard à une densité de 80 000 cellules par centimètre carré. Pour préparer un échantillon cytologique, commencez par collecter 100 000 cellules dans 200 microlitres de milieu de culture. Pipetez la solution dans un entonnoir jetable équipé d’un filtre et monté avec une lame en verre.

Ouvrez la cytocentrifugeuse et insérez les échantillons. Après la cytocentrifugation, jetez l’entonnoir équipé du filtre. Fixez ensuite la lame à l’acétone pendant 10 minutes, puis au chloroforme pendant cinq minutes.

Passage des cellules STS lorsque la confluence est d’environ 90 %Après avoir lavé la feuille cellulaire avec du PBS, ajoutez deux à trois millilitres de 1X Trypsine dans du PBS et incubez pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, utilisez une pipette de 200 à 1 000 microlitres pour recueillir les cellules détachées et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Ajouter quatre millilitres de milieu pour arrêter la réaction enzymatique.

Ensuite, centrifugez à 225 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire en ajoutant un millilitre de milieu et ensemencez les cellules dans une nouvelle plaque de culture ou un flacon. Des cellules tumorales ont été isolées à partir d’un liposarcome retiré chirurgicalement d’un patient de 54 ans.

Une hybridation in situ fluorescente a été réalisée pour détecter l’amplification de MDM2 dans l’échantillon de tissu du patient. L’analyse cytologique de l’amplification de MDM2 dans des cellules tumorales isolées confirme l’établissement d’une culture primaire dérivée du patient. Des changements morphologiques à partir de la base ont été induits lorsque les cultures ont été traitées avec de l’ifosfamide, de l’épirubicine, de l’ifosfamide et de l’épirubicine, de la trabectédine et de l’éribuline.

Trois répétitions indépendantes ont été réalisées pour chaque expérience de viabilité. Les résultats ont confirmé la sensibilité des cultures à la chimiothérapie. Le traitement le plus actif a été l’association de l’ifosfamide et de l’épirubicine, un traitement de première intention utilisé dans le traitement avancé ou métastatique de l’ALT-DDLPS.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15-16 heures si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de déchiqueter finement l’échantillon de tumeur. À la suite de cette procédure, une variété d’analyses en aval, y compris le profilage de l’expression génique, l’analyse immunohistochimique ou le test de cytotoxicité, peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires sur la biologie du sarcome des tissus mous.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du sarcome des tissus mous pour étudier l’histoire naturelle de ces tumeurs malignes peu explorées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir une culture primaire du sarcome des tissus mous dérivé du patient. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques et des médicaments peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et le travail avec une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.