Un test Simple et peu coûteuse pour mesurer la déambulation dans des modèles murins de la dystrophie musculaire
29 décembre 2017
Ce protocole décrit un système flexible et peu onéreuse pour mesurer ambulation de souris en un dosage de l’activité de plein champ. Nous montrons qu’un test de marche de 6 minutes basé sur ce système détecte une diminution des mouvements volontaires chez la souris mdx et distingue précisément amélioration à un sauvetage d’un muscle spécifique de ces animaux.
L’objectif global de ce test est de mesurer la déambulation volontaire dans des modèles murins de dystrophie musculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dystrophie musculaire sur la progression de la faiblesse musculaire dans des modèles murins de dystrophie musculaire et l’efficacité de traitements potentiels. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une mesure non invasive et reproductible de l’activité animale qui peut être facilement adaptée à de nombreux contextes de recherche différents.
Dans une pièce calme à température contrôlée à une heure constante de la journée, placez une caméra sur un treillis métallique au-dessus de la chambre d’activité pour permettre l’enregistrement dans toute l’arène et nettoyez la chambre avec un désinfectant. Immédiatement avant l’enregistrement de l’activité, laissez la souris saisir la barre polaire d’un dynamomètre numérique et tirez doucement vers l’arrière jusqu’à ce que la barre polaire soit relâchée. Enregistrez la tension maximale en Newtons pour chaque essai.
Avec une minute de repos entre les essais. Immédiatement après le test de la force de préhension, placez la souris dans la chambre et lancez l’enregistrement vidéo, permettant à la souris d’explorer librement. Après six minutes, arrêtez l’enregistrement et remettez la souris dans sa cage d’origine.
Pour l’analyse du suivi des données vidéo, ouvrez d’abord l’enregistrement dans le logiciel de montage vidéo approprié et réglez la vitesse sur deux fois. Exportez la vidéo décimée au format de fichier mp4 pour l’analyse de suivi et ouvrez la vidéo dans le programme d’analyse vidéo approprié. Pour régler l’étalonnage de l’enregistrement vidéo, utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne le long d’un côté de la chambre.
Faites un clic droit sur la ligne, sélectionnez calibrer la mesure et entrez la taille réelle du côté de la chambre en centimètres. Pour commencer le suivi semi-automatique de la position de la souris, cliquez sur le curseur de déplacement. En commençant par l’image initiale de la vidéo, faites un clic droit sur le point à suivre.
Le point de suivi sera marqué d’un cercle bleu. Utilisez la flèche droite du clavier pour faire avancer le cadre. Le point de suivi doit se déplacer automatiquement en fonction de la position de la base arrière.
Si la position de suivi n’est pas alignée avec le point d’intérêt dans une image donnée, alignez manuellement le cercle bleu sur la position de suivi. Une fois que la vidéo entière a été suivie, enregistrez la vidéo et la superposition de traçage, puis sélectionnez Exporter vers une feuille de calcul pour exporter les données de position du traçage. Conformément aux résultats rapportés par des tests similaires, les souris mdx sans dystrophine soumises à un protocole d’exercice immédiatement avant le test démontrent significativement moins de mouvements volontaires dans un test de champ ouvert de six minutes, que les animaux de type sauvage.
En effet, après l’effort léger d’un défi de force de préhension, les souris mdx sont généralement restées immobiles pendant les premières minutes du protocole de déambulation, avec une augmentation modeste du mouvement de quatre à cinq minutes. Cependant, en comparant des animaux de type sauvage et mdx sans défi d’exercice, aucune différence dans la distance parcourue n’est détectée. Les souris Mdx transgéniques pour l’expression de l’utrophine sont indiscernables des animaux de type sauvage, sans différences significatives dans la distance totale parcourue, ou à l’un des points de commutation observés dans le temps.
Pour déterminer l’effet de la diminution de la fréquence d’échantillonnage, la distance totale parcourue à partir d’une minute de vidéo à fréquence d’images complète a été mesurée et comparée aux mesures de distance dérivées des versions sous-échantillonnées de l’ensemble de données. La réduction de moitié de la fréquence d’images a permis de réduire la distance mesurée de 5 % de la distance calculée à l’origine. La précision de la distance mesurée diminue brusquement après ce point, bien que même les ensembles de données fortement décimés se rapprochent encore étroitement de la trajectoire de l’animal, ce qui souligne l’importance de prendre en compte la fréquence d’images et le traitement du signal dans l’évaluation de l’activité animale, et démontre qu’une résolution spatiale élevée peut être conservée dans les données vidéo échantillonnées.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer et d’analyser la déambulation de la souris dans un environnement ouvert. Une fois maîtrisée, cette analyse peut être réalisée en 15 à 30 minutes si elle est effectuée correctement. Ce test peu coûteux et non invasif permet aux chercheurs d’examiner l’activité motrice dans des modèles murins de dystrophie musculaire, et peut servir de première étape informative pour d’autres mesures fonctionnelles.
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Aperçu
Ce protocole décrit un système souple et peu coûteux permettant de mesurer la locomotion de la souris dans un test d'activité en champ ouvert. La méthode fournit une mesure non invasive et reproductible de l'activité animale, qui peut être adaptée à divers contextes de recherche.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Recherche sur la dystrophie musculaire
- Analyse comportementale
Contexte
- Le test mesure l'ambulation volontaire chez des modèles murins de dystrophie musculaire.
- Il répond à des questions essentielles concernant la progression de la faiblesse musculaire.
- La technique est conçue pour évaluer l'efficacité de thérapeutiques potentielles.
- L'enregistrement est effectué dans un environnement contrôlé afin d'assurer la reproductibilité.
Objectif de l'étude
- Mesurer le mouvement volontaire chez les souris mdx.
- Évaluer l'impact d'interventions spécifiques aux muscles.
- Fournir des informations sur la progression de la dystrophie musculaire.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une caméra positionnée au-dessus de la chambre d'activité pour l'enregistrement.
- Nettoyage de la chambre avec un désinfectant avant les essais.
- Permettre à la souris de s'accrocher à une barre verticale afin de mesurer la tension maximale.
- Enregistrement de l'activité au cours d'un test de déambulation de 6 minutes.
Résultats principaux
- Le système détecte les diminutions des mouvements volontaires chez les souris mdx.
- Il distingue précisément les améliorations dues à la récupération spécifique du muscle.
- Les résultats sont reproductibles entre différents essais.
- La méthode est adaptable à divers contextes de recherche.
Conclusions
- Cet essai est efficace pour l'étude de la dystrophie musculaire chez la souris.
- Il fournit des données précieuses sur l'efficacité de traitements potentiels.
- L'approche est souple et peut être utilisée dans divers environnements de recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure de l'ambulation volontaire chez les modèles murins fournit une lecture translationnelle de la fonction motrice dans la dystrophie musculaire, directement comparable à des critères d'évaluation cliniques tels que le test de marche de 6 minutes. Cet essai peu coûteux, basé sur la vidéo, permet une évaluation reproductible et non invasive de l'évolution de la maladie et de la réponse thérapeutique dans les études précliniques. En détectant les déficits d'activité chez les souris mdx dépourvues de dystrophine et leur correction par l'expression de l'utrophine, cette méthode soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments neuromusculaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en quantifiant la locomotion volontaire comme indicateur fonctionnel de la force musculaire dans des modèles dystrophiques.
- Valeur opérationnelle : Permet la réduction des risques biologiques grâce à une corrélation reproductible entre génotype et phénotype chez des souris mdx par rapport à des cohortes sauvages et récupérées.
- Valeur prédictive : Soutient le tri du portefeuille en distinguant les interventions efficaces (par exemple, transgène d'utrophine) qui normalisent les niveaux d'activité à ceux du type sauvage.
Développement de criblages et de tests
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en utilisant des métriques normalisées de locomotion en champ ouvert.
- Reproductibilité : Fournit des données quantitatives basées sur la distance et le temps, adaptables à la standardisation des essais entre différents laboratoires.
- Extensibilité : S'appuie sur des logiciels libres et open source ainsi que sur du matériel accessible pour permettre la réutilisation de la plateforme dans divers contextes de recherche, sans nécessiter d'équipement spécialisé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise des déficits de la marche pertinents pour les patients, assurant une continuité translationnelle depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique.
- Élimination des risques mécanistiques : Précise si les effets observés résultent d'une restauration spécifique du muscle ou de changements d'activité non spécifiques.
- Décisions ajustées au risque : Éclaire les critères de poursuite ou d'abandon en corrélant la récupération de la marche avec l'engagement de la cible et la modulation de la voie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, offrant un lien fonctionnel entre les mécanismes moléculaires et les résultats phénotypiques dans les modèles de dystrophie musculaire.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en reliant des interventions génétiques ou pharmacologiques à des modifications mesurables du mouvement volontaire.
- Écrans de sélection : Permet la préparation des tests grâce à un suivi reproductible basé sur la vidéo, générant des paramètres quantifiables de la marche pour l'évaluation de composés.
- Analyse : Produit des flux de données spatiales et temporelles permettant aux équipes de comparer l'activité locomotrice entre différents génotypes, traitements et points temporels.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en reproduisant les évaluations cliniques de la marche, facilitant l'alignement des biomarqueurs et la modélisation prédictive.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité reproductible et peu coûteuse pour les tests de marche, réduisant ainsi la dépendance aux plateformes spécialisées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des tests de fonction motrice.
- Valeur opérationnelle : Renforce la normalisation et la reproductibilité grâce à un suivi open source et à des conditions environnementales contrôlées.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en éliminant le besoin de systèmes coûteux de suivi des mouvements tout en préservant la qualité des données.
- Impact sur le portefeuille : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur la récupération fonctionnelle des phénotypes de marche dans les modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en enregistrement vidéo et en logiciels de suivi open source (par exemple, alignement manuel image par image).
- Dépend d'un équipement d'imagerie standard et de contrôles environnementaux constants (éclairage, température, heure de la journée).
- Exige une adhésion au protocole par toutes les équipes afin d'assurer la reproductibilité entre les sites et les opérateurs.
- Implique des adaptations selon la taille des chambres, les souches de souris et les niveaux d'activité.
- Implique des compromis entre la fréquence d'images et la précision des mesures, car le sous-échantillonnage réduit la précision du calcul des distances.
