Name: Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Apprenez une méthode reproductible de préparation de tissus fixés au formol pour l'imagerie par spectrométrie de masse de peptides. Cette technique simple permet aux débutants de développer efficacement leurs propres protocoles d'analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tenons à remercier la Fondation école médicale de Sydney et le Blues et la Fondation pour financer la partie de ce travail par le biais de leur programme de bourses de doctorat pour la recherche de la maladie d’Alzheimer et une subvention à la découverte de l’ARC (DP160102063) attribué à PKW.

ATTENTION : Toutes les précautions de sécurité en vigueur devraient suivre lors de l’exécution de cette procédure, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié (PPE) (p. ex., les sarraus de laboratoire, gants en nitrile, lunettes de sécurité, etc.)
1. préparation des réactifs et du matériel
<ol><li>
Préparation des solutions
	<ol>
<li>Pour préparer 500 mL de liquide de Carnoy, mélanger 100 % éthanol (EtOH), le chloroforme et acide acétique glacial dans un 6 : rapport de 3:1 v/v/v dans une bouteille propre Schott.</li>
		<li>Pour rendre liquide nitrocellulose (NC), dissoudre membrane NC (couramment utilisé en western blot) dans de l’acétone pur, par agitation douce, à une concentration finale de 40 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de diapositives NC enduit
	<ol>
<li>Utilisation d’une technique similaire à celle utilisée pour la préparation du sang frottis pour examen histologique20 préparer NC enduit diapositives.</li>
		<li>Distribuer 40 µL de liquide NC sur une arête d’une lame de microscope d’oxyde d’étain (ITO) conducteur d’indium. À l’aide d’une lame de microscope de verre ordinaire, faites glisser la NC sous tension superficielle sur la diapositive pour créer un revêtement mince même.</li>
		<li>Permettre la NC sécher à température ambiante pendant 20 s et puis magasin jusqu'à ce que nécessaire à la température ambiante. Conservation des échantillons en vertu de ces conditions peut être indéfinie, pourvu que les tissus sont maintenues et exempt de poussière. Remarque : Cette méthode de préparation est mieux connu sous le nom de « couches minces » et va produire un revêtement uniform qui dépend de la viscosité de la NC ainsi que son manque de tension superficielle s’autoniveler sur la diapositive. Les soins seul qu’il faut alors préparer les diapositives pas bouge trop vite, ce qui créeront des stries de NC plutôt que d’une couverture complète. ATTENTION : Comme liquide NC sèche très vite, il est essentiel de travailler rapidement pour éviter la solution de séchage avant il a été correctement étalé. Aussi être prudent lorsque manipulation NC à l’état liquide, telle qu’elle est un composé hautement énergétique et ne doit pas toucher une source d’inflammation pour prévenir l’explosion incendiaire. NC subit aussi une transition endothermique lorsque séchage et peut causer des brûlures de froids si autorisés à entrer en contact prolongé avec la peau ou les mains gantées. Afin de minimiser tous risques, que de faibles quantités doivent être préparées à chaque fois (< 1 mL est recommandé). Une fois sec, il est stable à température ambiante. Cependant, NC peut rester explosif lorsqu’il est présent en grande quantité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Création des chambres de vapeur personnalisé
	<ol>
<li>Couper un morceau de papier buvard épais avec une paire de ciseaux assez grand pour s’adapter à la partie inférieure la moitié d’un plat de Pétri plastique standard (94 mm de diamètre et 3 mm d’épaisseur).</li>
		<li>Couper le papier, en laissant une bande rectangulaire dans le centre, la même taille qu’une lame de microscope, laissant assez de surplus pour que le document conserve sa position dans la boîte de Pétri (supplémentaire Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation des coupes de tissus
<ol><li>
FFIP tissu21.
	<ol>
<li>Sélectionnez le bloc de tissu désiré et la section à 12 µm d’épaisseur dans un banc standard monté microtome et flotteur monture sur la NC pré-enrobé ITO diapositives.</li>
		<li>Plonger les lames dans le xylène douce pour enlever la paraffine résiduelle pendant 2 min et répéter l’opération une seconde fois. Remarque : Si le bloc de paraffine est particulièrement envahissant ou le tissu est relativement faible par rapport au bloc de paraffine, les échantillons peuvent être chauffés à 60 ° C pour faire fondre la majorité loin avant le lavage dans le xylène.</li>
		<li>Laver les échantillons déparaffinées en immergeant les lames dans une série graduée de solvant : 70 % v/v EtOH/eau, 100 % EtOH, de Carnoy fluide, 100 % EtOH, eau ultra pure et 100 % EtOH. La durée de chaque immersion devrait être de 30 s, à l’exception de fluide de Carnoy, qui doit durer 2 min. ATTENTION : De Carnoy fluide et xylène doivent être stockés et utilisés dans une hotte de laboratoire, car ils sont très toxiques par inhalation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tissus fixés au formol congelés (FFF) Remarque : Les échantillons déjà, doivent être gelés appropriée selon le type d’échantillon.<ol>
<li>Equilibrer le bloc de tissu à la température de fonctionnement du microtome pour 20 min22. Remarque : La température de l’équilibration est dépendante du type de tissu.</li>
		<li>Section le tissu à l’aide d’un microtome à 12 µm et dégel montage les sections sur un NC pré-préparés enduit ITO glisser.</li>
		<li>Stocker les diapositives dans un dessiccateur à vide sur le banc dans l’obscurité. Remarque : Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines dans ces conditions.</li>
		<li>Laver les échantillons en une série de solvant classée comme indiqué pour tissu FFPE (2.1.3). Remarque : Il n’est pas nécessaire pour une étape de deparaffinisation de xylène que l’échantillon n’est pas incorporée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. méthylène Crosslink hydrolyse
<ol><li>Charger les lames de l’échantillon (FFF ou FFIP) dans une boîte en plastique de glissière qui est remplie de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8) vers le haut. Scellez la boîte et le placer dans un bain d’eau contenant 500 mL d’eau, ce qui permet de la boîte à toucher le fond. Puis chauffer pendant 15 min à 120 ° C dans une marmite à pression qui peuvent atteindre une pression de 70 kPa.</li>
	<li>Supprimer les diapositives, laissez-les refroidir et laissez-les sécher à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
</ol>4. tissu Digestion
<ol><li>Une fois hydrolysée, enduire les échantillons avec 10 µL de solution de trypsine (1 mg/mL) dans l’eau ultra pure, par pipetage 10 µL de la solution sur le bord de la partie de tissu et ensuite, en utilisant la même pipette, faites glisser la gouttelette sur toute la surface du tissu sous la surface tension. Remarque : Ne pas rayer la surface du tissu avec l’embout de la pipette et de répandre l’enzyme au-delà des frontières des bords des tissus.</li>
	<li>Laisser les échantillons à sécher à température ambiante.</li>
	<li>Une fois sec, montez les échantillons à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits (tissus vers le bas) avec ruban autoclave sur chaque bord de la lame (complémentaire Figure 2).</li>
	<li>Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 v/v de 100 % d’acétonitrile et de 50 mM d’ammonium bicarbonate soigneusement sur le doigt de papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri, jusqu'à ce que le doigt semble être uniformément humide.</li>
	<li>Placez la moitié supérieure de la chambre de vapeur sur le fond la moitié, s’assurant de la diapositive de doigt et échantillon de papier aligner parfaitement et sceller la chambre autour de son Équateur avec film de paraffine.</li>
	<li>Laisser l’échantillon du jour au lendemain dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une digestion complète.</li>
</ol>5. matrice revêtement par Sublimation
<ol><li>Une fois digéré, peser la lame échantillon sur un équilibre microanalytiques à 5 chiffres.</li>
	<li>Monter le glisser sur le doigt de refroidissement de l’appareil de sublimation et fixez-le avec du ruban de cuivre, de la même manière comme pour la chambre de vapeur (supplémentaire Figure 3). Remarque : Pour vous assurer que la lame est contactée uniformément par le doigt de refroidissement, une couche de ruban de cuivre est placée sur le fond du doigt refroidissement pour niveler la surface. Cela garantit que la diapositive est uniformément froid qui mène au même dépôt de matrice.</li>
	<li>Placer 300 mg de matrice de α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) dans un plat de Pétri de verre au fond de la chambre et la propagation uniformément pour créer une fine couche de cristaux de matrice.</li>
	<li>Assembler le sublimator et fixer les deux moitiés avec le collier de fer à cheval. Suspendre l’appareil assemblé 15-20 cm au-dessus d’un bain de sable, préalablement chauffé à 220 ° C, en le plaçant dans un anneau métallique relié à un statif.</li>
	<li>Connecter la chambre à la source de vide, engager le vide et laissez-le se stabiliser vers le bas pour ~ 25 mTorr pendant 5 min.</li>
	<li>Emballez le doigt de refroidissement vers le haut avec de la glace et ajouter 50 mL d’eau. Laissez l’appareil se contenter d’un autre 5 minutes avant de procéder.</li>
	<li>Abaissez la chambre sur la surface du sable, assurant le sable entre complètement en contact avec le fond de la chambre et laissez-le pendant 45 min créer un revêtement idéal de 0,22 mg/cm2 ATTENTION : Il faut quand manutention verrerie à vide poussé, comme des dommages à l’appareil, alors que les évacués, peut entraîner une défaillance catastrophique de la chambre de verre.</li>
	<li>Après 45 min, enlevez la chambre depuis le bain de sable en soulevant la bague métallique et aérer la chambre. Remarque : Une fois que la chambre a été vidée, la lame doit être enlevée très rapidement que l’eau dans l’air commence à se condenser sur la diapositive de doigt et échantillon de gel.</li>
	<li>Retirer la glissière et pesez-le afin d’assurer le revêtement désiré a été atteint. Remarque : Si le revêtement insuffisant ont été réalisé, répétez simplement le processus de sublimation pour la diapositive jusqu'à ce que l’épaisseur du revêtement désiré a été atteint.</li>
</ol>6. recristallisation
<ol><li>Une fois sublimée, monter la lame de l’échantillon à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits, comme antérieure décrite (tissus vers le bas).</li>
	<li>Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 (v/v) de 100 % d’acétonitrile et de 0,1 % v/v d’acide trifluoroacétique dans l’eau avec précaution sur le papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri pour assurer une couche uniforme.</li>
	<li>Assembler la chambre, assurant la glissière de microscope et onglet papier aligner parfaitement et laisser dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h. ATTENTION : Ne pas assurer l’étanchéité la chambre. Remarque : Une fois recristallisée, la teinte jaune normalement de la matrice devrait changer en blanc, regarder moins brillante et apparaissent très même. Ceci indique que recristallisation a été effectuée correctement.</li>
	<li>L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse.</li>
</ol>7. instrumentation
<ol><li>Scan de la lame dans un scanner à plat pour créer une image numérique.</li>
	<li>Charger l’échantillon dans le spectromètre de masse et à analyser à l’aide de la plate-forme de logiciels appropriés.</li>
	<li>Analyse des échantillons en mode réflectron ion positif avec une gamme de masses de 750-3 500 Da, avec une résolution spot qui s’applique au résultat souhaité. Dans la plupart des cas, 20 à 50 µm raster largeur est suffisante, mais aussi peu que 10 µm peut être utilisé15. ATTENTION : Les lasers UV MALDI sont une source de rayonnement ionisant et ne doivent pas être lus directement. Veiller à ce que le laser est contenu au sein de l’instrument blindage avant l’opération.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%3A+practical+aspects+of+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Biological+Samples%3A+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-Ion+Mobility+Mass+Spectrometry+of+Lipids+in+Negative+Ion+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+methods+%3A+advancing+methods+and+applications%22%5BJournal%5D)">MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode.</a> Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-instrument-based+method+for+the+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+spinal+cord+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).</li>
<li>Chughtai, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+imaging+for+biomedical+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis.</a> Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry+profiling+of+N-glycans+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+clinical+tissue+blocks+and+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays.</a> PLoS One. 9 (9), 10655(2014).</li>
<li>Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+high+resolution+in+mass+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space.</a> Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+statistical+data+analysis+and+current+computational+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11(2012).</li>
<li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+From+tissue+sections+to+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li>
<li>Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).</li>
<li>O'Rourke, M., Padula, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5695">The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis.</a> Protocol Exchange. , (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+of+visual+data+representation+for+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry.</a> Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Casadonte, R., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).</li>
<li>Ong, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Identification+of+Peptides+Associated+with+Cephalic+Ganglia+Regeneration+in+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea.</a> J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-smear+showing+Experimental+Infection+with+Herpetomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas.</a> Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55(1925).</li>
<li>Gorrie, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+OEC-derived+cell+transplants+in+rodent+spinal+cord+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury.</a> Brain Res. 1337, 8-20 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Tissue+Derivatization+via+Electrospray+Deposition+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Endogenous+Fatty+Acids+in+Rat+Brain+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues.</a> Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+NIMS+and+MALDI+platforms+for+neuropeptide+and+lipid+mass+spectrometric+imaging+in+C.+borealis+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue.</a> Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).</li>
<li>Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+pressure+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+tissues+and+cells+at+1.4-mum+lateral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution.</a> Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
<li>Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+mass+spectrometric+imaging+of+biological+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections.</a> Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).</li>
<li>Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+gallotannins+and+monoterpene+glucosides+in+the+root+of+Paeonia+lactiflora%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora.</a> Sci Rep. 6, 36074(2016).</li>
<li>Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+biomolecular+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of biomolecular information.</a> Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).</li>
<li>Widlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+signatures+of+oral+squamous+cell+carcinoma+and+normal+epithelium+-+application+of+a+novel+methodology+for+unsupervised+segmentation+of+imaging+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data.</a> Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts ou des intérêts commerciaux de divulguer

Ce protocole a été conçu pour maximiser la génération des espèces moléculaires ionisables tout en éliminant les délocalisation d’analytes. Les principaux facteurs impliquent en utilisant le même principe primordial lors de l’application de matrice, digérer l’échantillon ou recristalliser après sublimation24; savoir, qu’un même dépôt de vapeur, de matrice ou autrement, doit être créée et maintenue. Pipetage solvants nettoyants pour recristallisation et digestion, uniformément sous l’échantillon, em...

Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) d’imagerie a été employée comme technique d’image basé pendant deux décennies1,2, analyser une gamme de biomolécules, y compris : lipides3, peptides2 ,4, protéines2,5, métabolites6,7, N-glycans8et des molécules synthétiques tels que les médicaments thérapeutiques9,10. Le nombre de publications démontrant l’utilité de cette technique ont fortement augmenté au cours de la dernière décennie6,11,12,13. Certaines molécules, comme les lipides, sont relativement faciles à analyser par MALDI MSI, comme ils ionisent facilement en raison de leur nature chimique et nécessitent peu de préparation à l’avance3. Toutefois, pour des cibles plus difficiles comme les peptides, les étapes requises pour ioniser efficacement ces molécules sont vastes et généralement compliqué14. Il y a actuellement très peu de publications qui visent à répondre ou à démontrent la reproductibilité dans les méthodologies utilisées pour préparer les tissus à cette technique visuelle unique15. Pour cette raison, nous avons compilé les observations et mises en oeuvre des optimisations en un seul, facile à implémenter, méthodologie ne nécessite peu ou aucun modifications, pour l’analyse des peptides d’un formaldéhyde que réticulé tissu source14.
Dans ce manuscrit, nous avons décrit une méthodologie reproductible validée, à faible coût pour la détection et la cartographie spatiale des peptides, produit des surgelés fixés au formol (FFF) et fixés au formol des sections de tissu (FFIP) inclus en paraffine. Cette méthodologie ne nécessitent ni s’appuyer sur une instrumentation spécialisée3. Plus précisément, nous abordons les nombreux aspects de la préparation de l’échantillon spécialisées nécessaire pour analyser les peptides ; étapes comme antigène récupération16 et revêtement de matrice. Notre protocole utilise aussi peu coûteux matériel et réactifs, ce qui rend cette méthode accessible à toute une communauté qui autrement seraient incapable de payer l' autre appareils robotisés17.
Le raisonnement qui sous-tend l’élaboration d’une méthode de préparation d’échantillon manuel comportait deux volets : Premièrement, l’utilisation d’un sublimator crée un revêtement uniforme et homogène des cristaux de matrice qui sont environ 1 µm de longueur18, quelque chose d’irréalisables avec arrosage plus fréquent techniques. Deuxièmement, l’ensemble relativement faible des coûts : le coût total de l’appareil de mesure était < 1500 $ AUD. Nous notons, en termes de rapport coût-efficacité, que le prix par exemple est beaucoup moins cher quand il n’y a aucun mécanisme robotique impliqué. L’utilisation de sublimation a été signalée précédemment, cependant, au meilleur de nos connaissances, des méthodes pas à pas qui décrivent ce processus et préparation des échantillons n’ont pas été signalés ni décrits dans la littérature.
Ce protocole vise à aider les chercheurs qui ont accès à un spectromètre de masse MALDI et qui ont l’intention sur le développement de l’information spatiale en relation avec une bio-molécule d’intérêt19. En substance, MALDI MSI est une forme de histologique préalable qui ne s’appuie pas sur les anticorps ou taches2.

<table><tbody><tr><td>Cryo Microtome</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Lames de microscope à l’oxyde d’indium et d’étain</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Coplin Pots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Autocuiseur</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Sublimator</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>Pour la procédure de sublimation. De conception similaire à celle du CG-3038, il a cependant été fabriqué sur mesure.</td></tr><tr><td>Bain de sable</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Pour la procédure de sublimation. Sable de rivière de qualité fine maintenu dans une feuille d’aluminium pliée provenant de l’extérieur et non d’une entreprise spécifique</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165100</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Pour la procédure de sublimation. Provenant en pièce détachée d’un vieux spectromètre de masse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Piège à froid</td><td>Chem Glass</td><td>CG-4510-02</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp ;</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en plastique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z717223</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>37 &deg ; C INCUBATEUR</td><td>N.A.O</td>. <td>Pour</td><td>la procédure de sublimation. Sans objet, l’incubateur est non stérile et âgé de plus de 30 ans.</td></tr><tr><td>Papier buvard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Pour le lavage des lames. Fabriqué en laboratoire à partir de 95 % d’éthanol stock.</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8,8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>Pour le clivage protéolytique. Poudre fabriquée à 1M suivie d’un équilibrage avec 32 % HCl à PH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q Eau ultra-pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Pour le clivage protéolytique. Purification réalisée en interne par le système de purification de l’eau sartorique</td></tr><tr><td>Ammonium Bircarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Pour le clivage protéolytique.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>Pour le clivage protéolytique.</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>Pour la recristallisation.</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Pour la recristallisation.</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Pour la recristallisation.</td></tr></tbody></table>

une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging workflows

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

L’utilisation de désorption-ionisation laser assistée par matrice, spectrométrie de masse (MALDI MSI) d’imagerie a rapidement élargi, car cette technique analyse une foule de biomolécules de médicaments et de lipides à N-glycans. Bien qu’il existent de différentes techniques de préparation d’échantillon, détection des peptides de formaldéhyde préservé des tissus reste l’un des défis plus difficiles pour ce type d’analyse par spectrométrie de masse. Pour cette raison, nous avons créé et optimisé une méthodologie robuste qui conserve les informations spatiales contenues dans l’échantillon, tout en suscitant le plus grand nombre de peptides ionisables. Nous avons visait également à atteindre cet objectif de manière simple et rentable, éliminant ainsi l’erreur potentielle de partialité ou de la préparation, qui peut se produire lorsque l’utilisation automatisée instrumentation. Le résultat final est un protocole reproductible et peu coûteux.

Si suivies correctement, ce protocole produit des images qui représentent clairement la morphologie générale du tissu sans les égratignures ou autres déformations (Figure 1). La validation idéale pour une préparation de l’échantillon correctement exécutée, est la capacité de distinguer entre les différentes structures physiques en changeant la molécule étant lus (Figure 2).
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour la préparation axée sur la sublimation du formol fixé tissu destiné à la spectrométrie de masse d’imagerie.

Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer de manière reproductible un échantillon de tissu pour l’imagerie par spectrométrie de masse peptidique. Cette méthode permet aux utilisateurs novices de la spectrométrie de masse de développer leurs propres flux de travail de spectrométrie de masse d’imagerie sans passer par de longues déterminations empiriques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est hautement reproductible, simple à mettre en œuvre et utilise des méthodologies rentables.Pour préparer les lames recouvertes de nitrocellulose, pipetez 40 microlitres de nitrocellulose liquide sur un bord de la lame de microscope conductrice d’oxyde d’indium et d’étain. À l’aide d’une lame de microscope en verre ordinaire, faites glisser la nitrocellulose sous tension superficielle sur la lame pour créer un revêtement uniforme en couche mince. Laissez la nitrocellulose sécher à température ambiante pendant 20 secondes, puis conservez-la jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à température ambiante.Ensuite, créez des chambres à vapeur personnalisées en découpant un morceau de papier buvard épais suffisamment grand pour s’adapter à la moitié inférieure d’une boîte de Pétri

optimal-preparation-formalin-fixed-samples-for-peptide-based-matrix

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Formol archives fixé et inclus en paraffine (FFPE) échantillons cliniques sont un matériel précieux pour l'étude des maladies. Ici, nous démontrons une préparation flux d'échantillons permettant une analyse en profondeur protéomique des tissus FFPE microdissection.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a été précédemment rapporté comme une matrice MALDI pour l'imagerie des tissus de petites molécules, des protocoles pour l'utilisation de DT pour l'imagerie MALDI des lipides endogènes sur l' surface des coupes de tissus par ions positifs MALDI-MS sur un ultra-résolution quadripolaire FTICR instrument sont fournies ici.

Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Des lignées cellulaires de cancer immortalisées peuvent être cultivées sous forme de cultures de cellules 3D, un modèle précieux pour la recherche biologique. Ce protocole décrit imagerie par spectrométrie de masse des cultures de cellules 3D, y compris l'amélioration de la plate-forme de préparation de l'échantillon. L'objectif de ce protocole est de demander aux utilisateurs de préparer des cultures cellulaires 3D pour la masse analyse de l'imagerie par spectrométrie.

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l&#39;aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

Un protocole afin de renforcer les signaux ion glucides en spectrométrie de masse MALDI par réformer des structures cristallines au cours du processus de préparation d’échantillon est démontré.

Un procédé de préparation d’échantillon efficace pour améliorer les signaux de Ion de glucides en spectrométrie de masse de désorption-ionisation Laser assistée par matrice

Caractérisation du protéome de lits microvasculaires oculaires est essentielle pour une compréhension approfondie des nombreuses pathologies oculaires chez les humains. Cette étude démontre une méthode efficace, rapide et robuste pour l’extraction de la protéine et préparation des échantillons de petits vaisseaux sanguins qui emploient les artères ciliaires postérieures courtes porcines comme navires de modèle pour l’analyse basée sur la spectrométrie de masse protéomique.

Préparation des échantillons pour l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse des microvaisseaux oculaires

Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.

Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse

L’objectif de ce protocole est de fournir des conseils détaillés sur la préparation des échantillons lors de la planification d’expériences utilisant MALDI MSI pour maximiser la détection métabolique et moléculaire dans les échantillons biologiques.

Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Ce protocole visait à décrire des directives détaillées sur la préparation de sections d’échantillons de graines dures à faible teneur en eau pour l’analyse MALDI-IMS, en maintenant la distribution et l’abondance d’origine des analytes et en fournissant un signal de haute qualité et une résolution spatiale.

Préparation de graines de palmier dur pour l’analyse par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Apprenez une méthode reproductible de préparation de tissus fixés au formol pour l'imagerie par spectrométrie de masse de peptides. Cette technique simple permet aux débutants de développer efficacement leurs propres protocoles d'analyse.

Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows (Vidéo) | JoVE Journal

Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Explorer plus de vidéos