Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

L’objectif global de cette procédure est de préparer de manière reproductible un échantillon de tissu pour l’imagerie par spectrométrie de masse peptidique. Cette méthode permet aux utilisateurs novices de la spectrométrie de masse de développer leurs propres flux de travail de spectrométrie de masse d’imagerie sans passer par de longues déterminations empiriques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est hautement reproductible, simple à mettre en œuvre et utilise des méthodologies rentables.

Pour préparer les lames recouvertes de nitrocellulose, pipetez 40 microlitres de nitrocellulose liquide sur un bord de la lame de microscope conductrice d’oxyde d’indium et d’étain. À l’aide d’une lame de microscope en verre ordinaire, faites glisser la nitrocellulose sous tension superficielle sur la lame pour créer un revêtement uniforme en couche mince. Laissez la nitrocellulose sécher à température ambiante pendant 20 secondes, puis conservez-la jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à température ambiante.

Ensuite, créez des chambres à vapeur personnalisées en découpant un morceau de papier buvard épais suffisamment grand pour s’adapter à la moitié inférieure d’une boîte de Pétri en plastique standard. Coupez le papier pour laisser une bande rectangulaire au centre de la même taille qu’une lame de microscope. Laissez suffisamment d’excédent pour que le papier maintienne sa position dans la boîte de Pétri.

Pour les tissus FFPE, montez les sections sur les lames ITO pré-revêtues de nitrocellulose comme décrit dans le protocole texte. Immergez les lames dans du xylène frais pour éliminer la paraffine résiduelle pendant deux minutes. Lavez les échantillons déparaffés en immergeant les lames dans une série de solvants gradués composée d’une solution d’eau d’éthanol à 70 % en volume, suivie d’une solution d’éthanol à 100 %, pendant 30 secondes.

Ensuite, immergez les lames dans le liquide de Carnoy pendant deux minutes. Enfin, immergez les lames dans une série de 100 % d’éthanol, d’eau ultrapure et de 100 % d’éthanol à nouveau, pendant 30 secondes. Chargez les lames d’échantillon dans une boîte à lames en plastique qui est remplie jusqu’en haut de 20 millimolaires de tris HCO.

Fermez la boîte et placez-la dans un bain-marie contenant 500 millilitres d’eau, permettant à la boîte de toucher le fond du bain. Ensuite, chauffez la boîte pendant 15 minutes à 120 degrés Celsius dans un autocuiseur, ce qui peut atteindre une pression de fonctionnement de 70 kilopascals. Retirez les lames, laissez-les refroidir et laissez-les sécher à température ambiante pendant 15 minutes.

Une fois hydrolysé, enduisez les échantillons avec 10 microlitres de solution de trypsine dans de l’eau ultrapure en pipetant d’abord 10 microlitres de la solution sur le bord de la section de tissu. Ensuite, à l’aide de la même pointe de pipette, faites glisser la gouttelette sur toute la surface du tissu sous tension superficielle. Après avoir laissé sécher les échantillons à température ambiante, montez-les à l’intérieur du haut de la chambre à vapeur préalablement construite avec du ruban adhésif autoclave sur chaque bord de la lame.

Pipetez soigneusement 600 microlitres d’une solution contenant un mélange volume pour volume de 100 % d’acétonitrile et de 50 millimolaires de bicarbonate d’ammonium sur le doigt de papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri, jusqu’à ce que le doigt semble être uniformément humide. Le pipetage est d’une importance cruciale, car un pipetage incorrect entraînera la délocalisation de votre matrice et de vos analoïdes de surface, ce qui détruira les informations spatiales contenues dans votre échantillon. Placez la moitié supérieure de la chambre à vapeur sur la moitié inférieure, en veillant à ce que le doigt de papier et la lame d’échantillon s’alignent parfaitement, et scellez la chambre autour de son équateur avec un film de paraffine.

Laissez l’échantillon toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre une digestion complète. Une fois digérée, laissez la lame d’échantillon sur une balance microanalytique à cinq chiffres. Montez la glissière sur le doigt de refroidissement de l’appareil de sublimation et fixez-la avec du ruban de cuivre de la même manière que décrite pour la chambre à vapeur.

Placez 300 milligrammes de matrice CHCA dans une boîte de Pétri en verre au fond de la chambre et étalez-la uniformément pour créer une fine couche de cristaux de matrice. Assemblez le sublimateur. Et fixez les deux moitiés avec la pince en fer à cheval.

Suspendez l’unité assemblée à 15 à 20 centimètres au-dessus d’un bain de sable, préchauffé à 220 degrés Celsius, en le plaçant dans un anneau métallique relié à un support d’autoclave. Connectez la chambre à la source de vide, engagez le vide et laissez-le se stabiliser à environ 25 millitorr pendant cinq minutes. Remplissez le doigt de refroidissement avec de la glace et ajoutez 50 millilitres d’eau.

Laissez l’appareil se reposer pendant encore cinq minutes avant de continuer. Abaissez la chambre sur la surface du support, en vous assurant que le sable entre complètement en contact avec le fond de la chambre. Laissez-le pendant 45 minutes pour créer un revêtement idéal de 0,22 milligramme par centimètre carré.

Après 45 minutes, retirez la chambre du bain de sable en soulevant l’anneau métallique et aérez la chambre. Une fois sublimée, montez la lame d’échantillon à l’intérieur du haut de la chambre à vapeur précédemment construite, comme précédemment. Pipeter soigneusement 600 microlitres d’une solution contenant un mélange volume pour volume d’acétonitrile et d’acide trifluoroacétique dans l’eau sur le papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri pour assurer un revêtement uniforme.

Ensuite, assemblez la chambre, en vous assurant que la languette de papier et la lame du microscope s’alignent parfaitement. Laissez la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Numérisez la diapositive dans un scanner à plat pour créer une image numérique.

Chargez l’échantillon dans le spectromètre de masse, puis analysez-le à l’aide de la plate-forme logicielle appropriée. Enfin, analysez les échantillons comme décrit dans le protocole texte. On voit ici un échantillon de tissu correctement traité qui a été imagé à 50 microns et montre une bonne macrostructure et une nette différence entre la matière blanche et la matière grise.

Des échantillons comparés avec succès montreront une différenciation claire à différents endroits des tissus. Ici, il y a une région claire de régulation positive du peptide représentée par un rapport masse/charge de 1,085 dans la région de la substance blanche, représentée par les régions blanches. En revanche, cet échantillon mal préparé montre un niveau de délocalisation à grande échelle.

Les motifs des molécules présentes dans les trois panneaux démontrent clairement qu’il n’y a pas de définition claire entre les régions biologiques ou de différences dans l’abondance des molécules affichées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne idée de la façon de préparer vos propres échantillons pour l’analyse de l’imagerie peptidique. Avec une procédure appropriée, cette méthode peut être effectuée en huit heures sur deux jours, ce qui permet une étape de digestion pendant la nuit.

Lors de la préparation de cette méthodologie, il est important d’y prêter attention à chaque étape. Tout dommage physique qui arrive au tissu détruira les informations spatiales contenues dans votre échantillon. Nous avons eu l’idée de cette méthodologie lorsque nous avons commencé nos propres enquêtes spatiales IMS et que nous nous sommes rendu compte qu’il n’y avait pas d’autres méthodologies définitives qui étaient publiées.

Avec de petites modifications, notre méthodologie peut être appliquée à l’analyse des protéines, des peptides, des lipides et d’autres petites molécules. Suite à cette procédure, d’autres techniques histologiques telles que l’immunofluorescence et la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine peuvent ensuite être appliquées à votre échantillon afin d’obtenir un point de référence pour vos données d’imagerie par spectrométrie de masse. Lorsque vous travaillez avec des produits chimiques potentiellement explosifs, tels que la nitrocellulose liquide, il est important de maintenir les procédures de sécurité correctes.

Il est essentiel de minimiser les volumes de travail et d’éliminer immédiatement vos déchets.