Name: Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Apprenez une méthode reproductible de préparation de tissus fixés au formol pour l'imagerie par spectrométrie de masse de peptides. Cette technique simple permet aux débutants de développer efficacement leurs propres protocoles d'analyse.

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Les auteurs tenons à remercier la Fondation école médicale de Sydney et le Blues et la Fondation pour financer la partie de ce travail par le biais de leur programme de bourses de doctorat pour la recherche de la maladie d’Alzheimer et une subvention à la découverte de l’ARC (DP160102063) attribué à PKW.

ATTENTION : Toutes les précautions de sécurité en vigueur devraient suivre lors de l’exécution de cette procédure, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié (PPE) (p. ex., les sarraus de laboratoire, gants en nitrile, lunettes de sécurité, etc.)
1. préparation des réactifs et du matériel
<ol><li>
Préparation des solutions
	<ol>
<li>Pour préparer 500 mL de liquide de Carnoy, mélanger 100 % éthanol (EtOH), le chloroforme et acide acétique glacial dans un 6 : rapport de 3:1 v/v/v dans une bouteille propre Schott.</li>
		<li>Pour rendre liquide nitrocellulose (NC), dissoudre membrane NC (couramment utilisé en western blot) dans de l’acétone pur, par agitation douce, à une concentration finale de 40 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de diapositives NC enduit
	<ol>
<li>Utilisation d’une technique similaire à celle utilisée pour la préparation du sang frottis pour examen histologique20 préparer NC enduit diapositives.</li>
		<li>Distribuer 40 µL de liquide NC sur une arête d’une lame de microscope d’oxyde d’étain (ITO) conducteur d’indium. À l’aide d’une lame de microscope de verre ordinaire, faites glisser la NC sous tension superficielle sur la diapositive pour créer un revêtement mince même.</li>
		<li>Permettre la NC sécher à température ambiante pendant 20 s et puis magasin jusqu'à ce que nécessaire à la température ambiante. Conservation des échantillons en vertu de ces conditions peut être indéfinie, pourvu que les tissus sont maintenues et exempt de poussière. Remarque : Cette méthode de préparation est mieux connu sous le nom de « couches minces » et va produire un revêtement uniform qui dépend de la viscosité de la NC ainsi que son manque de tension superficielle s’autoniveler sur la diapositive. Les soins seul qu’il faut alors préparer les diapositives pas bouge trop vite, ce qui créeront des stries de NC plutôt que d’une couverture complète. ATTENTION : Comme liquide NC sèche très vite, il est essentiel de travailler rapidement pour éviter la solution de séchage avant il a été correctement étalé. Aussi être prudent lorsque manipulation NC à l’état liquide, telle qu’elle est un composé hautement énergétique et ne doit pas toucher une source d’inflammation pour prévenir l’explosion incendiaire. NC subit aussi une transition endothermique lorsque séchage et peut causer des brûlures de froids si autorisés à entrer en contact prolongé avec la peau ou les mains gantées. Afin de minimiser tous risques, que de faibles quantités doivent être préparées à chaque fois (< 1 mL est recommandé). Une fois sec, il est stable à température ambiante. Cependant, NC peut rester explosif lorsqu’il est présent en grande quantité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Création des chambres de vapeur personnalisé
	<ol>
<li>Couper un morceau de papier buvard épais avec une paire de ciseaux assez grand pour s’adapter à la partie inférieure la moitié d’un plat de Pétri plastique standard (94 mm de diamètre et 3 mm d’épaisseur).</li>
		<li>Couper le papier, en laissant une bande rectangulaire dans le centre, la même taille qu’une lame de microscope, laissant assez de surplus pour que le document conserve sa position dans la boîte de Pétri (supplémentaire Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation des coupes de tissus
<ol><li>
FFIP tissu21.
	<ol>
<li>Sélectionnez le bloc de tissu désiré et la section à 12 µm d’épaisseur dans un banc standard monté microtome et flotteur monture sur la NC pré-enrobé ITO diapositives.</li>
		<li>Plonger les lames dans le xylène douce pour enlever la paraffine résiduelle pendant 2 min et répéter l’opération une seconde fois. Remarque : Si le bloc de paraffine est particulièrement envahissant ou le tissu est relativement faible par rapport au bloc de paraffine, les échantillons peuvent être chauffés à 60 ° C pour faire fondre la majorité loin avant le lavage dans le xylène.</li>
		<li>Laver les échantillons déparaffinées en immergeant les lames dans une série graduée de solvant : 70 % v/v EtOH/eau, 100 % EtOH, de Carnoy fluide, 100 % EtOH, eau ultra pure et 100 % EtOH. La durée de chaque immersion devrait être de 30 s, à l’exception de fluide de Carnoy, qui doit durer 2 min. ATTENTION : De Carnoy fluide et xylène doivent être stockés et utilisés dans une hotte de laboratoire, car ils sont très toxiques par inhalation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tissus fixés au formol congelés (FFF) Remarque : Les échantillons déjà, doivent être gelés appropriée selon le type d’échantillon.<ol>
<li>Equilibrer le bloc de tissu à la température de fonctionnement du microtome pour 20 min22. Remarque : La température de l’équilibration est dépendante du type de tissu.</li>
		<li>Section le tissu à l’aide d’un microtome à 12 µm et dégel montage les sections sur un NC pré-préparés enduit ITO glisser.</li>
		<li>Stocker les diapositives dans un dessiccateur à vide sur le banc dans l’obscurité. Remarque : Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines dans ces conditions.</li>
		<li>Laver les échantillons en une série de solvant classée comme indiqué pour tissu FFPE (2.1.3). Remarque : Il n’est pas nécessaire pour une étape de deparaffinisation de xylène que l’échantillon n’est pas incorporée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. méthylène Crosslink hydrolyse
<ol><li>Charger les lames de l’échantillon (FFF ou FFIP) dans une boîte en plastique de glissière qui est remplie de 20 mmol tris-HCl (pH 8,8) vers le haut. Scellez la boîte et le placer dans un bain d’eau contenant 500 mL d’eau, ce qui permet de la boîte à toucher le fond. Puis chauffer pendant 15 min à 120 ° C dans une marmite à pression qui peuvent atteindre une pression de 70 kPa.</li>
	<li>Supprimer les diapositives, laissez-les refroidir et laissez-les sécher à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
</ol>4. tissu Digestion
<ol><li>Une fois hydrolysée, enduire les échantillons avec 10 µL de solution de trypsine (1 mg/mL) dans l’eau ultra pure, par pipetage 10 µL de la solution sur le bord de la partie de tissu et ensuite, en utilisant la même pipette, faites glisser la gouttelette sur toute la surface du tissu sous la surface tension. Remarque : Ne pas rayer la surface du tissu avec l’embout de la pipette et de répandre l’enzyme au-delà des frontières des bords des tissus.</li>
	<li>Laisser les échantillons à sécher à température ambiante.</li>
	<li>Une fois sec, montez les échantillons à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits (tissus vers le bas) avec ruban autoclave sur chaque bord de la lame (complémentaire Figure 2).</li>
	<li>Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 v/v de 100 % d’acétonitrile et de 50 mM d’ammonium bicarbonate soigneusement sur le doigt de papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri, jusqu'à ce que le doigt semble être uniformément humide.</li>
	<li>Placez la moitié supérieure de la chambre de vapeur sur le fond la moitié, s’assurant de la diapositive de doigt et échantillon de papier aligner parfaitement et sceller la chambre autour de son Équateur avec film de paraffine.</li>
	<li>Laisser l’échantillon du jour au lendemain dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une digestion complète.</li>
</ol>5. matrice revêtement par Sublimation
<ol><li>Une fois digéré, peser la lame échantillon sur un équilibre microanalytiques à 5 chiffres.</li>
	<li>Monter le glisser sur le doigt de refroidissement de l’appareil de sublimation et fixez-le avec du ruban de cuivre, de la même manière comme pour la chambre de vapeur (supplémentaire Figure 3). Remarque : Pour vous assurer que la lame est contactée uniformément par le doigt de refroidissement, une couche de ruban de cuivre est placée sur le fond du doigt refroidissement pour niveler la surface. Cela garantit que la diapositive est uniformément froid qui mène au même dépôt de matrice.</li>
	<li>Placer 300 mg de matrice de α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) dans un plat de Pétri de verre au fond de la chambre et la propagation uniformément pour créer une fine couche de cristaux de matrice.</li>
	<li>Assembler le sublimator et fixer les deux moitiés avec le collier de fer à cheval. Suspendre l’appareil assemblé 15-20 cm au-dessus d’un bain de sable, préalablement chauffé à 220 ° C, en le plaçant dans un anneau métallique relié à un statif.</li>
	<li>Connecter la chambre à la source de vide, engager le vide et laissez-le se stabiliser vers le bas pour ~ 25 mTorr pendant 5 min.</li>
	<li>Emballez le doigt de refroidissement vers le haut avec de la glace et ajouter 50 mL d’eau. Laissez l’appareil se contenter d’un autre 5 minutes avant de procéder.</li>
	<li>Abaissez la chambre sur la surface du sable, assurant le sable entre complètement en contact avec le fond de la chambre et laissez-le pendant 45 min créer un revêtement idéal de 0,22 mg/cm2 ATTENTION : Il faut quand manutention verrerie à vide poussé, comme des dommages à l’appareil, alors que les évacués, peut entraîner une défaillance catastrophique de la chambre de verre.</li>
	<li>Après 45 min, enlevez la chambre depuis le bain de sable en soulevant la bague métallique et aérer la chambre. Remarque : Une fois que la chambre a été vidée, la lame doit être enlevée très rapidement que l’eau dans l’air commence à se condenser sur la diapositive de doigt et échantillon de gel.</li>
	<li>Retirer la glissière et pesez-le afin d’assurer le revêtement désiré a été atteint. Remarque : Si le revêtement insuffisant ont été réalisé, répétez simplement le processus de sublimation pour la diapositive jusqu'à ce que l’épaisseur du revêtement désiré a été atteint.</li>
</ol>6. recristallisation
<ol><li>Une fois sublimée, monter la lame de l’échantillon à l’intérieur de la partie supérieure de la chambre de vapeur déjà construits, comme antérieure décrite (tissus vers le bas).</li>
	<li>Distribuer 600 µL d’une solution contenant un mélange de 1:1 (v/v) de 100 % d’acétonitrile et de 0,1 % v/v d’acide trifluoroacétique dans l’eau avec précaution sur le papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri pour assurer une couche uniforme.</li>
	<li>Assembler la chambre, assurant la glissière de microscope et onglet papier aligner parfaitement et laisser dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h. ATTENTION : Ne pas assurer l’étanchéité la chambre. Remarque : Une fois recristallisée, la teinte jaune normalement de la matrice devrait changer en blanc, regarder moins brillante et apparaissent très même. Ceci indique que recristallisation a été effectuée correctement.</li>
	<li>L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse.</li>
</ol>7. instrumentation
<ol><li>Scan de la lame dans un scanner à plat pour créer une image numérique.</li>
	<li>Charger l’échantillon dans le spectromètre de masse et à analyser à l’aide de la plate-forme de logiciels appropriés.</li>
	<li>Analyse des échantillons en mode réflectron ion positif avec une gamme de masses de 750-3 500 Da, avec une résolution spot qui s’applique au résultat souhaité. Dans la plupart des cas, 20 à 50 µm raster largeur est suffisante, mais aussi peu que 10 µm peut être utilisé15. ATTENTION : Les lasers UV MALDI sont une source de rayonnement ionisant et ne doivent pas être lus directement. Veiller à ce que le laser est contenu au sein de l’instrument blindage avant l’opération.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts ou des intérêts commerciaux de divulguer

Ce protocole a été conçu pour maximiser la génération des espèces moléculaires ionisables tout en éliminant les délocalisation d’analytes. Les principaux facteurs impliquent en utilisant le même principe primordial lors de l’application de matrice, digérer l’échantillon ou recristalliser après sublimation24; savoir, qu’un même dépôt de vapeur, de matrice ou autrement, doit être créée et maintenue. Pipetage solvants nettoyants pour recristallisation et digestion, uniformément sous l’échantillon, em...

Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) d’imagerie a été employée comme technique d’image basé pendant deux décennies1,2, analyser une gamme de biomolécules, y compris : lipides3, peptides2 ,4, protéines2,5, métabolites6,7, N-glycans8et des molécules synthétiques tels que les médicaments thérapeutiques9,10. Le nombre de publications démontrant l’utilité de cette technique ont fortement augmenté au cours de la dernière décennie6,11,12,13. Certaines molécules, comme les lipides, sont relativement faciles à analyser par MALDI MSI, comme ils ionisent facilement en raison de leur nature chimique et nécessitent peu de préparation à l’avance3. Toutefois, pour des cibles plus difficiles comme les peptides, les étapes requises pour ioniser efficacement ces molécules sont vastes et généralement compliqué14. Il y a actuellement très peu de publications qui visent à répondre ou à démontrent la reproductibilité dans les méthodologies utilisées pour préparer les tissus à cette technique visuelle unique15. Pour cette raison, nous avons compilé les observations et mises en oeuvre des optimisations en un seul, facile à implémenter, méthodologie ne nécessite peu ou aucun modifications, pour l’analyse des peptides d’un formaldéhyde que réticulé tissu source14.
Dans ce manuscrit, nous avons décrit une méthodologie reproductible validée, à faible coût pour la détection et la cartographie spatiale des peptides, produit des surgelés fixés au formol (FFF) et fixés au formol des sections de tissu (FFIP) inclus en paraffine. Cette méthodologie ne nécessitent ni s’appuyer sur une instrumentation spécialisée3. Plus précisément, nous abordons les nombreux aspects de la préparation de l’échantillon spécialisées nécessaire pour analyser les peptides ; étapes comme antigène récupération16 et revêtement de matrice. Notre protocole utilise aussi peu coûteux matériel et réactifs, ce qui rend cette méthode accessible à toute une communauté qui autrement seraient incapable de payer l' autre appareils robotisés17.
Le raisonnement qui sous-tend l’élaboration d’une méthode de préparation d’échantillon manuel comportait deux volets : Premièrement, l’utilisation d’un sublimator crée un revêtement uniforme et homogène des cristaux de matrice qui sont environ 1 µm de longueur18, quelque chose d’irréalisables avec arrosage plus fréquent techniques. Deuxièmement, l’ensemble relativement faible des coûts : le coût total de l’appareil de mesure était < 1500 $ AUD. Nous notons, en termes de rapport coût-efficacité, que le prix par exemple est beaucoup moins cher quand il n’y a aucun mécanisme robotique impliqué. L’utilisation de sublimation a été signalée précédemment, cependant, au meilleur de nos connaissances, des méthodes pas à pas qui décrivent ce processus et préparation des échantillons n’ont pas été signalés ni décrits dans la littérature.
Ce protocole vise à aider les chercheurs qui ont accès à un spectromètre de masse MALDI et qui ont l’intention sur le développement de l’information spatiale en relation avec une bio-molécule d’intérêt19. En substance, MALDI MSI est une forme de histologique préalable qui ne s’appuie pas sur les anticorps ou taches2.

<table><tbody><tr><td>Cryo Microtome</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Lames de microscope à l’oxyde d’indium et d’étain</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Coplin Pots</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5516</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Autocuiseur</td><td>Kambrook</td><td>KPR620BSS</td><td>Pour la préparation et la section des tissus.</td></tr><tr><td>Sublimator</td><td>Chem Glass</td><td>NA</td><td>Pour la procédure de sublimation. De conception similaire à celle du CG-3038, il a cependant été fabriqué sur mesure.</td></tr><tr><td>Bain de sable</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Pour la procédure de sublimation. Sable de rivière de qualité fine maintenu dans une feuille d’aluminium pliée provenant de l’extérieur et non d’une entreprise spécifique</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165100</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Pour la procédure de sublimation. Provenant en pièce détachée d’un vieux spectromètre de masse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Piège à froid</td><td>Chem Glass</td><td>CG-4510-02</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>John Morris</td><td>EW-15956-32.&nbsp ;</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en plastique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z717223</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>37 &deg ; C INCUBATEUR</td><td>N.A.O</td>. <td>Pour</td><td>la procédure de sublimation. Sans objet, l’incubateur est non stérile et âgé de plus de 30 ans.</td></tr><tr><td>Papier buvard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7796</td><td>Pour la procédure de sublimation.</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8395</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.02428</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Pour le lavage des lames. Fabriqué en laboratoire à partir de 95 % d’éthanol stock.</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Pour le lavage des lames.</td></tr><tr><td>Tris HCL pH 8,8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>Pour le clivage protéolytique. Poudre fabriquée à 1M suivie d’un équilibrage avec 32 % HCl à PH 8.8</td></tr><tr><td>Milli Q Eau ultra-pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NA</td><td>Pour le clivage protéolytique. Purification réalisée en interne par le système de purification de l’eau sartorique</td></tr><tr><td>Ammonium Bircarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Pour le clivage protéolytique.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0303</td><td>Pour le clivage protéolytique.</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2020</td><td>Pour la recristallisation.</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00029</td><td>Pour la recristallisation.</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>Pour la recristallisation.</td></tr></tbody></table>

une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging workflows

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

L’utilisation de désorption-ionisation laser assistée par matrice, spectrométrie de masse (MALDI MSI) d’imagerie a rapidement élargi, car cette technique analyse une foule de biomolécules de médicaments et de lipides à N-glycans. Bien qu’il existent de différentes techniques de préparation d’échantillon, détection des peptides de formaldéhyde préservé des tissus reste l’un des défis plus difficiles pour ce type d’analyse par spectrométrie de masse. Pour cette raison, nous avons créé et optimisé une méthodologie robuste qui conserve les informations spatiales contenues dans l’échantillon, tout en suscitant le plus grand nombre de peptides ionisables. Nous avons visait également à atteindre cet objectif de manière simple et rentable, éliminant ainsi l’erreur potentielle de partialité ou de la préparation, qui peut se produire lorsque l’utilisation automatisée instrumentation. Le résultat final est un protocole reproductible et peu coûteux.

Si suivies correctement, ce protocole produit des images qui représentent clairement la morphologie générale du tissu sans les égratignures ou autres déformations (Figure 1). La validation idéale pour une préparation de l’échantillon correctement exécutée, est la capacité de distinguer entre les différentes structures physiques en changeant la molécule étant lus (Figure 2).
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Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour la préparation axée sur la sublimation du formol fixé tissu destiné à la spectrométrie de masse d’imagerie.

Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer de manière reproductible un échantillon de tissu pour l’imagerie par spectrométrie de masse peptidique. Cette méthode permet aux utilisateurs novices de la spectrométrie de masse de développer leurs propres flux de travail de spectrométrie de masse d’imagerie sans passer par de longues déterminations empiriques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est hautement reproductible, simple à mettre en œuvre et utilise des méthodologies rentables.Pour préparer les lames recouvertes de nitrocellulose, pipetez 40 microlitres de nitrocellulose liquide sur un bord de la lame de microscope conductrice d’oxyde d’indium et d’étain. À l’aide d’une lame de microscope en verre ordinaire, faites glisser la nitrocellulose sous tension superficielle sur la lame pour créer un revêtement uniforme en couche mince. Laissez la nitrocellulose sécher à température ambiante pendant 20 secondes, puis conservez-la jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à température ambiante.Ensuite, créez des chambres à vapeur personnalisées en découpant un morceau de papier buvard épais suffisamment grand pour s’adapter à la moitié inférieure d’une boîte de Pétri en plastique standard. Coupez le papier pour laisser une bande rectangulaire au centre de la même taille qu’une lame de microscope. Laissez suffisamment d’excédent pour que le papier maintienne sa position dans la boîte de Pétri.Pour les tissus FFPE, montez les sections sur les lames ITO pré-revêtues de nitrocellulose comme décrit dans le protocole texte. Immergez les lames dans du xylène frais pour éliminer la paraffine résiduelle pendant deux minutes. Lavez les échantillons déparaffés en immergeant les lames dans une série de solvants gradués composée d’une solution d’eau d’éthanol à 70 % en volume, suivie d’une solution d’éthanol à 100 %, pendant 30 secondes.Ensuite, immergez les lames dans le liquide de Carnoy pendant deux minutes. Enfin, immergez les lames dans une série de 100 % d’éthanol, d’eau ultrapure et de 100 % d’éthanol à nouveau, pendant 30 secondes. Chargez les lames d’échantillon dans une boîte à lames en plastique qui est remplie jusqu’en haut de 20 millimolaires de tris HCO.Fermez la boîte et placez-la dans un bain-marie contenant 500 millilitres d’eau, permettant à la boîte de toucher le fond du bain. Ensuite, chauffez la boîte pendant 15 minutes à 120 degrés Celsius dans un autocuiseur, ce qui peut atteindre une pression de fonctionnement de 70 kilopascals. Retirez les lames, laissez-les refroidir et laissez-les sécher à température ambiante pendant 15 minutes.Une fois hydrolysé, enduisez les échantillons avec 10 microlitres de solution de trypsine dans de l’eau ultrapure en pipetant d’abord 10 microlitres de la solution sur le bord de la section de tissu. Ensuite, à l’aide de la même pointe de pipette, faites glisser la gouttelette sur toute la surface du tissu sous tension superficielle. Après avoir laissé sécher les échantillons à température ambiante, montez-les à l’intérieur du haut de la chambre à vapeur préalablement construite avec du ruban adhésif autoclave sur chaque bord de la lame.Pipetez soigneusement 600 microlitres d’une solution contenant un mélange volume pour volume de 100 % d’acétonitrile et de 50 millimolaires de bicarbonate d’ammonium sur le doigt de papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri, jusqu’à ce que le doigt semble être uniformément humide. Le pipetage est d’une importance cruciale, car un pipetage incorrect entraînera la délocalisation de votre matrice et de vos analoïdes de surface, ce qui détruira les informations spatiales contenues dans votre échantillon. Placez la moitié supérieure de la chambre à vapeur sur la moitié inférieure, en veillant à ce que le doigt de papier et la lame d’échantillon s’alignent parfaitement, et scellez la chambre autour de son équateur avec un film de paraffine.Laissez l’échantillon toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre une digestion complète. Une fois digérée, laissez la lame d’échantillon sur une balance microanalytique à cinq chiffres. Montez la glissière sur le doigt de refroidissement de l’appareil de sublimation et fixez-la avec du ruban de cuivre de la même manière que décrite pour la chambre à vapeur.Placez 300 milligrammes de matrice CHCA dans une boîte de Pétri en verre au fond de la chambre et étalez-la uniformément pour créer une fine couche de cristaux de matrice. Assemblez le sublimateur. Et fixez les deux moitiés avec la pince en fer à cheval.Suspendez l’unité assemblée à 15 à 20 centimètres au-dessus d’un bain de sable, préchauffé à 220 degrés Celsius, en le plaçant dans un anneau métallique relié à un support d’autoclave. Connectez la chambre à la source de vide, engagez le vide et laissez-le se stabiliser à environ 25 millitorr pendant cinq minutes. Remplissez le doigt de refroidissement avec de la glace et ajoutez 50 millilitres d’eau.Laissez l’appareil se reposer pendant encore cinq minutes avant de continuer. Abaissez la chambre sur la surface du support, en vous assurant que le sable entre complètement en contact avec le fond de la chambre. Laissez-le pendant 45 minutes pour créer un revêtement idéal de 0,22 milligramme par centimètre carré.Après 45 minutes, retirez la chambre du bain de sable en soulevant l’anneau métallique et aérez la chambre. Une fois sublimée, montez la lame d’échantillon à l’intérieur du haut de la chambre à vapeur précédemment construite, comme précédemment. Pipeter soigneusement 600 microlitres d’une solution contenant un mélange volume pour volume d’acétonitrile et d’acide trifluoroacétique dans l’eau sur le papier buvard dans la partie inférieure de la boîte de Pétri pour assurer un revêtement uniforme.Ensuite, assemblez la chambre, en vous assurant que la languette de papier et la lame du microscope s’alignent parfaitement. Laissez la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Numérisez la diapositive dans un scanner à plat pour créer une image numérique.Chargez l’échantillon dans le spectromètre de masse, puis analysez-le à l’aide de la plate-forme logicielle appropriée. Enfin, analysez les échantillons comme décrit dans le protocole texte. On voit ici un échantillon de tissu correctement traité qui a été imagé à 50 microns et montre une bonne macrostructure et une nette différence entre la matière blanche et la matière grise.Des échantillons comparés avec succès montreront une différenciation claire à différents endroits des tissus. Ici, il y a une région claire de régulation positive du peptide représentée par un rapport masse/charge de 1,085 dans la région de la substance blanche, représentée par les régions blanches. En revanche, cet échantillon mal préparé montre un niveau de délocalisation à grande échelle.Les motifs des molécules présentes dans les trois panneaux démontrent clairement qu’il n’y a pas de définition claire entre les régions biologiques ou de différences dans l’abondance des molécules affichées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne idée de la façon de préparer vos propres échantillons pour l’analyse de l’imagerie peptidique. Avec une procédure appropriée, cette méthode peut être effectuée en huit heures sur deux jours, ce qui permet une étape de digestion pendant la nuit.Lors de la préparation de cette méthodologie, il est important d’y prêter attention à chaque étape. Tout dommage physique qui arrive au tissu détruira les informations spatiales contenues dans votre échantillon. Nous avons eu l’idée de cette méthodologie lorsque nous avons commencé nos propres enquêtes spatiales IMS et que nous nous sommes rendu compte qu’il n’y avait pas d’autres méthodologies définitives qui étaient publiées.Avec de petites modifications, notre méthodologie peut être appliquée à l’analyse des protéines, des peptides, des lipides et d’autres petites molécules. Suite à cette procédure, d’autres techniques histologiques telles que l’immunofluorescence et la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine peuvent ensuite être appliquées à votre échantillon afin d’obtenir un point de référence pour vos données d’imagerie par spectrométrie de masse. Lorsque vous travaillez avec des produits chimiques potentiellement explosifs, tels que la nitrocellulose liquide, il est important de maintenir les procédures de sécurité correctes.Il est essentiel de minimiser les volumes de travail et d’éliminer immédiatement vos déchets.

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