Un test pour identifier les agonistes des récepteurs couplés aux protéines G, antagonistes et MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES cinétiques basés sur la Fluorescence Ca^{2 +} mobilisation

L’objectif global de ce test cellulaire est d’identifier et de caractériser des molécules capables de stimuler ou d’inhiber la mobilisation intracellulaire du calcium médiée par les récepteurs couplés aux protéines G. Cette méthode peut être un test précieux pour la découverte de médicaments à récepteurs couplés aux protéines G, car elle peut être utilisée pour dépister des molécules qui modifient les corps calciques intracellulaires médiés par les récepteurs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier des molécules aux propriétés agonistes ou antagonistes au sein d’un même dosage.

Ce test pourrait contribuer à la découverte de nouveaux candidats-médicaments qui agissent sur les récepteurs couplés aux protéines G, des cibles thérapeutiques prometteuses qui jouent un rôle dans de nombreuses maladies humaines. Le jour du passage des cellules, enduire chaque puits d’une plaque de polystyrène à 96 puits à paroi noire à fond transparent avec 100 microlitres de solution de gélatine à 0,1 % et incuber les plaques pendant deux heures à température ambiante. Pendant que la gélatine se solidifie, utilisez une solution de trypsine EDTA pour soulever les cellules d’intérêt du fond de leur flacon de culture, en les remettant en suspension dans un milieu de croissance frais dans un tube conique de 50 millilitres une fois qu’elles se sont détachées.

Après le comptage, collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans un milieu de croissance frais à une fois 10 à la cinquième cellule viable par millilitre de concentration. Lorsque les plaques sont prêtes, jetez tout excès de solution de gélatine et séchez-les sur un mouchoir de laboratoire. Ensuite, lavez les puits avec 200 microlitres de PBS et remplacez le lavage par 200 microlitres de cellules par puits pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain matin, tapotez l’assiette pour jeter le milieu de croissance des puits et séchez l’assiette à l’envers sur une serviette en papier. Étiquetez ensuite les cellules de chaque puits avec 100 microlitres de solution de colorant de chargement par puits et incubez la plaque pendant 45 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Pendant que les cellules sont en incubation, ajoutez 75 microlitres de CXCL12 par puits dans la plaque de chimiokine et 50 microlitres du composé d’intérêt dans chaque puits de la plaque composée.

Ensuite, allumez l’unité de refroidissement du lecteur de plaques à fluorescence, puis le lecteur de plaques lui-même. Après avoir laissé le système démarrer pendant quelques minutes, ouvrez le logiciel du lecteur de plaques. Pour configurer le protocole de test, sous l’onglet Paramètres, sélectionnez le mode de lecture et les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées pour le colorant de chargement.

Sélectionnez le mélange avec la languette de fluide de transfert pour le mélange automatique des composés dans la plaque de composé. Dans l’onglet du fluide de transfert, placez 20 microlitres de chaque puits de la plaque composée à transférer dans la plaque de mesure et positionnez les pointes de pipette à 20 microlitres sous la surface du liquide. Réglez la vitesse d’aspiration à 50 microlitres par seconde et la vitesse de distribution à 25 microlitres par seconde et cliquez sur la lecture avec le fluide de transfert.

Au cours du premier intervalle, sélectionnez 60 lectures avec un intervalle de lecture d’une seconde avec 10 lectures à enregistrer avant que les composés ne soient distribués dans la plaque de mesure et 50 lectures à terminer après. Définissez le deuxième intervalle avec un intervalle de lecture de 30 secondes et 18 lectures. Sélectionnez trois lavages à pointes pour le protocole, en réglant chaque étape de lavage pour inclure le liquide de lavage approprié, un cycle de lavage, une vitesse de pompe rapide et cinq coups par lavage.

Utilisez la fonction pause de la pipette pour inclure la pause de 300 secondes et utilisez le réglage de mélange avec fluide de transfert pour permettre le mélange automatique de la solution CXCL12 dans la plaque de chimiokine. Dans la languette de fluide de transfert suivante, placez 25 microlitres de chaque puits de la plaque de chimiokine à transférer sur la plaque de mesure et positionnez les pointes à 20 microlitres sous la surface du liquide. Réglez la vitesse d’aspiration à 50 microlitres par seconde et la vitesse de distribution à 25 microlitres par seconde.

Utilisez le bouton de lecture avec fluide de transfert pour régler le premier intervalle afin qu’il inclue 145 lectures avec un intervalle de lecture d’une seconde. Définissez le deuxième intervalle sur un intervalle de lecture de six secondes et 20 lectures. Sélectionnez trois autres cycles d’embouts de lavage.

Cliquez ensuite sur régler la température de la scène et réglez la température de l’appareil sur 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation du colorant de chargement, jetez le tampon de la plaque de mesure et séchez-la sur un tissu de laboratoire. Lavez les cellules avec 150 microlitres par puits de tampon de dosage, en remplaçant le tampon par 80 microlitres de tampon de dosage après deux minutes.

Placez la plaque de mesure en position de lecture, la plaque composée à la position de la source deux, la plaque de chimiokine à la position de la source trois et une boîte d’embouts noirs à la position de la source un. Fermez l’appareil et cliquez sur le protocole test de signal pour déterminer les unités de lumière relatives de fond et la variance de fluorescence sur la plaque. Sélectionnez tester le signal dans la fenêtre contextuelle.

Si des valeurs d’arrière-plan de 8 000 à 10 000 unités de lumière relatives sont obtenues, sélectionnez mettre à jour et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer le protocole principal. Appuyez ensuite sur exécuter pour démarrer le test. Dans ce graphique, on peut observer une augmentation dose-dépendante de la fluorescence corrélée à l’augmentation dose-dépendante de la libération de calcium.

L’augmentation des niveaux de fluorescence induite par CXCL12 permet de générer une courbe dose-réponse basée sur la différence entre la réponse minimale et maximale au-dessus de la ligne de base entre la première mesure après l’ajout de la chimiokine et la mesure finale dans le protocole. Aucune réponse liée au calcium fluorescent n’a été évoquée par CXCL12, même à une concentration élevée, lorsque des cellules dépourvues du récepteur fonctionnel de chimiokine CXCR4 correspondant ont été utilisées, démontrant la spécificité du récepteur de la mesure évoquée par CXCL12. L’une des principales applications de ce test cellulaire consiste à identifier de petites molécules qui, après la pré-incubation, inhibent en fonction de la dose la mobilisation du calcium induite par CXCL12 dans les cellules, par rapport aux composés non actifs témoins qui n’inhibent pas la réponse.

Pour déterminer le pouvoir inhibiteur des petites molécules, une courbe dose-réponse peut être générée pour les molécules inhibitrices à l’aide d’une régression non linéaire. Ce test peut être utilisé pour étudier d’autres récepteurs couplés aux protéines G sans optimisation supplémentaire ou avec une optimisation supplémentaire minime, ainsi que dans cette expérience dans laquelle une augmentation dose-dépendante de la fluorescence a été observée lorsqu’un autre récepteur de chimiokines, CCR5, a été stimulé avec son agoniste naturel des chimiokines CCL5. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier de nombreux autres récepteurs couplés aux protéines G qui signalent via la mobilisation des ions calcium intracellulaires lors de l’activation du récepteur.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont ce test cellulaire peut être utilisé pour identifier les agonistes et les antagonistes du récepteur des chimiokines CXCL4.