Name: Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez l'identification de peptides spécifiques du virus Zika pour le diagnostic par microarray de peptides à haute densité. Cette méthode détecte les anticorps IgM et IgG pour établir la chronologie de l'infection.

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Actuel est confortée par une subvention de supplément administratif SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Concession de NIDCR VIH qui a évolué hors subvention NIDCR U01 DE017855 pour le développement d’un diagnostic de point-of-care confirmation pour le VIH. Nous remercions sincèrement Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) pour son assistance technique et de soutien. Nous remercions également NYU Langone Medical Center pour les LI-COR Odyssey Imaging System.

Ces données font partie d’une étude en cours menée au Collège de dentisterie de l’Université de New York et ont été approuvées par l’Institutional Review Board de la New York University School of Medicine, la CISR # H10-01894. Les échantillons cliniques utilisées dans cette étude ont été dépersonnalisées échantillons précédemment utilisés pour le diagnostic et avec la permission de la Wadsworth Center de New York State Department of Health, Albany, NY.
1. installation de la coulisse de Microarray peptides ZIKV haute densité dans un bac spécifique d’Incubation
<ol><li>Gérer la lame de verre par les bords à l’aide de gants sans poudre. Les dimensions de lame de verre sont 75,4 mm par 25,0 mm et 1 mm d’épaisseur. Placez la diapositive dans le bac de l’incubation avec la surface de la puce vers le haut.</li>
	<li>Placez le côté brillant du joint vers le bas sur la surface imprimée de microarray. Afin d’assurer une bonne position, recouvrir les trous de vis de la garniture et la plaque de base.</li>
	<li>Placer la partie supérieure de la barre d’État sur le sceau pour créer une chambre de microarray.</li>
	<li>Fixez la lame dans la barre d’État en serrant tout aussi les vis moletées l’un après l’autre à la main dans un modèle alternatif à partir de l’angle supérieur gauche, suivie en bas à droite. Placez le couvercle du bac à l’incubation.</li>
</ol>2. contexte Interaction Detection : Coloration la biopuce avec anticorps secondaires
Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards et de blocage, des anticorps secondaires dilués) dans le coin de la chambre de microarray.
<ol><li>Incuber les puces avec un tampon standard (1 x en solution saline tamponnée au Phosphate (PBS), 0,05 % de Tween 20, pH 7,4, filtré avec un filtre de 0,45 µm) (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirez le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray. Remplir porte-diapositive vide avec diapositives vides pour éviter la rupture de la diapositive de microarray.</li>
	<li>Bloquer la biopuce avec le tampon de blocage (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 60 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirer le tampon de blocage en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Incuber le microarray avec l’anticorps secondaire, fluorochrome d’IgM anti-humaine conjuguée, dilué 1:5 000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans la coloration de la mémoire tampon (10 % bloquant un tampon en mémoire tampon standard) pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/min.</li>
	<li>Supprimer l’anticorps secondaire en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Immerger la diapositive 2 x dans un tampon de plongement fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).</li>
	<li>Sécher la biopuce soigneusement, pendant environ 1 min, en aspirant l’excès de liquide très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement. Analyser la lame dans un scanner de microarray de lecteur.</li>
</ol>3. exposition de la biopuce pour héberger le sérum
ATTENTION : Pour effectuer cette étape dans des conditions de sécurité de laboratoire, niveau de biosécurité 2 (BSL-2) en raison de la nature infectieuse potentielle de l’échantillons de sérum. Travailler au sein d’une classe II hotte de sécurité biologique (BSC).
<ol><li>Inactiver l’échantillon de sérum à 56 ° C pendant 30 min et centrifuger à 16 000 FRC pendant 5 min à 4 ° C13. Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (coloration, tampon standard et du sérum dilué) dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Diluer l’échantillon de sérum dans un tampon coloration commençant par une dilution de 1 : 1 000 (volume total de 2 000 μL/microarray). Gardez-le à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Incuber la biopuce avec le tampon de coloration (volume total de 2 000 μL/microarray) pendant 15 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirer le tampon de coloration en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Incuber le microarray avec l’échantillon de sérum dilué pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirer l’échantillon de sérum dilué en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 μL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
</ol>4. la coloration avec des anticorps de contrôle marqués et des anticorps secondaires
Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards, secondaire dilué et anticorps de l’étiquette) dans le coin de la chambre de microarray.
<ol><li>Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration. NOTE : Fluorochrome de IgM anti-humain utilisation conjugués anticorps ou anti-humain fluorochrome conjugués anticorps à une dilution de 1:5,000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans un tampon de coloration.</li>
	<li>Anticorps de Mix contrôle étiquette (anticorps monoclonal anti-HA fluorochrome conjuguées) à une dilution de 1 : 1 000 (volume total des 2 000 µL/microarray) tampon de coloration avec l’anticorps secondaire préalablement diluée en souillant la mémoire tampon.</li>
	<li>Incubez avec la biopuce pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirez le mélange du secondaire dilué et anticorps de l’étiquette en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Laver 3 x avec un tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray). Chaque lavage est pendant 1 min dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
</ol>5. les biopuces à balayage
<ol><li>Immerger la diapositive 2 x dans le buffer à pendage fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).</li>
	<li>Sécher la biopuce soigneusement, environ 1 min, en aspirant très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement.</li>
	<li>Scan de la biopuce, suivant les instructions du scanner. Placez la lame sur le scanner avec la surface imprimée vers le haut.</li>
	<li>Créez un nouveau projet et sélectionnez la zone de lecture optique. Définir les paramètres du scanner comme : résolution : 21 µm, intensité pour 700 à 800 canaux nm : 7,0, qualité de numérisation : médium et Offset : 0,8.</li>
	<li>Acquérir et enregistrez l’image raw scan sous un format de fichier TIFF 16 bits en niveaux de gris.</li>
</ol>6. Microarray Analysis, à l’aide d’un logiciel spécifique
<ol><li>Ouvrez l’image brute (image TIFF). Ouvrez le fichier grid array.</li>
	<li>Aligner la grille de tableau à l’image du scan avec les touches de flèche souris ou le clavier de l’ordinateur.</li>
	<li>Sélectionnez « Quantifier la sélection » dans le logiciel spécifique, ce qui crée un fichier de lecture qui contient l’intensité du signal pour chaque tache, la valeur d’arrière-plan et la séquence peptidique correspondante. Remarque : Ce fichier de sortie peut également être importé dans un programme de feuille de calcul pour une analyse complémentaire et la représentation graphique.</li>
</ol>7. stockage de « microarray »
<ol><li>Stocker la biopuce scellée dans l’obscurité à 4 ° C sous oxygène-gaz azote ou argon gratuit.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons conçu un protocole utilisant un microarray peptides haute densité contenant la séquence entière de la protéine du virus Zika (souche polynésienne Français). La biopuce a été fabriquée par impression 3 423 différents peptides linéaires qui se chevauchent. Chaque peptide était 15 acides aminés et variait selon qu’un résidu de son voisin le plus proche dans la séquence (p. ex., résidus 14 chevauchement). Bien que chevauche plus courtes peut être imprimés, la cartographie des épitopes est plus précise des...

Diagnostic de virus (ZIKV) de zika basé sur les symptômes cliniques est difficile parce qu’elle partage des vecteurs, répartition géographique et des symptômes avec la Dengue et Chikungunya virus infection1. Étant donné le risque de résultats défavorables de la grossesse chez les femmes infectées par ZIKV pendant la grossesse, il est important de distinguer entre les 3 virus. Bien que les tests de diagnostics moléculaires actuels sont spécifiques, ils sont seulement utiles dans le sang ou la salive au cours de la période relativement courte de l’infection aiguë2,3. Analyses sérologiques sont essentiels pour le diagnostic en dehors de cette période initiale d’infection4.
Le développement d’un test sérologique spécifique de ZIKV est difficile pour deux raisons : tout d’abord, les antigènes de Zika répondant par le système immunitaire humain à ne sont pas actuellement connus ; et séquences d’acides aminés flavivirus seconde, conservée induisent la réactivité des anticorps. Notre objectif était de découvrir des peptides spécifiques ZIKV uniques à utiliser dans le diagnostic. Différentes approches ont été développées aux bibliothèques de peptide écran couvrant les protéines entières dont phage, bactérienne, et surface de levure afficher5,6,7,8,9, 10. Notre stratégie a consisté à utiliser un microarray peptides haute densité qui permet des projections de sérologique rapide et peu coûteuse haut débit11,12 , et par la suite les peptides identifiés peuvent être utilisés pour améliorer l’actuelle sérologique tests pour la détection de l’infection à ZIKV.
Ce protocole permet la découverte de Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray » (Figure 1). La biopuce peptide haute densité a été produite à l’aide de la technologie d’impression laser peptide. La séquence entière de protéine ZIKV composé de 3 423 résidus d’acide aminé issu de la souche polynésienne Français (GenBank : KJ776791.2), a été imprimé sur une lame de verre standard dans des blocs de 15 résidus linéaires avec un chevauchement de 14 acides aminés en double exemplaire pour une total de 6 846 taches de peptide. Outre les peptides de séquence protéique Zika entières, la biopuce utilise hémagglutinine grippe peptides (HA) pour les contrôles internes.
Un Zika validé positive échantillon de sérum provenant de Wadsworth Center (Albany, NY), servait à identifier des immunoglobulines M (IgM) et peptides réactifs immunoglobuline G (IgG). Après incubation avec l’exemple du jour au lendemain, la biopuce était tachée avec un anticorps conjugué fluorochrome secondaire (anti-homme IgM ou anti-IgG humaines) et analysée sur un scanner de microarray. Quantification des intensités spots et annotation de peptide a été réalisée avec un logiciel spécifique fourni par la même société qui a fabriqué la biopuce.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Micarray peptide personnalisé : notre microarray contient la séquence complète de la protéine du virus Zika</td></tr><tr><td>Plateau d’incubation PEPperCHIP 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration PEPperCHIP (680 nm) (anti-HA, étiquetage DyLight)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14 jours gratuits Licence pour Windows</td></tr><tr><td>Rockland Tampon de blocage</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti-humains (chaîne mu) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-humains Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td></td> Système <td></td><td></td><td>d’imagerie LI-COR Odyssey</td></tr><tr><td>Dispositif d’agitation orbitale</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 agitateur de microtitration</td><td></td></tr><tr><td>numérique Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus spécifique diagnostic épitope découverte

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Puces à haute densité de peptide permettent le criblage de plus de six mille peptides sur une lame de microscope standard unique. Cette méthode peut être appliquée pour la découverte de médicaments, identification des cibles thérapeutiques et l’élaboration du diagnostic. Nous présentons ici un protocole pour découvrir Zika virus (ZIKV) diagnostic des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Un échantillon de sérum humain validé pour les infections ZIKV sont incubée avec un microarray peptides haute densité contenant l’ensemble des protéines ZIKV traduit en 3 423 unique 15 linéaire acides aminés (aa) les résidus avec un chevauchement de résidus 14-aa imprimé en double exemplaire. Coloration avec différents anticorps secondaires dans le même tableau, nous avons détecté des peptides qui lient l’immunoglobuline M (IgM) et les anticorps de l’immunoglobuline G (IgG) présents dans le sérum. Ces peptides ont été choisis pour plus des expériences de validation. Dans ce protocole, nous décrivons la stratégie suivie pour concevoir, traiter et analyser un microarray peptides haute densité.

Les résultats obtenus en utilisant le protocole décrit sont indiquées à la Figure 2 et la Figure 3. Aucune interaction de fond ont été notées en pré souillant la biopuce avec secondaire anti-homme IgM (données non présentées). Coloration avec un anti-homme IgM conjugué a entraîné plusieurs zones au-dessus des intensités de fluorescence vert fond indiquant la liaison de ces peptides avec IgM dans l’échantillon de...

Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour découvrir Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Ce protocole peut readly être adapté pour d’autres maladies infectieuses émergentes.

Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

L’objectif global de cette expérience est d’identifier des peptides spécifiques du virus Zika à utiliser dans un test diagnostique pour détecter les anticorps du virus Zika. C’est essentiel, car le virus disparaît du sang en 10 jours environ, tandis que les anticorps persistent pendant des années. Cette méthode nous permet d’identifier des antigènes et des épitopes à l’aide d’une puce à ADN de l’ensemble du protéome de Zika afin d’identifier les peptides qui capturent les anticorps IgM ou IgG dans un échantillon de sérum d’un individu infecté.Le principal avantage de la détection des anticorps précoces, IgM, et des anticorps ultérieurs, IgG, est de fournir au clinicien une chronologie de l’infection. Et cela est particulièrement important chez les femmes enceintes. Bien que ce protocole donne un aperçu de la cause de l’infection par le virus Zika, il peut être appliqué à d’autres agents pathogènes, à l’aide d’une puce à ADN spécifique à cet agent pathogène si sa séquence protéique est connue.Manipulez la glissière de verre par les bords à l’aide de gants non poudrés. Les dimensions de la lame de verre sont de 75,4 millimètres sur 25,0 millimètres et de 1 millimètre d’épaisseur. Placez la lame dans le plateau d’incubation, la surface de la puce vers le haut.Remplissez les supports de lames vides avec des lames vierges pour éviter que la lame de la puce ne se brise. Placez le côté brillant du joint vers le bas sur la surface imprimée de la puce à ADN. Pour assurer une bonne position, superposez les trous de vis du joint et de la plaque de base.Placez la partie supérieure du plateau sur le joint pour créer une chambre de microréseau. Fixez la glissière dans le plateau en serrant également les vis à oreilles l’une après l’autre à la main selon un schéma alterné. Commencez en haut à gauche et continuez en bas à droite.Placez le couvercle sur le plateau d’incubation. Une manipulation soigneuse de la puce est essentielle pour éviter de rayer la surface de la puce. Les solutions sont ajoutées puis retirées du coin de la chambre de la puce à microréseau.Le séchage de la puce à ADN est également important pour fournir une bonne image de numérisation. Incuber la puce avec 2 000 microlitres de tampon standard par puce pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez la mémoire tampon standard en aspirant à l’aide d’une pipette dans le coin de la chambre de la puce à microréseau, puis bloquez la puce à l’aide d’un tampon de blocage pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min.Retirez le tampon bloquant en aspirant par le coin de la chambre de la puce à l’aide d’une pipette. Ajouter à la puce à la puce d’ADN un anticorps secondaire conjugué au fluorochrome IgM anti-humain dilué à 1:5 000 dans le tampon de coloration. Ensuite, incubez la puce pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbital à 140 tr/min.À l’aide d’une pipette, vous pouvez retirer l’anticorps secondaire en aspirant à partir du coin de la chambre de la puce à microréseau. Lavez la puce pendant une minute avec 2000 microlitres avec un tampon standard par puce à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez le tampon standard à l’aide de la technique éprouvée et répétez le lavage deux fois.Ensuite, plongez la lame deux fois dans 200 millilitres d’un tampon de trempage fraîchement préparé. Séchez soigneusement la puce à ADN pendant environ une minute en aspirant très soigneusement l’excès de liquide du haut vers le bas de la lame sans toucher la surface de la lame. Analysez la lame dans un lecteur de scanner de microarrays comme illustré plus loin dans cette vidéo.Inactivez l’échantillon de sérum à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.Ensuite, incubez la puce à ADN avec le tampon de coloration pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez le tampon de coloration en aspirant du coin de la chambre de la puce à l’aide d’une pipette. Diluez l’échantillon de sérum et le tampon de coloration en commençant par une dilution de 1:1 000.Incuber l’échantillon dilué avec la puce à ADN pendant une nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Prélever l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la technique démontrée. Ensuite, lavez la puce à ADN trois fois comme auparavant.Diluez l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration. Utilisez un anticorps conjugué au fluorochrome IgM humain ou un anticorps conjugué au fluorochrome IgG anti-humain à une dilution de 1:5 000 dans un tampon de coloration. Mélangez ensuite l’anticorps marqué au contrôle à une dilution de 1:1000 dans un tampon de coloration avec l’anticorps secondaire dilué.Incuber avec la puce pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité et sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez le mélange d’anticorps secondaires dilués et d’anticorps marqués en aspirant par le coin de la chambre de la puce à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez la puce à ADN trois fois avec un tampon standard.Chaque lavage dure une minute sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Enfin, retirez le tampon de lavage de la chambre de la puce comme précédemment. Pour effectuer le balayage des microréseaux, plongez la lame deux fois dans 200 millilitres de tampon de trempage fraîchement préparé.Séchez la puce pendant environ une minute en aspirant très soigneusement du haut vers le bas de la lame sans toucher la surface de la lame. Scannez la puce en suivant les instructions du scanner. Placez la diapositive sur le scanner avec la surface imprimée vers le haut.Créez un nouveau projet et sélectionnez la zone de numérisation. Réglez les paramètres du scanner avec une résolution de 21 microns, une intensité de 7,0 pour les canaux de 700 et 800 nanomètres, une qualité de balayage de moyen et un décalage de 0,8. Acquérez et enregistrez l’image du dessin de numérisation au format de fichier TIF 16 bits en niveaux de gris.Pour analyser les données, ouvrez l’image brute. Ouvrez ensuite le fichier de grille de tableau. Alignez la grille du réseau sur l’image numérisée à l’aide des touches fléchées de la souris ou du clavier de l’ordinateur.Sélectionnez la sélection de quantification dans le logiciel spécifique, qui crée un fichier de lecture contenant l’intensité du signal pour chaque point, la valeur de fond et la séquence peptidique correspondante. Enfin, stockez la puce scellée dans l’obscurité à quatre degrés Celsius sous de l’azote sans oxygène ou du gaz argon. Voici l’image brute en fluorescence de la coloration de la puce avec des IgG anti-humaines après incubation avec un échantillon de sérum spécifique du virus Zika dilué à 1:250.Les peptides de contrôle HA encadrent la puce à AD. Les peptides qui réagissent fortement aux IgG sont affichés dans le panneau de zoom. De même, on voit ici une image de fluorescence brute de la coloration de la puce avec des IgM anti-humains après incubation avec un échantillon de sérum spécifique du virus Zika dilué à 1:250.Encore une fois, les peptides de contrôle HA encadrent la puce à AD. Les peptides qui réagissent fortement aux IgM sont affichés dans le panneau de zoom. On voit ici une séquence consensus représentative de l’épitope du virus Zika réagissant avec les IgM dans les peptides de l’échantillon de sérum de l’hôte.Les peptides de la séquence consensus de l’épitope sont surlignés en rouge, et le peptide avec l’intensité de fluorescence la plus élevée est marqué en gras. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter une puce à peptides à haute densité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 24 heures si elle est exécutée correctement.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler soigneusement la puce pour éviter de rayer la surface de la puce. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’ELISA ou un test de liaison par résonance plasmonique de surface peuvent être effectuées pour déterminer si les peptides identifiés se lient spécifiquement aux anticorps du virus Zika et non à d’autres anticorps du Flavivirus. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine du diagnostic pour la découverte de peptides diagnostiques à partir d’échantillons de sérum et de salive.N’oubliez pas que travailler avec des agents infectieux comme le virus Zika peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’inactivation thermique de l’échantillon de sérum et le travail dans des installations de biosécurité de niveau 2 doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Immunology and Infection

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