Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

L’objectif global de cette expérience est d’identifier des peptides spécifiques du virus Zika à utiliser dans un test diagnostique pour détecter les anticorps du virus Zika. C’est essentiel, car le virus disparaît du sang en 10 jours environ, tandis que les anticorps persistent pendant des années. Cette méthode nous permet d’identifier des antigènes et des épitopes à l’aide d’une puce à ADN de l’ensemble du protéome de Zika afin d’identifier les peptides qui capturent les anticorps IgM ou IgG dans un échantillon de sérum d’un individu infecté.

Le principal avantage de la détection des anticorps précoces, IgM, et des anticorps ultérieurs, IgG, est de fournir au clinicien une chronologie de l’infection. Et cela est particulièrement important chez les femmes enceintes. Bien que ce protocole donne un aperçu de la cause de l’infection par le virus Zika, il peut être appliqué à d’autres agents pathogènes, à l’aide d’une puce à ADN spécifique à cet agent pathogène si sa séquence protéique est connue.

Manipulez la glissière de verre par les bords à l’aide de gants non poudrés. Les dimensions de la lame de verre sont de 75,4 millimètres sur 25,0 millimètres et de 1 millimètre d’épaisseur. Placez la lame dans le plateau d’incubation, la surface de la puce vers le haut.

Remplissez les supports de lames vides avec des lames vierges pour éviter que la lame de la puce ne se brise. Placez le côté brillant du joint vers le bas sur la surface imprimée de la puce à ADN. Pour assurer une bonne position, superposez les trous de vis du joint et de la plaque de base.

Placez la partie supérieure du plateau sur le joint pour créer une chambre de microréseau. Fixez la glissière dans le plateau en serrant également les vis à oreilles l’une après l’autre à la main selon un schéma alterné. Commencez en haut à gauche et continuez en bas à droite.

Placez le couvercle sur le plateau d’incubation. Une manipulation soigneuse de la puce est essentielle pour éviter de rayer la surface de la puce. Les solutions sont ajoutées puis retirées du coin de la chambre de la puce à microréseau.

Le séchage de la puce à ADN est également important pour fournir une bonne image de numérisation. Incuber la puce avec 2 000 microlitres de tampon standard par puce pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez la mémoire tampon standard en aspirant à l’aide d’une pipette dans le coin de la chambre de la puce à microréseau, puis bloquez la puce à l’aide d’un tampon de blocage pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min.

Retirez le tampon bloquant en aspirant par le coin de la chambre de la puce à l’aide d’une pipette. Ajouter à la puce à la puce d’ADN un anticorps secondaire conjugué au fluorochrome IgM anti-humain dilué à 1:5 000 dans le tampon de coloration. Ensuite, incubez la puce pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbital à 140 tr/min.

À l’aide d’une pipette, vous pouvez retirer l’anticorps secondaire en aspirant à partir du coin de la chambre de la puce à microréseau. Lavez la puce pendant une minute avec 2000 microlitres avec un tampon standard par puce à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez le tampon standard à l’aide de la technique éprouvée et répétez le lavage deux fois.

Ensuite, plongez la lame deux fois dans 200 millilitres d’un tampon de trempage fraîchement préparé. Séchez soigneusement la puce à ADN pendant environ une minute en aspirant très soigneusement l’excès de liquide du haut vers le bas de la lame sans toucher la surface de la lame. Analysez la lame dans un lecteur de scanner de microarrays comme illustré plus loin dans cette vidéo.

Inactivez l’échantillon de sérum à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Ensuite, incubez la puce à ADN avec le tampon de coloration pendant 15 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez le tampon de coloration en aspirant du coin de la chambre de la puce à l’aide d’une pipette. Diluez l’échantillon de sérum et le tampon de coloration en commençant par une dilution de 1:1 000.

Incuber l’échantillon dilué avec la puce à ADN pendant une nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Prélever l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la technique démontrée. Ensuite, lavez la puce à ADN trois fois comme auparavant.

Diluez l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration. Utilisez un anticorps conjugué au fluorochrome IgM humain ou un anticorps conjugué au fluorochrome IgG anti-humain à une dilution de 1:5 000 dans un tampon de coloration. Mélangez ensuite l’anticorps marqué au contrôle à une dilution de 1:1000 dans un tampon de coloration avec l’anticorps secondaire dilué.

Incuber avec la puce pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité et sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Retirez le mélange d’anticorps secondaires dilués et d’anticorps marqués en aspirant par le coin de la chambre de la puce à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez la puce à ADN trois fois avec un tampon standard.

Chaque lavage dure une minute sur un agitateur orbital à 140 tr/min. Enfin, retirez le tampon de lavage de la chambre de la puce comme précédemment. Pour effectuer le balayage des microréseaux, plongez la lame deux fois dans 200 millilitres de tampon de trempage fraîchement préparé.

Séchez la puce pendant environ une minute en aspirant très soigneusement du haut vers le bas de la lame sans toucher la surface de la lame. Scannez la puce en suivant les instructions du scanner. Placez la diapositive sur le scanner avec la surface imprimée vers le haut.

Créez un nouveau projet et sélectionnez la zone de numérisation. Réglez les paramètres du scanner avec une résolution de 21 microns, une intensité de 7,0 pour les canaux de 700 et 800 nanomètres, une qualité de balayage de moyen et un décalage de 0,8. Acquérez et enregistrez l’image du dessin de numérisation au format de fichier TIF 16 bits en niveaux de gris.

Pour analyser les données, ouvrez l’image brute. Ouvrez ensuite le fichier de grille de tableau. Alignez la grille du réseau sur l’image numérisée à l’aide des touches fléchées de la souris ou du clavier de l’ordinateur.

Sélectionnez la sélection de quantification dans le logiciel spécifique, qui crée un fichier de lecture contenant l’intensité du signal pour chaque point, la valeur de fond et la séquence peptidique correspondante. Enfin, stockez la puce scellée dans l’obscurité à quatre degrés Celsius sous de l’azote sans oxygène ou du gaz argon. Voici l’image brute en fluorescence de la coloration de la puce avec des IgG anti-humaines après incubation avec un échantillon de sérum spécifique du virus Zika dilué à 1:250.

Les peptides de contrôle HA encadrent la puce à AD. Les peptides qui réagissent fortement aux IgG sont affichés dans le panneau de zoom. De même, on voit ici une image de fluorescence brute de la coloration de la puce avec des IgM anti-humains après incubation avec un échantillon de sérum spécifique du virus Zika dilué à 1:250.

Encore une fois, les peptides de contrôle HA encadrent la puce à AD. Les peptides qui réagissent fortement aux IgM sont affichés dans le panneau de zoom. On voit ici une séquence consensus représentative de l’épitope du virus Zika réagissant avec les IgM dans les peptides de l’échantillon de sérum de l’hôte.

Les peptides de la séquence consensus de l’épitope sont surlignés en rouge, et le peptide avec l’intensité de fluorescence la plus élevée est marqué en gras. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter une puce à peptides à haute densité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 24 heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler soigneusement la puce pour éviter de rayer la surface de la puce. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’ELISA ou un test de liaison par résonance plasmonique de surface peuvent être effectuées pour déterminer si les peptides identifiés se lient spécifiquement aux anticorps du virus Zika et non à d’autres anticorps du Flavivirus. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine du diagnostic pour la découverte de peptides diagnostiques à partir d’échantillons de sérum et de salive.

N’oubliez pas que travailler avec des agents infectieux comme le virus Zika peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’inactivation thermique de l’échantillon de sérum et le travail dans des installations de biosécurité de niveau 2 doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.