Name: Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez l'identification de peptides spécifiques du virus Zika pour le diagnostic par microarray de peptides à haute densité. Cette méthode détecte les anticorps IgM et IgG pour établir la chronologie de l'infection.

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Actuel est confortée par une subvention de supplément administratif SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Concession de NIDCR VIH qui a évolué hors subvention NIDCR U01 DE017855 pour le développement d’un diagnostic de point-of-care confirmation pour le VIH. Nous remercions sincèrement Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) pour son assistance technique et de soutien. Nous remercions également NYU Langone Medical Center pour les LI-COR Odyssey Imaging System.

Ces données font partie d’une étude en cours menée au Collège de dentisterie de l’Université de New York et ont été approuvées par l’Institutional Review Board de la New York University School of Medicine, la CISR # H10-01894. Les échantillons cliniques utilisées dans cette étude ont été dépersonnalisées échantillons précédemment utilisés pour le diagnostic et avec la permission de la Wadsworth Center de New York State Department of Health, Albany, NY.
1. installation de la coulisse de Microarray peptides ZIKV haute densité dans un bac spécifique d’Incubation
<ol><li>Gérer la lame de verre par les bords à l’aide de gants sans poudre. Les dimensions de lame de verre sont 75,4 mm par 25,0 mm et 1 mm d’épaisseur. Placez la diapositive dans le bac de l’incubation avec la surface de la puce vers le haut.</li>
	<li>Placez le côté brillant du joint vers le bas sur la surface imprimée de microarray. Afin d’assurer une bonne position, recouvrir les trous de vis de la garniture et la plaque de base.</li>
	<li>Placer la partie supérieure de la barre d’État sur le sceau pour créer une chambre de microarray.</li>
	<li>Fixez la lame dans la barre d’État en serrant tout aussi les vis moletées l’un après l’autre à la main dans un modèle alternatif à partir de l’angle supérieur gauche, suivie en bas à droite. Placez le couvercle du bac à l’incubation.</li>
</ol>2. contexte Interaction Detection : Coloration la biopuce avec anticorps secondaires
Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards et de blocage, des anticorps secondaires dilués) dans le coin de la chambre de microarray.
<ol><li>Incuber les puces avec un tampon standard (1 x en solution saline tamponnée au Phosphate (PBS), 0,05 % de Tween 20, pH 7,4, filtré avec un filtre de 0,45 µm) (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirez le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray. Remplir porte-diapositive vide avec diapositives vides pour éviter la rupture de la diapositive de microarray.</li>
	<li>Bloquer la biopuce avec le tampon de blocage (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 60 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirer le tampon de blocage en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Incuber le microarray avec l’anticorps secondaire, fluorochrome d’IgM anti-humaine conjuguée, dilué 1:5 000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans la coloration de la mémoire tampon (10 % bloquant un tampon en mémoire tampon standard) pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/min.</li>
	<li>Supprimer l’anticorps secondaire en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Immerger la diapositive 2 x dans un tampon de plongement fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).</li>
	<li>Sécher la biopuce soigneusement, pendant environ 1 min, en aspirant l’excès de liquide très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement. Analyser la lame dans un scanner de microarray de lecteur.</li>
</ol>3. exposition de la biopuce pour héberger le sérum
ATTENTION : Pour effectuer cette étape dans des conditions de sécurité de laboratoire, niveau de biosécurité 2 (BSL-2) en raison de la nature infectieuse potentielle de l’échantillons de sérum. Travailler au sein d’une classe II hotte de sécurité biologique (BSC).
<ol><li>Inactiver l’échantillon de sérum à 56 ° C pendant 30 min et centrifuger à 16 000 FRC pendant 5 min à 4 ° C13. Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (coloration, tampon standard et du sérum dilué) dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Diluer l’échantillon de sérum dans un tampon coloration commençant par une dilution de 1 : 1 000 (volume total de 2 000 μL/microarray). Gardez-le à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Incuber la biopuce avec le tampon de coloration (volume total de 2 000 μL/microarray) pendant 15 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirer le tampon de coloration en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Incuber le microarray avec l’échantillon de sérum dilué pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirer l’échantillon de sérum dilué en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 μL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
</ol>4. la coloration avec des anticorps de contrôle marqués et des anticorps secondaires
Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards, secondaire dilué et anticorps de l’étiquette) dans le coin de la chambre de microarray.
<ol><li>Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration. NOTE : Fluorochrome de IgM anti-humain utilisation conjugués anticorps ou anti-humain fluorochrome conjugués anticorps à une dilution de 1:5,000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans un tampon de coloration.</li>
	<li>Anticorps de Mix contrôle étiquette (anticorps monoclonal anti-HA fluorochrome conjuguées) à une dilution de 1 : 1 000 (volume total des 2 000 µL/microarray) tampon de coloration avec l’anticorps secondaire préalablement diluée en souillant la mémoire tampon.</li>
	<li>Incubez avec la biopuce pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.</li>
	<li>Retirez le mélange du secondaire dilué et anticorps de l’étiquette en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
	<li>Laver 3 x avec un tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray). Chaque lavage est pendant 1 min dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.</li>
</ol>5. les biopuces à balayage
<ol><li>Immerger la diapositive 2 x dans le buffer à pendage fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).</li>
	<li>Sécher la biopuce soigneusement, environ 1 min, en aspirant très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement.</li>
	<li>Scan de la biopuce, suivant les instructions du scanner. Placez la lame sur le scanner avec la surface imprimée vers le haut.</li>
	<li>Créez un nouveau projet et sélectionnez la zone de lecture optique. Définir les paramètres du scanner comme : résolution : 21 µm, intensité pour 700 à 800 canaux nm : 7,0, qualité de numérisation : médium et Offset : 0,8.</li>
	<li>Acquérir et enregistrez l’image raw scan sous un format de fichier TIFF 16 bits en niveaux de gris.</li>
</ol>6. Microarray Analysis, à l’aide d’un logiciel spécifique
<ol><li>Ouvrez l’image brute (image TIFF). Ouvrez le fichier grid array.</li>
	<li>Aligner la grille de tableau à l’image du scan avec les touches de flèche souris ou le clavier de l’ordinateur.</li>
	<li>Sélectionnez « Quantifier la sélection » dans le logiciel spécifique, ce qui crée un fichier de lecture qui contient l’intensité du signal pour chaque tache, la valeur d’arrière-plan et la séquence peptidique correspondante. Remarque : Ce fichier de sortie peut également être importé dans un programme de feuille de calcul pour une analyse complémentaire et la représentation graphique.</li>
</ol>7. stockage de « microarray »
<ol><li>Stocker la biopuce scellée dans l’obscurité à 4 ° C sous oxygène-gaz azote ou argon gratuit.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons conçu un protocole utilisant un microarray peptides haute densité contenant la séquence entière de la protéine du virus Zika (souche polynésienne Français). La biopuce a été fabriquée par impression 3 423 différents peptides linéaires qui se chevauchent. Chaque peptide était 15 acides aminés et variait selon qu’un résidu de son voisin le plus proche dans la séquence (p. ex., résidus 14 chevauchement). Bien que chevauche plus courtes peut être imprimés, la cartographie des épitopes est plus précise des...

Diagnostic de virus (ZIKV) de zika basé sur les symptômes cliniques est difficile parce qu’elle partage des vecteurs, répartition géographique et des symptômes avec la Dengue et Chikungunya virus infection1. Étant donné le risque de résultats défavorables de la grossesse chez les femmes infectées par ZIKV pendant la grossesse, il est important de distinguer entre les 3 virus. Bien que les tests de diagnostics moléculaires actuels sont spécifiques, ils sont seulement utiles dans le sang ou la salive au cours de la période relativement courte de l’infection aiguë2,3. Analyses sérologiques sont essentiels pour le diagnostic en dehors de cette période initiale d’infection4.
Le développement d’un test sérologique spécifique de ZIKV est difficile pour deux raisons : tout d’abord, les antigènes de Zika répondant par le système immunitaire humain à ne sont pas actuellement connus ; et séquences d’acides aminés flavivirus seconde, conservée induisent la réactivité des anticorps. Notre objectif était de découvrir des peptides spécifiques ZIKV uniques à utiliser dans le diagnostic. Différentes approches ont été développées aux bibliothèques de peptide écran couvrant les protéines entières dont phage, bactérienne, et surface de levure afficher5,6,7,8,9, 10. Notre stratégie a consisté à utiliser un microarray peptides haute densité qui permet des projections de sérologique rapide et peu coûteuse haut débit11,12 , et par la suite les peptides identifiés peuvent être utilisés pour améliorer l’actuelle sérologique tests pour la détection de l’infection à ZIKV.
Ce protocole permet la découverte de Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray » (Figure 1). La biopuce peptide haute densité a été produite à l’aide de la technologie d’impression laser peptide. La séquence entière de protéine ZIKV composé de 3 423 résidus d’acide aminé issu de la souche polynésienne Français (GenBank : KJ776791.2), a été imprimé sur une lame de verre standard dans des blocs de 15 résidus linéaires avec un chevauchement de 14 acides aminés en double exemplaire pour une total de 6 846 taches de peptide. Outre les peptides de séquence protéique Zika entières, la biopuce utilise hémagglutinine grippe peptides (HA) pour les contrôles internes.
Un Zika validé positive échantillon de sérum provenant de Wadsworth Center (Albany, NY), servait à identifier des immunoglobulines M (IgM) et peptides réactifs immunoglobuline G (IgG). Après incubation avec l’exemple du jour au lendemain, la biopuce était tachée avec un anticorps conjugué fluorochrome secondaire (anti-homme IgM ou anti-IgG humaines) et analysée sur un scanner de microarray. Quantification des intensités spots et annotation de peptide a été réalisée avec un logiciel spécifique fourni par la même société qui a fabriqué la biopuce.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Micarray peptide personnalisé : notre microarray contient la séquence complète de la protéine du virus Zika</td></tr><tr><td>Plateau d’incubation PEPperCHIP 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration PEPperCHIP (680 nm) (anti-HA, étiquetage DyLight)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14 jours gratuits Licence pour Windows</td></tr><tr><td>Rockland Tampon de blocage</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti-humains (chaîne mu) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-humains Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td></td> Système <td></td><td></td><td>d’imagerie LI-COR Odyssey</td></tr><tr><td>Dispositif d’agitation orbitale</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 agitateur de microtitration</td><td></td></tr><tr><td>numérique Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus spécifique diagnostic épitope découverte

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Puces à haute densité de peptide permettent le criblage de plus de six mille peptides sur une lame de microscope standard unique. Cette méthode peut être appliquée pour la découverte de médicaments, identification des cibles thérapeutiques et l’élaboration du diagnostic. Nous présentons ici un protocole pour découvrir Zika virus (ZIKV) diagnostic des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Un échantillon de sérum humain validé pour les infections ZIKV sont incubée avec un microarray peptides haute densité contenant l’ensemble des protéines ZIKV traduit en 3 423 unique 15 linéaire acides aminés (aa) les résidus avec un chevauchement de résidus 14-aa imprimé en double exemplaire. Coloration avec différents anticorps secondaires dans le même tableau, nous avons détecté des peptides qui lient l’immunoglobuline M (IgM) et les anticorps de l’immunoglobuline G (IgG) présents dans le sérum. Ces peptides ont été choisis pour plus des expériences de validation. Dans ce protocole, nous décrivons la stratégie suivie pour concevoir, traiter et analyser un microarray peptides haute densité.

Les résultats obtenus en utilisant le protocole décrit sont indiquées à la Figure 2 et la Figure 3. Aucune interaction de fond ont été notées en pré souillant la biopuce avec secondaire anti-homme IgM (données non présentées). Coloration avec un anti-homme IgM conjugué a entraîné plusieurs zones au-dessus des intensités de fluorescence vert fond indiquant la liaison de ces peptides avec IgM dans l’échantillon de...

Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour découvrir Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Ce protocole peut readly être adapté pour d’autres maladies infectieuses émergentes.

Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

L’objectif global de cette expérience est d’identifier des peptides spécifiques du virus Zika à utiliser dans un test diagnostique pour détecter les anticorps du virus Zika. C’est essentiel, car le virus disparaît du sang en 10 jours environ, tandis que les anticorps persistent pendant des années. Cette méthode nous permet d’identifier des antigènes et des épitopes à l’aide d’une puce à ADN de l’ensemble du protéome de Zika afin d’identifier les peptides qui capturent les anticorps IgM ou IgG dans un échantillon de sérum d’un individu infecté.Le principal avantage de la détection des anticorps précoces, IgM, et des anticorps ultérieurs, IgG, est de fournir au clinicien une chronologie de l’infection. Et cela est particulièrement important chez les femmes enceintes. Bien que ce protocole donne un aperçu de la cause de l’infection par le virus Zika, il peut être appliqué à d’autres agents pathogènes, à l’aide d’une puce à ADN spécifique à cet agent pathogène si sa séquence protéique est connue.Manipulez la glissière de verre par les bords à l’aide de gants non poudrés. Les dimensions de la lame de verre sont de 75,4 millimètres sur 25,0 millimètres et de 1 millimètre d’épaisseur. Pla

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Contreras, D., et al.. Système de culture cellulaire infectieuse pour le virus Zika et effet prophylactique in vitro des interférons. J. Vis. Exp. (2016)La vidéo montre la détection des intermédiaires d'ARNsd viraux du Zika dans des cellules épithéliales infectées par immunocytochimie. Les cellules infectées sont fixées, puis bloquées avec une solution de blocage. Les anticorps primaire et secondaire sont ajoutés. Les noyaux sont colorés avec un colorant fluorescent. L'ARNsd viral...

Détection des intermédiaires de réplication de l'ARN double brin du virus Zika par immunocytochimie

virus Zika (ZIKV), un pathogène émergent, est lié à des anomalies du développement fœtal et à la microcéphalie. La mise en place d’un système efficace de culture cellulaire infectieuse est cruciale pour les études sur la réplication du virus Zika ainsi que pour la mise au point de vaccins et de médicaments. Dans cette étude, divers tests virologiques relatifs au virus Zika sont illustrés et discutés.

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Ici, les auteurs présentent un protocole simple et efficace pour définir un épitope antigénique linéaire à l’aide d’un anticorps monoclonal purifié et d’un balayage peptidique par hybridation dot-blot. L’épitope identifié peut ensuite être utilisé dans des applications thérapeutiques et diagnostiques.

L&#39;identification d&#39;un épitope linéaire des cellules B monoclonales d&#39;anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

Ce protocole décrit la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADNc infectieux à deux plasmides.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.

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Un protocole pour évaluer les réponses de cellules T spécifiques de l’antigène dans les organes d’immunoprivileged du Ifnar1- / - modèle murin pour l’infection de virus (ZIKV) de Zika est décrite. Cette méthode est essentielle pour étudier les mécanismes cellulaires de la protection et immunopathogenèse des vaccins ZIKV et est également précieuse pour leur évaluation de l’efficacité.

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Les auteurs décrivent une méthode pour évaluer l’effet d’immunité préexistante contre le virus de la dengue sur l’infection par le virus Zika à l’aide de sérum humain, des cellules humaines primaires et quantification de l’infection par PCR en temps réel quantitative.

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Dans ce travail, nous décrivons les protocoles utilisés dans les tests à base de réplicon et à base d’enzymes virales pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit.

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Les immunodosages à fluorescence multiplex deviennent une référence pour les tests sérologiques. Leur application est toutefois limitée par la complexité et le temps nécessaire des processus de couplage bile-analyte. Ce rapport présente un protocole de couplage de microsphères multiplexes semi-automatisé et reproductible, comparable à la méthode standard, tout en réduisant considérablement le temps d’obtention des résultats.

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