Name: Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez un protocole sans cellules nourricières pour produire en masse des cellules tueuses naturelles murines de haute pureté. Cette méthode facilite les études d'immunologie innée et de thérapie anticancéreuse.

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Cette étude a été financée par la recherche subventions Conseil de Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) et de l’Innovation et fonds de technologie de Hong Kong (STI/227/15, ITS InP/164/16, STI-InP/242/16), subvention directe pour la recherche-CUHK (2016.035) et boursier de Hong Kong Programme.
H.-Y.L. conçu et supervisé toutes les expériences et ont contribué à la rédaction de manuscrits. H-K.T. effectué des expériences, ont analysé les données et a contribué à la rédaction de manuscrits. C.P.-T. T., J.Y.-C.F., J.S.-C., H., Q.-M.W., et G.-Y.L. ont prélevé des échantillons animaux et a participé à l’expérimentation animale. J.S., X.-R.H., et K.-F.T. a contribué à la rédaction de manuscrits.

Le protocole pour l’obtention et la différenciation des dérivés de la moelle osseuse NK cells (BM-NK) est basé sur les méthodes publiées antérieurement20,21,22. Toutes les procédures sur des souris ont été approuvés par l’Animal Ethics expérimental Comité (AEEC) à l’Université chinoise de Hong Kong.
1. préparation du milieu conditionnelle OP9
<ol><li>La culture de la lignée de cellules du stroma murine OP9 en alpha-MEM contenant 20 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine, à 37 ° C en atmosphère humidifiée d’air/CO2 (95 % : 5 %).<ol>
<li>Compter les cellules avec un hémocytomètre, puis graine 2 x 106 des cellules OP9 à chaque flacon de culture de2 75 cm avec 15 mL de milieu. Culture pendant 48 h.</li>
		<li>Lorsque la culture atteint 80 % confluence, laver la fiole 10 ml de PBS et ajouter 20 mL de plain milieu d’alpha-MEM (sans antibiotiques et FBS) par flacon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir le milieu de condition OP9 du flacon de culture après 24 h, nettoyer les débris cellulaires avec filtre de polyéthersulfone (PES) 0,25 µm et conserver à 4 ° C (utilisation dans les 2 semaines).</li>
</ol>2. isolement des cellules de la moelle osseuse de souris
<ol><li>Euthanasier une souris C57BL/6J de 12 semaines avec un surdosage de pentobarbital (100 mg/kg, une injection intrapéritonéale). Mort pour confirmer l’absence de respiration, puis récolter les os du fémur avec un couteau chirurgical au niveau des jonctions entre les os et supprimer les autres muscles avec la lame en grattant doucement.</li>
	<li>Placer les os dans un tube à centrifuger 50 mL contenant réfrigéré stérile alpha-MEM et puis effectuez les opérations suivantes dans une armoire de sécurité biologique.</li>
	<li>Jetez le milieu alpha-MEM et rincez les os avec l’éthanol à 70 % pendant 30 s.</li>
	<li>Laver les os avec des PBS stérile glacée deux fois pour nettoyer l’éthanol restant.</li>
	<li>Transférer les os dans un mortier contenant 5 mL de PBS glacée et fragmentation doucement les os avec un pilon (pulvériser pas eux).</li>
	<li>Agiter doucement les os en agitant le pilon pour libérer les cellules de la moelle osseuse dans le PBS. Recueillir les cellules de la moelle osseuse contenant PBS dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.6 pour quatre fois jusqu'à ce que les fragments d’os deviennent blanc Uni en couleur.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 465 x g pendant 5 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot avec 18 mL d’eau distillée stérile et laissez reposer pendant 30 s pour éliminer les globules rouges.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de glacé 10 X PBS pour arrêter la réaction, puis filtrer le mélange à travers un tamis de cellule de 70 µm pour éliminer les hématies lysées.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 465 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec 20 mL de PBS glacée.</li>
	<li>Laver les cellules en répétant l’étape 2.11 une seconde fois.</li>
	<li>Transférer le culot cellulaire dans un 100 mm boîte de Petri stérile 10 ml de milieu conditionnels OP9 de l’étape 1.2 additionné de 20 % FBS et un mélange de 0,5 ng/mL murins IL-7, 30 ng/mL souris SCF et flt3L murin de 100 U/mL.</li>
	<li>Incuber le plat à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 2 h. transfert des cellules seules dans un nouveau conteneur de culture à une densité de 5 x 105 cellules viables/mL (comptage des cellules par hémocytomètre avec exclusion de bleu trypan) avec la même formule moyenne comme à l’étape 2.13 et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Jour 4, changer la condition de la culture au milieu de conditionnel OP9 additionné de 20 % FBS et 2 000 U/mL d’il-2 murine.</li>
	<li>Actualiser le milieu de culture tous les 3 jours ; cellules NK matures peuvent être obtenus par jour 7 et qualifiés qu’à l’article 4.</li>
</ol>3. siRNA-mediated Gene Silencing de différenciation des cellules NK
<ol><li>Mélangez le contrôle siARN ou non-sens (NC) avec un agent de transfection selon le manuel du produit.</li>
	<li>Effectuez l’étape 3.1 à n’importe quel moment depuis le jour 0.</li>
	<li>Ajouter les 50 nM de siARN ou mélange de NC aux cellules de l’étape 2.14.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.1 sur chaque rafraîchissement moyen (par exemple, jour 0, 4 et 7) jusqu'à ce que le point de terminaison expérimental.</li>
</ol>4. analyse de la différenciation des cellules NK cytométrie
<ol><li>À un moment approprié, recueillir la suspension de la différenciation des cellules et laver avec du PBS glacée.</li>
	<li>Fixer les cellules avec tampon de fixation cellule selon le manuel du produit.</li>
	<li>Laver les cellules fixes avec PBS glacée et ensuite remettre en suspension de 1 x 106 cellules dans 100 µL de Flow Cytometry coloration tampon contenant Cy3 conjugué anti-souris NKp46 et PE-conjugués des anticorps anti-souris CD244 dans un rapport de dilution de 1/100.</li>
	<li>Coloration de l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons colorés avec 300 µL de PBS, puis acquérir des données de FACS et d’analyser avec Cytobank plate-forme20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le présent travail, nous avons décrit une nouvelle méthode de production de dérivés de la moelle osseuse murine NK de cellules in vitro. Le chargeur de la cellule dans le système original21,22 est remplacé avec succès par la moyenne conditionnelle de cellules OP9, qui a largement augmenté la stabilité du système de différenciation. En outre, le système peut produire la quantité élevée et pureté du NK mature cellules pour in vitro comme ...

La progression du cancer est largement tributaire de la tumeur microenvironnement1,2, y compris immunocytes hôte, par exemple, les cellules NK. Plusieurs études ont démontré que les cellules NK intratumorale sont négativement corrélées avec la tumeur progression3,4. En outre, des études cliniques ont montré qu’adoptif thérapie de cellules NK est une stratégie possible pour cancer5,6,7,8,9. Immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK a été récemment proposé comme une option thérapeutique pour les tumeurs solides, mais il existe des défis en raison de la sécrétion de cytokines immunosuppresseur et la diminution de l’activation des ligands dans le micro-environnement des tumeurs solides 10,11. Facteur de croissance transformant β (TGF-β) a été proposé de jouer un rôle suppresseur dans la carcinogenèse, mais paradoxalement les cellules cancéreuses produisent également TGF-β1 pour prendre en charge la tumeur développement12,13,14 , 15. signalisation TGF-β peut supprimer l’activité cytolytique des cellules NK via bas réglementant la réactivité de l’interféron et CD16 médiée par l’interféron-gamma (IFN-γ) production in vitro16,17, 18.
Bien que la perturbation de la signalisation de TGF-β dans le microenvironnement tumoral peut être un moyen possible pour éliminer les cancers, bloquant complètement la signalisation TGF-β causera des maladies auto-immunes en raison de sa fonction anti-inflammatoire, comme en témoigne le développement de effets secondaires indésirables, y compris l’inflammation systémique, anomalies cardiovasculaires et l’auto-immunité dans des souris modèles19. Ainsi, comprendre le mécanisme de travail de l’immunosuppression TGF-β-mediated mènera à l’identification d’une cible thérapeutique accessible pour traiter le cancer.
Afin d’élucider les événements moléculaires nécessaires pour le développement des cellules NK, Williams et al. établi un système in vitro pour différencier murin de la moelle osseuse des cellules souches hématopoïétiques dans NK cellules20. Ce système facilite grandement l’étude mécanistique de développement des cellules NK, y compris l’identification de nouveaux géniteurs de NK cellules21. Toutefois, les ancêtres de la moelle osseuse doivent être mis en culture dans le système avec l’appui de cellules stromales OP9 comme une alimentation couche20,21, et cette population de cellules hétérogènes en grande partie limite l’application supplémentaire du gène perturbant outils (p. ex., siARN-mediated gene silencing) spécifiquement appliquées aux cellules NK différenciateur.
Nous décrivons ici un système sans conducteur qui a été développé par autres modifier le système in vitro de Williams et al.20. Dans notre système, les cellules stromales chargeur de OP9 ne sont pas tenus, et plutôt OP9 moyenne conditionnelle est utilisée sans affecter la différenciation des cellules NK in vitroet ceci récemment nous amènent à découvrir que le TGF-β est capable de promouvoir la progression du cancer via supprimant le développement des cellules NK E4bp4-dépendant dans le microenvironnement de tumeur22. Ce nouveau système fournit avec succès une méthode sans fond pour élucider les mécanismes moléculaires du développement des cellules NK dans des conditions particulières (p. ex., haute TGF-β1, siARN-mediated gene silencing, etc..) in vitro.

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire OP9</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg ; CRL-2749&trade ; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha ;, sans nucléosides</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante Flt3-ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fixation IC&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration par cytométrie en flux&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris conjugué PE CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris conjugué Cy3 NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle non-sens (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA contre souris E4BP4 ARNm</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime ;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& premier;</td></tr></tbody></table>

un nouveau système exempt d’alimentation pour la production de masse des cellules tueuses naturelles murins in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cellules appartiennent au système immunitaire inné et sont une défense immunitaire de première ligne contre le cancer ; Cependant, ils sont supprimés dans le microenvironnement tumoral et le mécanisme sous-jacent est encore largement inconnu. L’absence d’une source fiable et constante des cellules NK limite les progrès de la recherche de l’immunité cellulaire NK. Nous rapportons ici un système in vitro qui peut fournir la qualité et la quantité de moelle osseuse murine NK cellules sous condition exempte d’engraissement. Plus important encore, nous démontrons que le silençage génique médiée par les siARN avec succès inhibe la maturation des cellules NK E4bp4-dépendante en utilisant ce système. Ainsi, cette cellule NK roman in vitro différenciant système est une solution de biomatériaux pour la recherche sur l’immunité.

Résultats représentatifs sont obtenus suivant le protocole décrit. Cellules en suspension totale de la moelle osseuse ont été cultivés en vertu du système de différenciation exempte d’engraissement pendant 11 jours ; jour 7 par rapport au nombre de cellules totales au jour 0 (Figure 1A) a observé une augmentation significative des taux de prolifération. Les cellules NK matures avec ratio nucléaire à cytoplasmique élevé et morphologie des gran...

Nous présentons ici un protocole pour produire en série-silençage génique des cellules NK en utilisant un système de différenciation exempte d’engraissement pour étude mécanistique in vitro et in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

L’objectif global de ce nouveau système sans feeder est de fournir une méthode pour produire en masse des cellules tueuses naturelles de haute pureté pour des essais in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’immunologie innée, y compris le développement des cellules tueuses naturelles et l’immunité contre le cancer. Le principal avantage de cette technique est que ce nouveau système sans mangeoire peut considérablement augmenter la pureté des cellules tueuses naturelles produites.Cela facilite considérablement les essais suivants in vitro et in vivo. L’indication de cette technique s’étend à l’immunité tueuse naturelle, car la production de masse de cellules tueuses naturelles murines peut être produite à partir de la moelle osseuse de patients cancéreux pour l’analyse et la modification pour l’immunothérapie personnelle. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car le milieu consommé doit être prélevé à partir de la cellule OP9 en phase de croissance de charge.La démonstration faciale de cette méthode est essentielle car les étapes d’instruction de la moelle osseuse sont difficiles à apprendre, car

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Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.

Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Ici, nous présentons une méthode pour développer le tueur naturel du sang périphérique (PBNK), les cellules NK des tissus hépatiques et les cellules du récepteur antigénique chimérique (CAR)-NK dérivées de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ou du sang de cordon (CB). Ce protocole démontre l’expansion des cellules NK et CAR-NK à l’aide de cellules nourricières 221-mIL-21 en plus de la pureté optimisée des cellules NK expansées.

TUEUR NATUREL (NK) ET PROCÉDÉ D’EXPANSION CELLULAIRE CAR-NK UTILISANT UNE LIGNÉE CELLULAIRE B MODIFIÉE PAR UNE LIGNÉE CELLULAIRE B LIÉE À LA MEMBRANE

Le présent protocole montre comment différencier les cellules CD3−/CD45+CD56+ présentant une cytotoxicité légère des cellules souches à potentiel élargi humain (CSEPH) dans des conditions de culture 3D et 2D. Cela permet une validation phénotypique de routine sans la destruction du microenvironnement complexe.

Production de cellules tueuses naturelles à partir de cellules souches humaines à potentiel élargi

Les vésicules extracellulaires dérivées de cellules tueuses naturelles (NK-EV) ont un potentiel prometteur en tant que biothérapies anticancéreuses. Cette étude méthodologique présente un flux de travail de biofabrication en boucle fermée évolutif conçu pour produire et isoler en continu de grandes quantités de NK-EV de haute pureté. Des tests de contrôle en cours de fabrication sont effectués tout au long du flux de travail de biofabrication, ce qui permet de s’assurer que les VE répondent aux...

Flux de travail de biofabrication évolutif pour produire et isoler des produits biothérapeutiques anticancéreux extracellulaires dérivés de cellules tueuses naturelles

Ce protocole décrit une méthode évolutive pour l’expansion des produits de thérapies cellulaires adoptives (ACT), à savoir les cellules T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR) et les cellules Killer induites par les cytokines (CIK), utilisant des dispositifs d’expansion rapide perméable aux gaz (G-Rex), démontrant une croissance efficace et robuste dans un contexte cliniquement pertinent.

Génération efficace et rapide de cellules tueuses induites par CAR-T et cytokines dans des dispositifs évolutifs GMP

Découvrez un protocole sans cellules nourricières pour produire en masse des cellules tueuses naturelles murines de haute pureté. Cette méthode facilite les études d'immunologie innée et de thérapie anticancéreuse.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

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