Name: Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez un protocole sans cellules nourricières pour produire en masse des cellules tueuses naturelles murines de haute pureté. Cette méthode facilite les études d'immunologie innée et de thérapie anticancéreuse.

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Cette étude a été financée par la recherche subventions Conseil de Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) et de l’Innovation et fonds de technologie de Hong Kong (STI/227/15, ITS InP/164/16, STI-InP/242/16), subvention directe pour la recherche-CUHK (2016.035) et boursier de Hong Kong Programme.
H.-Y.L. conçu et supervisé toutes les expériences et ont contribué à la rédaction de manuscrits. H-K.T. effectué des expériences, ont analysé les données et a contribué à la rédaction de manuscrits. C.P.-T. T., J.Y.-C.F., J.S.-C., H., Q.-M.W., et G.-Y.L. ont prélevé des échantillons animaux et a participé à l’expérimentation animale. J.S., X.-R.H., et K.-F.T. a contribué à la rédaction de manuscrits.

Le protocole pour l’obtention et la différenciation des dérivés de la moelle osseuse NK cells (BM-NK) est basé sur les méthodes publiées antérieurement20,21,22. Toutes les procédures sur des souris ont été approuvés par l’Animal Ethics expérimental Comité (AEEC) à l’Université chinoise de Hong Kong.
1. préparation du milieu conditionnelle OP9
<ol><li>La culture de la lignée de cellules du stroma murine OP9 en alpha-MEM contenant 20 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine, à 37 ° C en atmosphère humidifiée d’air/CO2 (95 % : 5 %).<ol>
<li>Compter les cellules avec un hémocytomètre, puis graine 2 x 106 des cellules OP9 à chaque flacon de culture de2 75 cm avec 15 mL de milieu. Culture pendant 48 h.</li>
		<li>Lorsque la culture atteint 80 % confluence, laver la fiole 10 ml de PBS et ajouter 20 mL de plain milieu d’alpha-MEM (sans antibiotiques et FBS) par flacon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recueillir le milieu de condition OP9 du flacon de culture après 24 h, nettoyer les débris cellulaires avec filtre de polyéthersulfone (PES) 0,25 µm et conserver à 4 ° C (utilisation dans les 2 semaines).</li>
</ol>2. isolement des cellules de la moelle osseuse de souris
<ol><li>Euthanasier une souris C57BL/6J de 12 semaines avec un surdosage de pentobarbital (100 mg/kg, une injection intrapéritonéale). Mort pour confirmer l’absence de respiration, puis récolter les os du fémur avec un couteau chirurgical au niveau des jonctions entre les os et supprimer les autres muscles avec la lame en grattant doucement.</li>
	<li>Placer les os dans un tube à centrifuger 50 mL contenant réfrigéré stérile alpha-MEM et puis effectuez les opérations suivantes dans une armoire de sécurité biologique.</li>
	<li>Jetez le milieu alpha-MEM et rincez les os avec l’éthanol à 70 % pendant 30 s.</li>
	<li>Laver les os avec des PBS stérile glacée deux fois pour nettoyer l’éthanol restant.</li>
	<li>Transférer les os dans un mortier contenant 5 mL de PBS glacée et fragmentation doucement les os avec un pilon (pulvériser pas eux).</li>
	<li>Agiter doucement les os en agitant le pilon pour libérer les cellules de la moelle osseuse dans le PBS. Recueillir les cellules de la moelle osseuse contenant PBS dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.6 pour quatre fois jusqu'à ce que les fragments d’os deviennent blanc Uni en couleur.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 465 x g pendant 5 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot avec 18 mL d’eau distillée stérile et laissez reposer pendant 30 s pour éliminer les globules rouges.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de glacé 10 X PBS pour arrêter la réaction, puis filtrer le mélange à travers un tamis de cellule de 70 µm pour éliminer les hématies lysées.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 465 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec 20 mL de PBS glacée.</li>
	<li>Laver les cellules en répétant l’étape 2.11 une seconde fois.</li>
	<li>Transférer le culot cellulaire dans un 100 mm boîte de Petri stérile 10 ml de milieu conditionnels OP9 de l’étape 1.2 additionné de 20 % FBS et un mélange de 0,5 ng/mL murins IL-7, 30 ng/mL souris SCF et flt3L murin de 100 U/mL.</li>
	<li>Incuber le plat à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 2 h. transfert des cellules seules dans un nouveau conteneur de culture à une densité de 5 x 105 cellules viables/mL (comptage des cellules par hémocytomètre avec exclusion de bleu trypan) avec la même formule moyenne comme à l’étape 2.13 et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Jour 4, changer la condition de la culture au milieu de conditionnel OP9 additionné de 20 % FBS et 2 000 U/mL d’il-2 murine.</li>
	<li>Actualiser le milieu de culture tous les 3 jours ; cellules NK matures peuvent être obtenus par jour 7 et qualifiés qu’à l’article 4.</li>
</ol>3. siRNA-mediated Gene Silencing de différenciation des cellules NK
<ol><li>Mélangez le contrôle siARN ou non-sens (NC) avec un agent de transfection selon le manuel du produit.</li>
	<li>Effectuez l’étape 3.1 à n’importe quel moment depuis le jour 0.</li>
	<li>Ajouter les 50 nM de siARN ou mélange de NC aux cellules de l’étape 2.14.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.1 sur chaque rafraîchissement moyen (par exemple, jour 0, 4 et 7) jusqu'à ce que le point de terminaison expérimental.</li>
</ol>4. analyse de la différenciation des cellules NK cytométrie
<ol><li>À un moment approprié, recueillir la suspension de la différenciation des cellules et laver avec du PBS glacée.</li>
	<li>Fixer les cellules avec tampon de fixation cellule selon le manuel du produit.</li>
	<li>Laver les cellules fixes avec PBS glacée et ensuite remettre en suspension de 1 x 106 cellules dans 100 µL de Flow Cytometry coloration tampon contenant Cy3 conjugué anti-souris NKp46 et PE-conjugués des anticorps anti-souris CD244 dans un rapport de dilution de 1/100.</li>
	<li>Coloration de l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons colorés avec 300 µL de PBS, puis acquérir des données de FACS et d’analyser avec Cytobank plate-forme20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le présent travail, nous avons décrit une nouvelle méthode de production de dérivés de la moelle osseuse murine NK de cellules in vitro. Le chargeur de la cellule dans le système original21,22 est remplacé avec succès par la moyenne conditionnelle de cellules OP9, qui a largement augmenté la stabilité du système de différenciation. En outre, le système peut produire la quantité élevée et pureté du NK mature cellules pour in vitro comme ...

La progression du cancer est largement tributaire de la tumeur microenvironnement1,2, y compris immunocytes hôte, par exemple, les cellules NK. Plusieurs études ont démontré que les cellules NK intratumorale sont négativement corrélées avec la tumeur progression3,4. En outre, des études cliniques ont montré qu’adoptif thérapie de cellules NK est une stratégie possible pour cancer5,6,7,8,9. Immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK a été récemment proposé comme une option thérapeutique pour les tumeurs solides, mais il existe des défis en raison de la sécrétion de cytokines immunosuppresseur et la diminution de l’activation des ligands dans le micro-environnement des tumeurs solides 10,11. Facteur de croissance transformant β (TGF-β) a été proposé de jouer un rôle suppresseur dans la carcinogenèse, mais paradoxalement les cellules cancéreuses produisent également TGF-β1 pour prendre en charge la tumeur développement12,13,14 , 15. signalisation TGF-β peut supprimer l’activité cytolytique des cellules NK via bas réglementant la réactivité de l’interféron et CD16 médiée par l’interféron-gamma (IFN-γ) production in vitro16,17, 18.
Bien que la perturbation de la signalisation de TGF-β dans le microenvironnement tumoral peut être un moyen possible pour éliminer les cancers, bloquant complètement la signalisation TGF-β causera des maladies auto-immunes en raison de sa fonction anti-inflammatoire, comme en témoigne le développement de effets secondaires indésirables, y compris l’inflammation systémique, anomalies cardiovasculaires et l’auto-immunité dans des souris modèles19. Ainsi, comprendre le mécanisme de travail de l’immunosuppression TGF-β-mediated mènera à l’identification d’une cible thérapeutique accessible pour traiter le cancer.
Afin d’élucider les événements moléculaires nécessaires pour le développement des cellules NK, Williams et al. établi un système in vitro pour différencier murin de la moelle osseuse des cellules souches hématopoïétiques dans NK cellules20. Ce système facilite grandement l’étude mécanistique de développement des cellules NK, y compris l’identification de nouveaux géniteurs de NK cellules21. Toutefois, les ancêtres de la moelle osseuse doivent être mis en culture dans le système avec l’appui de cellules stromales OP9 comme une alimentation couche20,21, et cette population de cellules hétérogènes en grande partie limite l’application supplémentaire du gène perturbant outils (p. ex., siARN-mediated gene silencing) spécifiquement appliquées aux cellules NK différenciateur.
Nous décrivons ici un système sans conducteur qui a été développé par autres modifier le système in vitro de Williams et al.20. Dans notre système, les cellules stromales chargeur de OP9 ne sont pas tenus, et plutôt OP9 moyenne conditionnelle est utilisée sans affecter la différenciation des cellules NK in vitroet ceci récemment nous amènent à découvrir que le TGF-β est capable de promouvoir la progression du cancer via supprimant le développement des cellules NK E4bp4-dépendant dans le microenvironnement de tumeur22. Ce nouveau système fournit avec succès une méthode sans fond pour élucider les mécanismes moléculaires du développement des cellules NK dans des conditions particulières (p. ex., haute TGF-β1, siARN-mediated gene silencing, etc..) in vitro.

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire OP9</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg ; CRL-2749&trade ; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha ;, sans nucléosides</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante Flt3-ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fixation IC&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration par cytométrie en flux&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris conjugué PE CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris conjugué Cy3 NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle non-sens (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA contre souris E4BP4 ARNm</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime ;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& premier;</td></tr></tbody></table>

un nouveau système exempt d’alimentation pour la production de masse des cellules tueuses naturelles murins in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cellules appartiennent au système immunitaire inné et sont une défense immunitaire de première ligne contre le cancer ; Cependant, ils sont supprimés dans le microenvironnement tumoral et le mécanisme sous-jacent est encore largement inconnu. L’absence d’une source fiable et constante des cellules NK limite les progrès de la recherche de l’immunité cellulaire NK. Nous rapportons ici un système in vitro qui peut fournir la qualité et la quantité de moelle osseuse murine NK cellules sous condition exempte d’engraissement. Plus important encore, nous démontrons que le silençage génique médiée par les siARN avec succès inhibe la maturation des cellules NK E4bp4-dépendante en utilisant ce système. Ainsi, cette cellule NK roman in vitro différenciant système est une solution de biomatériaux pour la recherche sur l’immunité.

Résultats représentatifs sont obtenus suivant le protocole décrit. Cellules en suspension totale de la moelle osseuse ont été cultivés en vertu du système de différenciation exempte d’engraissement pendant 11 jours ; jour 7 par rapport au nombre de cellules totales au jour 0 (Figure 1A) a observé une augmentation significative des taux de prolifération. Les cellules NK matures avec ratio nucléaire à cytoplasmique élevé et morphologie des gran...

Nous présentons ici un protocole pour produire en série-silençage génique des cellules NK en utilisant un système de différenciation exempte d’engraissement pour étude mécanistique in vitro et in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

L’objectif global de ce nouveau système sans feeder est de fournir une méthode pour produire en masse des cellules tueuses naturelles de haute pureté pour des essais in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’immunologie innée, y compris le développement des cellules tueuses naturelles et l’immunité contre le cancer. Le principal avantage de cette technique est que ce nouveau système sans mangeoire peut considérablement augmenter la pureté des cellules tueuses naturelles produites.Cela facilite considérablement les essais suivants in vitro et in vivo. L’indication de cette technique s’étend à l’immunité tueuse naturelle, car la production de masse de cellules tueuses naturelles murines peut être produite à partir de la moelle osseuse de patients cancéreux pour l’analyse et la modification pour l’immunothérapie personnelle. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car le milieu consommé doit être prélevé à partir de la cellule OP9 en phase de croissance de charge.La démonstration faciale de cette méthode est essentielle car les étapes d’instruction de la moelle osseuse sont difficiles à apprendre, car les os doivent être stériles avec de l’éthanol avec un temps optimal pour préserver la viabilité. Pour commencer cette procédure, prélevez les cellules OP9 dans une fiole de culture. Ajoutez du FBS pour arrêter la digestion de la trypsine.Récupérez les cellules OP9 et centrifugez à 465 fois la gravité pendant cinq minutes. Après cela, remettez en suspension la pastille de cellule. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules.Ensuite, ensemencez deux fois 10 à six cellules dans 15 millilitres de milieu alpha-mem dans un flacon de culture de 75 centimètres carrés, et incubez pendant 48 heures. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %, lavez-les avec 10 millimètres de solution saline tamponnée au phosphate et ajoutez 20 millilitres de milieu alpha-mem ordinaire sans antibiotiques et sérum de veau fœtal aux cellules. Incuber pendant 24 heures.Le lendemain, récupérez le média conditionné par OP9 en enlevant les débris cellulaires à l’aide d’un filtre et conservez-le à quatre degrés Celsius. Injecter une surdose de 100 milligrammes par kilogramme de pentobarbital par voie intrapéritonéale pour euthanasier une souris de 12 semaines. Après avoir confirmé l’absence de respiration, exciser les os du fémur à l’aide d’un couteau chirurgical.Retirez les muscles restants en grattant doucement avec une lame. Transférez les os dans un tube à centrifuger de 50 millilitres rempli d’un milieu alpha-mem réfrigéré et stérile, et conservez-les dans une enceinte de biosécurité. Ensuite, expulsez le milieu alpha-mem et lavez les os avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes.Encore une fois, lavez deux fois les os avec une solution saline glacée stérile tamponnée au phosphate pour éliminer tout éthanol restant. Après le lavage, transférez les os dans un mortier contenant cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacée et fragmentez les os avec un pilon. Faites tourner doucement le pilon pour libérer les cellules de la moelle osseuse dans la solution saline tamponnée au phosphate.Transférez la solution saline tamponnée au phosphate contenant des cellules de moelle osseuse dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez le tube à 465 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, jeter le surnageant.Extrayez jusqu’à ce que l’os devienne blanc pour obtenir un rendement maximal. Ensuite, remettez la pastille en suspension avec 18 millilitres d’eau distillée stérile et attendez 30 secondes pour retirer les globules rouges. Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution saline glacée tamponnée au phosphate 10X pour arrêter la réaction.Utilisez une passoire à cellules de 70 micromètres pour retirer les globules rouges lysés. Ensuite, centrifugez les tubes à 465 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 20 millilitres de solution saline glacée tamponnée au phosphate.Centrifugez les cellules une fois de plus. Ensuite, transférez la pastille cellulaire dans une boîte de Pétri stérile de 100 millilitres contenant 10 millilitres de milieu conditionnel OP9, complétée par des réactifs supplémentaires. Transférez la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures.Retirez toutes les cellules non attachées et les graines dans une nouvelle boîte de culture contenant un milieu conditionnel OP9, et placez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Le quatrième jour, remplacer le milieu de culture par un milieu conditionnel OP9, complété par 20 % de sérum fœtal bovin et 2 000 unités par millilitre d’interleukine 2 murine. Continuez à changer de milieu de culture tous les trois jours jusqu’au septième jour pour obtenir les cellules tueuses naturelles matures.Suivez le manuel du produit pour prémélanger le petit ARN interférent ou le contrôle non-sens avec le réactif de transfection au zéro, quatrième et septième jour du changement de milieu jusqu’au point final expérimental. Ajoutez 50 nanomolaires de petits ARN interférents, ou d’un mélange non sens, aux cellules non attachées pendant le rafraîchissement du milieu. Collectez les cellules différenciatrices à un moment approprié.Centrifugez les cellules à 465 fois la gravité pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et lavez la pastille cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée. Après avoir lavé les cellules fixées avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée, remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon de coloration par cytométrie en flux contenant des anticorps conjugués SY3.Après cela, mettez à nouveau les échantillons en suspension dans 300 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate pour une analyse par fax. Une courbe de croissance représentative démontrant le taux de prolifération des cellules de la moelle osseuse en cours de différenciation en cellules tueuses naturelles dans le système sans nourrisseur. Le graphique montre une augmentation significative du taux de prolifération des cellules au septième jour.Une image représentative en fond clair montrant des cellules tueuses naturelles différenciées dans un nouveau système sans mangeoire. Les cellules tueuses naturelles matures présentaient un rapport nucléaire/cytoplasmique élevé avec une morphologie cytoplasmique granulaire. Un graphique à barres représentatif montrant l’effet de petits ARN interférents sur les cellules de la moelle osseuse en cours de différenciation en cellules tueuses naturelles au sixième jour.Le graphique montre une réduction significative des niveaux d’ARNm E4bp4 et de petites cellules tueuses naturelles traitées par ARN interférents par rapport au groupe témoin. Des données cytométriques en flux représentatives démontrant l’effet d’E4bp4 silencieux sur la différenciation des cellules tueuses naturelles dérivées de la moelle osseuse de manière dépendante du TGF bêta-1 Smad3. Les données montrent que l’inactivation de l’ARNm E4bp4 diminue considérablement la production de cellules tueuses naturelles matures le sixième jour par rapport au contrôle non-sens.Il a été démontré que la diminution de la production de cellules tueuses naturelles médiée par de petits ARN interférents est sauvée par la suppression du TGF bêta-1 Smad3 avec un inhibiteur micromolaire de SIS3 Smad3 par rapport au petit groupe transfecté d’ARN interférent. Une fois maîtrisée, cette étude peut être réalisée en deux heures si elle est réalisée correctement. Le suivi de cette procédure permet de réaliser des modifications génétiques telles que le verrouillage et la surexpression des gènes afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les mécanismes de régulation de l’activité des cellules tueuses naturelles ainsi que le développement.La première, j’ai eu l’idée de cette méthode lorsque j’étendais les cellules tueuses naturelles dans l’ancien système. La présence des cellules fœtales a diminué la charge et l’efficacité de l’ARNi pour le gène d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des cellules tueuses naturelles massives de haute qualité à partir de ce système local in vitro.N’oubliez pas que travailler avec des réactifs d’extraction d’ARN peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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