Protocole expérimental pour la détection de la fonction mitochondriale chez les hépatocytes exposés aux pesticides organochlorés

C’est un messer qui appellent répondre à une question clé que vous avez aussi dans une fonction de domaine tels que le niveau ATP et les taux de consommation d’oxygène. La nouvelle ou la vieille d’une page, cette technique est qu’il est facile à effectuer et c’est beaucoup pour une évaluation spéciale de la fonction mitochondriale cellulaire. Pour commencer cette expérience, grainez 20 000 cellules HepG2 dans une boîte de Pétri à fond de verre.

Ajouter le bêta-hexachlorcyclohexane ou le B-HCH dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2 pendant 24 heures. Préparez une solution millimolaire de sonde verte de fluorescence mitochondriale en ajoutant le DMSO anhydre au milieu de culture cellulaire de DMEM. Ajouter ensuite un millilitre par plat de cette solution aux cellules dans des boîtes de Pétri à fond de verre.

Et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l’incubation, retirer la solution de sonde fluorescente verte mitochondriale des cellules. Ajouter un millilitre par plat de milieu de culture cellulaire DMEM fraîchement préparé à 37 degrés Celsius.

Pour détecter la fluorescence verte dans les mitochondries, observez les cellules au microscope confocal. Pour évaluer les niveaux d’ATP cellulaire, les graines à 20 000 cellules HepG2 dans six plaques de puits. Ajouter le bêta-HCH et l’incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse aux cellules de chaque puits. Centrifugeuse à 12 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et procéder à la collecte de supernatant comme décrit dans le protocole de texte. Ajouter 100 microlitres tampon de détection ATP à la plaque.

Ajouter 100 microlitres de supernatant cellulaire collecté à une plaque de puits de 96 à température ambiante et a procédé à la détection de l’ATP cellulaire par un luminomètre tel que décrit dans le protocole de texte. Pour l’évaluation du potentiel memitochondrial de membrane, cultivez des cellules d’HepG2 dans six plaques de puits avec l’addition de bêta-HCH, comme précédemment décrit. Recueillir les cellules en les digérant avec 0,5 millilitres 0,25%EDTA pendant une minute à 37 degrés Celsius.

Ajouter un millilitre de DMEM pour arrêter la digestion et transférer les cellules digérées dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes à 1000 fois G pendant trois minutes, puis jeter le supernatant. Diluer la pastille cellulaire avec 0,5 millilitres de milieu de culture cellulaire et 0,5 millilitres JC1 colorant potentiel de membrane mitochondriale.

Et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les tubes à 600 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez la pastille cellulaire selon le protocole de texte. Après avoir centrifugé la pastille lavée, retirer le supernatant.

Et re-suspendre la pastille dans 0,5 millilitres de tampon de teinture JC1. Analyser les cellules tachées JC1 par cytométrie d’écoulement pour détecter la fluorescence verte et rouge. Lorsque le monomère JC1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 490 nanomètres et la lumière d’émission à 530 nanomètres.

Lorsque le polymère JC1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 525 nanomètres et la lumière d’émission à 590 nanomètres. Pour analyser le taux de consommation d’oxygène, les cellules hepG2 de graines dans une plaque de culture cellulaire de puits 96 dans une densité de 4500 cellules par 100 microlitres par puits. Après 24 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, assurez-vous que les cellules de chaque puits sont recouvertes de milieu.

Avant d’exécuter le logiciel OCR, chargez la microplaque avec cartouche et la plaque de culture cellulaire dans un analyseur de flux extracellulaire tel que décrit dans le protocole de texte. Ouvrez le logiciel OCR et dans le menu goutte à goutte des applications, choisissez le kit de test de stress mito cellulaire, et cliquez sur le bouton démarrer l’application. Ensuite, cliquez sur le bouton de test de résistance exécuté.

Lorsque l’écran de test de stress cellulaire apparaît, entrez le nombre de cellules ensemencement par puits dans la boîte de numéro d’ensemencement cellulaire et l’OCR moyen dans la moyenne à la cellule basale OCR boîte. Entrez la concentration de travail finale pour chaque reagent, puis injectez les reagents. Cliquez sur le bouton suivant.

Lorsque l’écran d’information de groupe apparaît, assignez un groupe à des puits non attribués en choisissant une couleur et en donnant un nom. Cliquez ensuite sur les puits appropriés. Cliquez sur le bouton suivant et dans l’écran de mise en page d’injection de test de stress qui apparaît, cliquez sur commencer à exécuter le test de résistance sur l’analyseur.

Après la course terminée, suivez les invites dans le logiciel, puis retirez et jetez la cartouche et la plaque cellulaire. L’intensité moyenne de la coloration fluorescente verte mitochondriale a diminué dans les cellules HepG2 exposées au bêta-HCH. Cela montre qu’il y a une diminution du nombre mitochondrial et une augmentation des mitochondries endommagées compatibles avec l’augmentation de la concentration de pesticides.

En outre, les niveaux d’ATP dans les cellules HepG2 ont diminué avec les concentrations accrues d’exposition bêta-HCH, montrant la fonction diminuée des mitochondries dans ces cellules. Après la coloration JC1 pour le potentiel de membrane mitochondriale, ou MMP, le cytomètre d’écoulement a montré la fluorescence verte élevée de JC1 dans les cellules intactes d’HepG2. Cela est dû à la présence d’agrégats JC1 fluorescents rouges, qui sont un signe de MMP élevé.

Dans les cellules traitées par bêta-HCH, la fluorescence jc1 verte rouge a diminué en raison d’une présence de monomères JA1 fluorescents verts, un signe de faible MMP. Enfin, le taux de consommation d’oxygène a également diminué avec l’augmentation des concentrations d’exposition au bêta-HCH, ce qui montre en outre que ce pesticide nuit à la fonction mitochondriale appropriée. Oh, eh bien, essayez cette procédure, il est important cependant, de se rappeler de voir que les cellules comme approprié pour le tester.

Après son développement, cela ouvre définitivement la voie à des recherches dans le domaine de la fonction fondamentale pour explorer les organismes pertinents dans le rôle médical qui lui est associé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter une quantité ou une qualité, la capacité, maintenant membre ou potentiel sous la fonction feuille de bec.