4.1: Dialyse : Séparation basée sur la diffusion

La dialyse est une technique couramment utilisée en biochimie pour séparer les molécules en fonction de la diffusion. Dans cette procédure, une membrane semi-perméable permet le mouvement de certaines molécules en fonction de leur taille. Cette méthode peut être appliquée à l’élimination d’un tampon, connue sous le nom de dessalage, ou à l’échange de molécules ou d’ions tampons à partir d’une solution protéique.

Cette vidéo aborde les principes de la dialyse ainsi qu’une procédure générale. Plusieurs applications de la dialyse sont examinées, notamment l’élimination des réactifs de gradient après l’ultracentrifugation, l’élimination du détergent après une extraction de protéines membranaires et la reconstitution des protéines en modifiant l’environnement de la solution.

Les échantillons biochimiques ont généralement des concentrations élevées de tampons qui peuvent perturber le traitement et l’analyse en aval. La dialyse est une technique courante et peu coûteuse utilisée pour séparer les molécules en fonction de la diffusion. La méthode utilise une membrane semi-perméable qui permet le mouvement de certains composants, en fonction de la taille. Cette vidéo montrera les concepts de la dialyse, une procédure générale et certaines de ses utilisations en biochimie.

L’aspect le plus important de la dialyse est une membrane semi-perméable, qui a des pores qui imposent une coupure de poids moléculaire, permettant aux molécules d’une certaine taille de passer à travers. Par exemple, une membrane 10k retiendra généralement les molécules de plus de 10 kilodaltons. Cependant, la limite de poids moléculaire n’est pas une limite discrète ou précise. La membrane contient généralement une large gamme de tailles de pores, de sorte qu’une petite fraction de molécules près de la coupure peut être perdue.

Étant donné que la limite de poids moléculaire est définie à l’aide de protéines globulaires, des molécules linéaires de masse similaire, comme l’ADN ou l’ARN, peuvent passer à travers. Les membranes sont généralement choisies à la moitié ou au tiers du poids moléculaire de la molécule souhaitée.

Pour effectuer la procédure, un échantillon est placé dans la membrane, qui est à son tour ajouté à un grand volume de solution, appelé dialysat. Au fil du temps, les molécules plus petites diffusent librement à travers la membrane entre l’échantillon et le dialysat, tandis que les biomolécules plus grosses sont retenues à l’intérieur. La dialyse est un processus lent. Il est courant de le laisser fonctionner pendant la nuit, voire sur plusieurs jours.

Si le dialysat est de l’eau pure, la concentration globale du tampon diminuera, un processus connu sous le nom de dessalage. Si la solution contient d’autres petites particules, une partie se déplacera dans l’échantillon, entraînant un échange de tampon. La dialyse étant un processus d’équilibre, le dialysat peut être rafraîchi plusieurs fois pour déplacer davantage les petites molécules. Une fois le processus terminé, l’échantillon est recueilli de nouveau pour un traitement ultérieur.

Maintenant que vous avez vu les bases de la dialyse, jetons un coup d’œil à une procédure générale.

Avant de commencer la procédure, la membrane est pré-trempée dans du dialysat. Cela le rend plus facile à utiliser et élimine tous les conservateurs. Une fois prêt, l’échantillon est prélevé, généralement à l’aide d’une seringue, puis ajouté au récipient de dialyse. Il peut s’agir d’un tube nu ou d’une cassette. L’excès d’air est éliminé de l’installation de dialyse pour maximiser la surface de l’échantillon avec la membrane. L’installation est ensuite placée dans le dialysat avec agitation pour maximiser la diffusion. Il doit flotter pour ne pas gêner l’agitation.

Le dialysat est changé à des intervalles pertinents lorsque l’équilibre entre l’échantillon et le dialysat est atteint. Après le dernier changement, la réaction est généralement laissée à fonctionner pendant la nuit. Après une période de temps suffisante, l’échantillon sans tampon ou échangé est retiré de la cassette. Une fois collecté, l’échantillon peut être analysé ou traité davantage, selon la nature de l’expérience.

Maintenant que nous avons examiné une procédure de dialyse générale, voyons quelques-unes des façons dont cette technique est utilisée en biochimie.

Les gradients de densité sont un moyen courant de séparer des échantillons biologiques complexes. Ce concept repose sur la distribution sur de petites particules, généralement des ions saccharose ou chlorure de césium. Une fois terminés, ces réactifs doivent généralement être retirés avant que l’échantillon collecté puisse être traité. La dialyse permet d’utiliser l’échantillon purifié pour une analyse future.

Certaines protéines se trouvent dans la bicouche lipidique d’une cellule et sont généralement étudiées en les intercalant dans des vésicules lipidiques sphériques appelées liposomes. Les protéines et les lipides sont d’abord extraits à l’aide d’un détergent. La dialyse peut être utilisée pour éliminer lentement le détergent, formant des protéoliposomes.

Après purification, certaines protéines sont mal repliées ou dénaturées, ce qui entraîne une perte de fonctionnalité. Les composés à l’origine de ces changements de structure peuvent être éliminés par dialyse, ce qui entraîne la reformation des analytes fonctionnels.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la dialyse. Vous devriez maintenant comprendre cette méthode basée sur la diffusion, une procédure expérimentale simple, et l’utilisation de cette technique.

Merci d’avoir regardé !