Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

L’objectif global de ce test d’interférométrie de biocouche, ou BILI, est de mesurer l’interaction potentielle entre la protéine purifiée du canal ionique hEAG1 et les lipides à petites molécules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pharmacologie des canaux ioniques, par exemple si la petite molécule d’intérêt peut interagir directement avec ce canal ionique et quelle est la cinétique de l’interaction ? Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode sans main-d’œuvre et à haut débit.

Seule une petite quantité de protéines immobilisées est nécessaire. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car un test réussi implique plusieurs étapes, notamment l’expression des protéines, la purification, le marquage, le capteur réglé avec précision et l’analyse des données. Après avoir cultivé des lymphocytes T HEK293 exprimant hEAG1 pendant deux à trois jours, récoltez les cellules en retirant le milieu de croissance et utilisez quatre millilitres de PBS pour laver les cellules deux fois.

Jetez le PBS. Scapez les cellules en deux millilitres de PBS par boîte et utilisez une pipette d’un millilitre pour transférer dans les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 420 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, décantez le surnageant et utilisez quatre millilitres de tampon de lyse pour remettre la pastille en suspension. Incuber la suspension sur de la glace pendant 30 minutes, en faisant tourbillonner complètement le lysat toutes les 10 minutes. Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 12 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, transférez le surnageant dans un tube de cinq millilitres et conservez-le sur de la glace pour une utilisation immédiate. Pour préparer la résine d’affinité anti-FLAG M2, suspendez soigneusement la résine par inversion douce pour vous assurer que le flacon de gel ffinity anti-FLAG M2 est une suspension uniforme de billes de gel. Transférez immédiatement 400 microlitres de suspension dans un tube réfrigéré de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifugez la suspension à 8 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 30 secondes, et jetez soigneusement le surnageant pour éliminer le tampon de stockage. Pour remettre la pastille de résine en suspension, ajoutez 500 microlitres de surnageant d’extrait de protéine à la résine et transférez la suspension dans un nouveau tube réfrigéré de cinq millilitres. Pipetez 500 microlitres supplémentaires d’extrait de protéine dans le tube d’origine pour recueillir les billes restantes, puis transférez l’extrait dans le tube de cinq millilitres.

Incuber le mélange sur un agitateur à huit tr/min et quatre degrés Celsius pendant la nuit pour lier la protéine de fusion FLAG à la résine. Ensuite, centrifugez le mélange à 1 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et lavez le granulé trois fois avec 500 microlitres d’un x PBS.

Gardez-le sur de la glace pour une utilisation immédiate. Ajouter 10 microlitres de solution d’élution trois x FLAG à 390 microlitres de PBS pour une concentration finale de 200 nanogrammes par microlitre. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de solution d’élution trois x FLAG aux billes de gel préalablement préparées.

Incuber l’échantillon sur un incubateur à agitation à huit tr/min et quatre degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, centrifugez la résine à 8000 fois la gravité pendant 30 secondes. Transférez le surnageant dans un tube frais de 1,5 millilitre et conservez-le à quatre degrés Celsius pour une utilisation immédiate.

Utilisez le dosage des protéines BCA selon les instructions du fabricant pour déterminer la concentration de la protéine purifiée. Ensuite, utilisez un échantillon de 30 microlitres pour l’analyse Western Blot avec un anticorps anti-Flag pour confirmer que la protéine d’intérêt a été purifiée. Pour marquer la protéine purifiée avec de la biotine, préparez cinq milligrammes par millilitre de solution mère de biotine dans du PBS.

Pour chaque test de deux biocapteurs, ajoutez un excès de biotine de trois fois molaire à 20 microgrammes de protéine purifiée pour obtenir une biotinylation N-terminale préférable de la protéine purifiée dans le PBS. Incuber l’échantillon dans l’obscurité sur de la glace pendant au moins 30 minutes. Pour éliminer la biotine et le tampon non liés, échangez la protéine dans un tampon SD.

Transférez la protéine dans un dispositif d’ultrafiltration avec une coupure moléculaire de 30 kilodaltons. Ensuite, ajoutez un tampon SD et centrifugez l’échantillon à 12 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez l’ultrafiltrat du tube à centrifuger.

Ajoutez 200 microlitres de tampon SD dans le dispositif de filtration et centrifugez à nouveau l’échantillon. Répétez le processus au moins trois fois. Prélevez l’échantillon de tampon échangé en retournant le dispositif de filtration et placez-le dans un tube de 1,5 millilitre.

Centrifugez l’échantillon à 2 000 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Conservez l’échantillon sur de la glace pour une utilisation immédiate. Pour effectuer le test BLI, 30 minutes avant l’étude, préchauffez l’équipement en allumant l’instrument.

Vérifiez la fenêtre d’état de l’instrument pour confirmer que la machine est à l’état prêt avant de commencer. Assurez-vous que la porte de l’instrument est fermée avant d’ouvrir le logiciel d’acquisition de données et dans l’assistant d’expérience, choisissez la nouvelle expérience Cinétique. Définissez les puits à utiliser sur la plaque à 96 puits en cliquant avec le bouton droit de la souris pour choisir le tampon, la charge et l’échantillon.

Pour les puits d’échantillonnage, l’unité de concentration de PIP2 doit être indiquée sous forme de molaires. Pour définir les étapes de test, choisissez une étape et double-cliquez sur la colonne correspondante. Une copie de la définition du test est définie pour les capteurs de contrôle.

Réglez le régime sur 1 000. Choisissez une minute pour l’étape de base et cinq à 10 minutes pour le chargement, l’association et la dissociation respectivement. Effectuez le test à température ambiante.

Cliquez sur les colonnes qui contiennent les capteurs, puis cliquez sur Remplir pour indiquer l’emplacement des capteurs dans le plateau des capteurs. Passez en revue toutes les étapes prévues pour vérifier les erreurs et revenez en arrière pour les corriger. Dans l’ensemble du fonctionnement du test BLI, l’étape de l’examen de toutes les étapes prévues pourrait être négligée par le chercheur.

Cependant, il est très important de vérifier que toutes les étapes prévues sont correctes. Définissez l’emplacement des fichiers de données et cliquez sur OK pour démarrer le test. Exécutez le test et analysez les données selon le protocole texte.

Comme on le voit dans cette expérience de patch clamp dans une cellule T HEK293, exprimant de manière stable hEAG1, les courants potassiques sortants dépendants de la tension suggèrent que les canaux hEAG1 fonctionnels sont fortement exprimés dans les cellules. À l’aide de l’anticorps anti-FLAG, ce Western Blot de hEAG1 provenant d’échantillons de protéines purifiées indique la qualité et la spécificité de la protéine purifiée. La protéine du canal purifié a été biotinylée pour effectuer un test d’interaction avec le lipide PIP2 en utilisant le test BLI en temps réel.

Une courbe de liaison typique entre hEAG1 et PIP2 est illustrée ici. hEAG1 est lié à PIP2 d’une manière dépendante de la concentration. Les concentrations cumulées de PIP2 correspondent aux traces de données du biocapteur.

Ce test représentatif montre les changements dans les interférences optiques à différentes concentrations de PIP2. Enfin, une courbe ajustée à l’équation de Hill a été obtenue à partir de la valeur de crête du signal d’interférence optique mesurée à différentes concentrations de PIP2 et a déterminé les constantes de dissociation d’équilibre entre hEAG1 et PIP2. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est très important de ne pas oublier de passer en revue toutes les étapes prévues, pour vous assurer que cette procédure est correcte. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le patch clamp peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de la fonction de ce canal ionique après la liaison de la petite molécule. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du criblage de ligands des canaux ioniques pour explorer les nouveaux ligands dans la découverte de médicaments à canaux ioniques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer la protéine de canal ionique et de tester son interaction avec de petites molécules, avec la méthode BILI.