4.11: Ultracentrifugation en gradient de densité

L’ultracentrifugation à gradient de densité est une approche courante pour isoler et purifier les structures cellulaires pour des expériences biochimiques. La technique utilise une centrifugeuse à grande vitesse, ou ultra, pour séparer de manière non destructive les composants cellulaires dans un gradient de densité. Cette vidéo décrit les principes de l’ultracentrifugation par gradient de densité, fournit une procédure générale utilisant un gradient de saccharose et aborde certaines applications.

Commençons par examiner les principes des ultracentrifugeuses et des gradients de densité. Une suspension contient des particules dans un solvant liquide. En raison de la gravité, les particules plus denses que le solvant se sédimentent tandis que celles moins denses que le solvant flottent. Plus la différence de densité entre la particule et le solvant est grande, plus la séparation est rapide.

Une ultracentrifugeuse contient une unité appelée rotor, qui tourne à des vitesses hautement contrôlées, simulant un fort champ gravitationnel. Dans ce domaine, les différences de densité entre les particules et le solvant sont amplifiées.

L’intensité du champ dépend de la vitesse de rotation. Même un petit rotor à une vitesse de rotation relativement faible peut créer une force des milliers de fois plus forte que le champ gravitationnel terrestre.

Si un tube contient plusieurs liquides de densités différentes, la centrifugation les maintiendra en couches séparées par ordre de densité, le liquide le plus dense étant le plus proche de la base. Une telle superposition de plusieurs liquides est appelée « gradient de densité ». Il en existe deux types. Dans les dégradés de marches, des liquides de densité décroissante sont soigneusement superposés les uns sur les autres. Dans les gradients continus, les liquides sont mélangés dans des proportions variables, de sorte que la densité diminue doucement de la base vers le haut.

Les organites cellulaires peuvent être séparés à l’aide d’un gradient de gradation, par « centrifugation isopycnique à gradient de densité ». Il s’agit de la procédure de centrifugation la plus simple et la plus courante.

Cette procédure est utilisée pour séparer les structures cellulaires. Plus l’organite est dense, plus il descend loin, avec les mitochondries en haut et les acides nucléiques en bas.

Maintenant que vous connaissez les principes qui sous-tendent la technique, voyons-la en laboratoire.

Avant de commencer la procédure, les cotes de vitesse et de densité du fabricant doivent être notées et la machine à ultracentrifuger doit être vérifiée pour détecter la corrosion. Cette procédure utilise un rotor à godet oscillant.

Tout d’abord, le matériel cellulaire est préparé en homogénéisant les cellules, ce qui libère leurs organites de manière non destructive. L’homogénat peut être fractionné par centrifugation préliminaire à basse vitesse, afin d’éliminer les composants de faible densité. Ensuite, les solutions de saccharose sont préparées.

Le saccharose est ajouté en quantités croissantes de sorte que chaque solution est plus concentrée, et donc plus dense, que la précédente. Les densités exactes des solutions dépendront des composants à séparer, qui varient entre les organismes. Les solutions doivent avoir des densités entre celles des composants à séparer, la dernière solution étant plus dense que le composant le plus dense de l’analyte. Des techniques de séparation de composants plus denses que le saccharose, comme les acides nucléiques, sont décrites dans les applications.

Le gradient de saccharose est maintenant créé dans un tube de centrifugation propre. Une pipette est utilisée pour aspirer la solution de saccharose la plus concentrée. Avec le tube maintenu à la verticale, la pointe de la pipette est placée haut contre la paroi et le liquide est distribué régulièrement vers le bas. Il est important que la zone de travail soit exempte de vibrations et d’autres perturbations.

Après avoir remplacé l’embout, les solutions restantes sont ajoutées par ordre de densité décroissante. Ils sont distribués avec soin pour former des couches distinctes et éviter le mélange. Enfin, environ un demi-millilitre de l’échantillon cellulaire est ajouté au sommet du gradient et le tube est pesé. Ceci est utilisé pour équilibrer la répartition du poids, l’étape suivante du processus.

La centrifugation doit commencer dès que possible. Le tube est placé dans le rotor, qui est ensuite équilibré en plaçant des solutions vierges de poids égal dans des fentes opposées. Le rotor est placé dans l’ultracentrifugeuse et le système est scellé. La température, la vitesse de rotation et le temps sont réglés. Les valeurs typiques sont 4 ? C avec une force supérieure à 100 000 x g pendant 16 h.

Après centrifugation, le tube est retiré du rotor, en prenant soin de le maintenir droit et non perturbé. Les différents composants cellulaires se sont fractionnés en bandes discrètes entre les couches de solution. Les fractions peuvent être collectées à l’aide d’une seringue. Alternativement, le fond du tube peut être perforé à l’aide d’une aiguille fine et stérilisée et l’écoulement peut être collecté dans des tubes stériles. Les composants cellulaires ont maintenant été isolés. Ils peuvent être stockés à -80 ?C.

Maintenant que nous avons vu la procédure de base, regardons quelques applications.

Une application typique est l’isolement de complexes multiprotéiques dans des cellules végétales. Dans cet exemple, les complexes responsables du flux cyclique d’électrons sont isolés du thylakoïde, le site de la réaction lumineuse dans la photosynthèse. Cette procédure utilise des solutions discrètes de 14 à 45 % de saccharose. La centrifugation se produit au-dessus de 100 000 x g pendant 14 h à 4 °C.

Parce que les acides nucléiques sont plus denses que le saccharose, la centrifugation isopycnique ne peut pas les séparer des organites de manière non destructive.

Une technique différente, connue sous le nom de « centrifugation zonale à vitesse élevée », est utilisée. Il sépare les organites en fonction de leur vitesse de sédimentation, qui dépend non seulement de leur densité, mais aussi de leurs conformations. Un dégradé continu est utilisé pour séparer les composants en fonction de cette propriété.

Les étapes de la procédure sont similaires à celles des cas isopycniques. Dans cet exemple, les complexes ARN-ribosome sont isolés à l’aide d’un gradient continu de 5 % à 20 %, centrifugé à 230 000 x g. La centrifugation est interrompue au bout de quelques heures pour éviter les co-précipitations.

Les brins d’acide nucléique peuvent être séparés les uns des autres en fonction de leur densité.

En effet, les brins riches en guanine et en cytosine sont plus denses que ceux riches en adénine et en thiamine. Dans ce cas, le gradient ne peut pas être constitué de saccharose, car le saccharose est moins dense que les acides nucléiques. Au lieu de cela, des gradients de chlorure de césium, généralement de 1,65 à 1,75 g/mL, sont utilisés, car ils ont une densité suffisante et une faible viscosité.

Ici, nous voyons l’ADN du plancton purifié à l’aide d’un gradient continu de chlorure de césium. La centrifugation se produit à plus de 1 000 000 x g pendant 18 h sous vide.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’ultracentrifugation avec un gradient de densité de saccharose. Vous devez maintenant comprendre comment fonctionne un gradient de densité, comment construire un gradient de pas et comment charger et faire fonctionner une ultracentrifugeuse. Merci d’avoir regardé !