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Mesure de la concentration est une étape fondamentale de nombreuses épreuves biochimiques. Détermination photométrique protéine tire parti du fait que plus un échantillon contient des substances absorbant la lumière, moins la lumière transmettra à travers elle. La relation entre la concentration et l’absorption étant linéaire, ce phénomène peut être utilisé pour mesurer la concentration dans les échantillons où on ne sait pas.
Cette vidéo décrit les rudiments de la détermination des protéines photométrique et introduit l’analyse de Bradford et la méthode de Lowry. La procédure décrite dans la vidéo couvrira une analyse typique de Bradford. Les applications couvertes incluent une mesure directe de très petites quantités d’acides nucléiques pour caractériser la concentration et de la pureté, la détermination de l’efficacité d’un matériau biomimétiques et une autre variante de détermination photométrique de protéine à l’aide de colorant Remazol de couplage.
Détermination de la concentration d’une protéine dans les échantillons est une étape fondamentale dans nombreuses épreuves biochimiques. Détermination photométrique peut être faite avec la petite taille des échantillons. Plus un échantillon contient des substances absorbant la lumière, moins la lumière transmettra à travers elle. Ceci fournit une mesure quantitative des substances absorbantes. Ces concepts sont si essentielle à la science que les articles qui introduit deux des techniques sont dans le trois plus cité dans les documents de tous les temps. Cette vidéo va montrer les concepts derrière certains de la protéine photométrique plus commune des techniques de dosage, comment ils sont effectués, et comment les données recueillies sont analysées.
Détermination des protéines photométrique est basée sur la relation entre la concentration et la capacité d’absorption lumineuse. Ceci est connu comme la Loi de Beer-Lambert, qui stipule que la concentration d’une espèce absorbant la lumière est proportionnelle à son absorbance.
Ce principe sous-tend toutes les méthodes de détermination photométrique de protéine.
Pour l’analyse de l’absorption directe, les valeurs d’absorbance des échantillons de protéines non altérées sont mesurés. En raison de leur chaîne latérale aromatique, résidus de tryptophane et de la tyrosine donnent les plus hautes mesures d’absorbance à une longueur d’onde de 280 nm.
Toutefois, ces acides aminés, qui sont deux des protéines-sont moins fréquemment trouvé dans présents en quantités différentes dans chaque protéine, donc chaque dosage est unique. Pour surmonter cette limitation, les dosages plus complexes-qui ne sont pas dépendants de ces acides aminés-ont été développés.
Un exemple est l’analyse de Bradford, où colorant coloré est ajouté à l’échantillon. Le colorant appelé bleu de Coomassie, répond proportionnellement le plus de protéines présentes, les liaison des événements plus avec le colorant.
Ensuite, la concentration de protéines est déterminée en mesurant l’absorbance du colorant bleu de Coomassie lié, qui absorbe la lumière à 594 nm. Toutefois, l’analyse de Bradford est linéaire sur un court intervalle de concentrations, donc dilutions sont souvent nécessaires avant l’analyse.
La méthode de Lowry combine le réactif du Biuret, une solution alcaline d’ions de cuivre qui réagissent avec les liaisons peptidiques et le réactif de Folin-Ciocâlteu, qui oxyde les résidus protéiques aromatiques. Le changement de la couleur résultante de l’échantillon est proportionnel à la concentration de protéine.
L’absorbance du réactif de Folin réduit peut être déterminée à 750 nm. Comme l’absorption directe, chaque protéine a une réponse unique et doit être étalonné pour la protéine d’intérêt. Maintenant que nous avons passé en revue les principes fondamentaux derrière certaines des analyses plus courantes, nous allons étudier comment direct d’absorption et de l’analyse de Bradford sont effectuées.
Pour commencer une analyse directe de l’absorption, le spectrophotomètre est calibré avec un blanc pour déterminer le zéro d’absorbance. Solutions étalons sont préparées à utiliser pour la création de la courbe d’étalonnage. Ensuite, une partie aliquote de la première norme est ajoutée à une cuvette et placée dans le spectrophotomètre.
La valeur d’absorbance à 280 nm est alors enregistrée. Ce processus est répété pour chaque norme, à l’aide d’une cuvette propre de chaque série. Une fois terminé, une courbe d’étalonnage est créée en traçant l’absorbance versus la concentration. La pente de cette droite est le coefficient d’atténuation molaire, qui concerne l’absorbance à la concentration.
Ensuite, l’échantillon inconnu est ajouté à une cuvette, et la valeur de l’absorbance est enregistrée. Comme l’analyse des données pour les méthodes de détermination photométrique différente est similaire, nous allons couvrir qui après que nous regarder l’analyse de Bradford.
Ici, l’analyse de protéine de Bradford est réalisée avec une norme de BSA sur une plaque à 96 puits. Pour commencer, BSA solutions mères sont préparées.
Les solutions inconnues sont diluées avec de l’eau déionisée pour s’assurer que les concentrations sont à portée de l’essai. Selon le kit, le colorant bleu de Coomassie peut également exiger dilution. Ensuite, la courbe d’étalonnage est mises en place en ajoutant les normes de BSA à la plaque à 96 puits.
L’eau déminéralisée est ajouté pour atteindre la concentration nécessaire pour générer une courbe d’étalonnage. L’échantillon inconnu s’ajouteront à la plaque en réanalysés pour assurer qu'une mesure précise est prise ; Colorant bleu de Coomassie est ensuite ajouté à chaque puits, mélanger à l’aide de la pipette.
L’eau déminéralisée est ajouté à un puits vide comme un blanc, pour mesurer l’absorbance. Après avoir attendu 5 min pour le colorant lier, l’absorbance est mesurée dans un lecteur de plaque à 590 nm.
Maintenant que nous avons effectué quelques tests, regardons comment analyser les données. Chaque méthode de détermination photométrique de protéine est issu de la Loi de Beer-Lambert.
L’absorbance mesurée des normes est utilisé pour créer une courbe d’étalonnage, qui est ensuite utilisée pour déterminer la concentration des échantillons inconnus. Cette courbe peut être tracée manuellement, même si les plus récents outils spectrophotométriques créera la courbe d’étalonnage, une fois que tous les standards ont été mesurées. Ces systèmes calculera également la concentration de protéines comme échantillons inconnus sont analysés.
Maintenant que nous avons examiné comment analyser des données de détermination photométrique de protéine, regardons quelques-unes des façons que ces procédures sont utilisées.
Les principes de détermination photométrique protéine permet également de mesurer directement la concentration de l’acide nucléique. Le spectrophotomètre nanodrop accepte des échantillons de très petit volume sur un piédestal optiquement actif. L’absorbance est alors mesurée, et le système détermine automatiquement la concentration de l’acide nucléique. Parce que les protéines et autres sources peuvent interférer avec les mesures, pureté de l’échantillon est déterminée en analysant les 260 à 280 nm et ratios absorbance de 260 à 230 nm. Acides nucléiques purs donnent généralement ratios d’environ 1,8 et environ 2,0 pour ADN et d’ARN, respectivement.
Détermination photométrique de protéine peut également servir dans la production de matériaux biomimétiques, qui s’inspirent de la nature pour provoquer des réponses cellulaires spécifiques. Adhésines recombinantes sont tenus de billes de polystyrène pour simuler l’attachement des bactéries aux cellules hôtes. L’analyse de Bradford est utilisée pour déterminer l’efficacité du couplage de l’adhérence recombinant aux billes dans la production des matériaux biomimétiques.
Dosages de protéines photométrique alternative peuvent être utilisés dans la détection et la caractérisation d’antimicrobiens de protéine. Remazol brillant R des bleu covalente aux bactéries tuées par la chaleur. La protéine antimicrobienne est incubée dans la solution teinte. Puis, l’échantillon est centrifugée et l’absorption du liquide surnageant à 595 nm est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre microplaques. Absorbance accrue, de colorant soluble libéré dans le surnageant de la bactérie étiquetée, est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur détermination photométrique de protéine. Cette vidéo décrit les principes qui sous-tendent la détermination photométrique, passe des procédures générales pour certains tests communs et couverts de quelques nouveaux progrès dans les techniques. Merci de regarder !
La détermination de la concentration d’une protéine dans les échantillons est une étape fondamentale dans de nombreux essais biochimiques. La détermination photométrique peut être effectuée avec des échantillons de petite taille. Plus un échantillon contient de substances absorbant la lumière, moins la lumière passera à travers lui. Cela permet d’obtenir une mesure quantitative des substances absorbantes. Ces concepts sont si fondamentaux pour la science que les articles qui ont introduit deux des techniques figurent dans les trois articles les plus cités de tous les temps. Cette vidéo montrera les concepts qui sous-tendent certaines des techniques de détermination photométrique des protéines les plus courantes, comment elles sont exécutées et comment les données recueillies sont analysées.
La détermination photométrique des protéines est basée sur la relation entre la concentration et l’absorption de la lumière. C’est ce qu’on appelle la loi de Beer-Lambert, qui stipule que la concentration d’une espèce absorbant la lumière est proportionnelle à son absorbance.
Ce principe sous-tend toutes les méthodes de détermination photométrique des protéines.
Pour l’analyse d’absorption directe, les valeurs d’absorbance d’échantillons de protéines non modifiées sont mesurées. En raison de leurs chaînes latérales aromatiques, les résidus de tryptophane et de tyrosine donnent les lectures d’absorbance les plus élevées à une longueur d’onde de 280 nm.
Cependant, ces acides aminés, qui sont deux des moins fréquemment trouvés dans les protéines, sont présents en quantités différentes dans chaque protéine, de sorte que chaque détermination est unique. Pour surmonter cette limitation, des tests plus complexes, qui ne dépendent pas de ces acides aminés, ont été développés.
Un exemple est le test de Bradford, où un colorant coloré est ajouté à l’échantillon. Le colorant, connu sous le nom de bleu Coomassie, réagit proportionnellement - plus il y a de protéines, plus il y a d’événements de liaison avec le colorant.
Ensuite, la concentration en protéines est déterminée en mesurant l’absorbance du colorant lié Coomassie Blue, qui absorbe la lumière à 594 nm. Cependant, le test de Bradford est linéaire sur une courte plage de concentrations, de sorte que des dilutions sont souvent nécessaires avant l’analyse.
La méthode Lowry combine le réactif Biuret, une solution alcaline d’ions cuivre qui réagit avec les liaisons peptidiques, et le réactif Folin-Cioc ?lteu, qui oxyde les résidus de protéines aromatiques. Le changement de couleur de l’échantillon qui en résulte est proportionnel à la concentration en protéines.
L’absorbance du réactif Folin réduit peut être déterminée à 750 nm. Comme l’absorption directe, chaque protéine a une réponse unique et doit être calibrée pour la protéine d’intérêt. Maintenant que nous avons passé en revue les principes de base de certains des tests les plus courants, voyons comment l’absorption directe et le test Bradford sont effectués.
Pour commencer une analyse d’absorption directe, le spectrophotomètre est étalonné à l’aide d’un blanc afin de déterminer l’absorbance nulle. Des solutions standard sont préparées pour être utilisées dans la création de la courbe d’étalonnage. Ensuite, une aliquote du premier étalon est ajoutée à une cuvette et placée dans le spectrophotomètre.
La valeur d’absorbance à 280 nm est ensuite enregistrée. Ce processus est répété pour chaque étalon, à l’aide d’une cuvette propre pour chaque tirage. Une fois l’opération terminée, une courbe d’étalonnage est créée en traçant l’absorbance en fonction de la concentration. La pente de cette droite est le coefficient d’atténuation molaire, qui relie l’absorbance à la concentration.
Ensuite, l’échantillon inconnu est ajouté à une cuvette et la valeur d’absorbance est enregistrée. Comme l’analyse des données pour les différentes méthodes de détermination photométrique est similaire, nous aborderons cela après avoir examiné le test de Bradford.
Ici, le dosage des protéines Bradford est effectué avec un étalon BSA sur une plaque de 96 puits. Pour commencer, des solutions-mères BSA sont préparées.
Les solutions inconnues sont diluées avec de l’eau désionisée pour s’assurer que les concentrations se situent dans la plage du test. Selon le kit, le colorant Coomassie peut également nécessiter une dilution. Ensuite, la courbe d’étalonnage est établie en ajoutant les étalons BSA à la plaque de 96 puits.
De l’eau déminéralisée est ajoutée pour atteindre la concentration nécessaire pour générer une courbe standard. L’échantillon inconnu doit être ajouté à la plaque en trois exemplaires pour s’assurer qu’une mesure précise est prise. Le colorant Coomassie est ensuite ajouté à chaque puits, en le mélangeant avec la pipette.
De l’eau déminéralisée est ajoutée à un puits vide comme un blanc, pour mesurer l’absorbance. Après avoir attendu 5 min pour que le colorant se lie, l’absorbance est mesurée dans un lecteur de plaques à 590 nm.
Maintenant que nous avons effectué quelques essais, voyons comment analyser les données. Chaque méthode photométrique de détermination des protéines est basée sur la loi de Beer-Lambert.
L’absorbance mesurée des étalons est utilisée pour créer une courbe d’étalonnage, qui est ensuite utilisée pour déterminer la concentration d’échantillons inconnus. Cette courbe peut être tracée manuellement, bien que de nouveaux outils spectrophotométriques créent la courbe d’étalonnage une fois que tous les étalons ont été mesurés. Ces systèmes calculeront également la concentration en protéines au fur et à mesure de l’analyse d’échantillons inconnus.
Maintenant que nous avons vu comment analyser les données de détermination photométrique des protéines, examinons certaines des façons dont ces procédures sont utilisées.
Les principes de détermination photométrique des protéines peuvent également être utilisés pour mesurer directement la concentration en acide nucléique. Le spectrophotomètre nanodrop accepte des échantillons de très petit volume sur un socle optiquement actif. L’absorbance est ensuite mesurée et le système détermine automatiquement la concentration en acide nucléique. Étant donné que les protéines et d’autres sources peuvent interférer avec les mesures, la pureté de l’échantillon est déterminée en analysant les rapports d’absorbance de 260 à 280 nm et de 260 à 230 nm. Les acides nucléiques purs produisent généralement des ratios d’environ 1,8 et d’environ 2,0 pour l’ADN et l’ARN, respectivement.
La détermination photométrique des protéines peut également être utilisée dans la production de matériaux biomimétiques, qui s’inspirent de la nature pour susciter des réponses cellulaires spécifiques. Les adhésines recombinantes sont liées à des billes de polystyrène pour simuler l’attachement bactérien aux cellules hôtes. Le test de Bradford est utilisé pour déterminer l’efficacité de couplage de l’adhésion recombinante aux billes dans la production du matériau biomimétique.
D’autres dosages photométriques des protéines peuvent être utilisés pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens protéiques. Le colorant R bleu brillant Remazol est lié de manière covalente aux bactéries tuées par la chaleur. La protéine antimicrobienne est incubée dans la solution teintée. Ensuite, l’échantillon est centrifugé et l’absorbance du surnageant à 595 nm est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. L’augmentation de l’absorbance, par le colorant soluble libéré dans le surnageant par les bactéries marquées, est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la détermination photométrique des protéines. Cette vidéo décrivait les principes sous-jacents de la détermination photométrique, passait en revue les procédures générales pour certains tests courants et couvrait certaines nouvelles avancées techniques. Merci d’avoir regardé !
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