À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la dynamique de systèmes protéiques complexes de manière quantitative en mettant l’accent sur les interactions corrélées telles que la coopérativité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie quantitative où les complexes protéiques et leurs interactions dynamiques sont d’une importance centrale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’appliquer des FRET monomoléculaires multicolores dynamiques à des systèmes biologiquement pertinents.

Avant d’assembler la chambre d’écoulement, découpez un canal d’écoulement dans un film adhésif transparent de 40 microns d’épaisseur, pulvérisez un adhésif à fixation rapide sur le côté non adhésif du film et laissez sécher l’adhésif. Pour commencer l’assemblage de la chambre d’écoulement, procurez-vous une lame de quartz fondu fonctionnalisée PEG de trois millimètres d’épaisseur avec des trous d’entrée et de sortie. Appliquez le côté enduit d’adhésif en aérosol du film de plafond sur le côté fonctionnalisé de la diapositive, en alignant le canal avec les crochets d’entrée et de sortie.

Chauffez la diapositive à 80 degrés Celsius sur une plaque chauffante pendant une minute. Appuyez le film sur la lame pendant 30 secondes à l’aide d’une lame de microscope supplémentaire pour répartir uniformément la pression. Ensuite, laissez l’assemblage refroidir pendant une minute.

Décollez la feuille de protection recouvrant l’adhésif. Placez une lamelle sur l’adhésif exposé pour former la chambre d’écoulement. Chauffez la chambre à 80 degrés Celsius pendant une minute.

Appuyez sur la glissière du couvercle sur l’adhésif pendant 30 secondes pour sceller la chambre et laisser refroidir la chambre assemblée. Appliquez une goutte de glycérol sur la face du prisme avant de placer la chambre d’écoulement sur le prisme. Montez la chambre d’écoulement dans un support pour un microscope TIRF multicolore à prisme.

Connectez les tubes d’entrée et de sortie lorsque vous avez terminé. Pour commencer à configurer l’instrument pour la mesure des trois couleurs, ouvrez le logiciel de la caméra CCD multiplicatrice d’électrons, réglez le capteur EMCCD à la température la plus basse possible. Réglez la vitesse de décalage vertical de la caméra sur 3,3 microsecondes, choisissez une tension d’horloge verticale normale, réglez le taux de lecture horizontal sur 17 millihertz à 16 bits, le gain de préamplification sur trois et le niveau de gain du multiplicateur d’électrons sur 1000.

Choisissez le déclenchement d’acquisition externe. Réglez le temps d’exposition sur 70 millisecondes. Et la durée d’enregistrement vidéo à 750 cycles d’acquisition.

Créez un nouveau dossier pour les fichiers de mesure. Activez l’enregistrement automatique dans le logiciel EMCCD et définissez le format de fichier d’image vidéo sur TIFF. Définissez le chemin d’accès au fichier d’enregistrement automatique dans le dossier nouvellement créé.

Ouvrez ensuite le logiciel contrôlant le filtre accordable acousto-optique, le logiciel de contrôle laser et le logiciel de déclenchement synchronisant les lasers, l’AOTF, les obturateurs optiques et les caméras. Utilisez l’AOTF pour régler la puissance du laser à environ trois milliwatts avant d’entrer dans le prisme. Chargez le modèle de déclenchement qui synchronise tous les dispositifs pour l’excitation laser alternative, puis montez le porte-échantillon dans l’instrument.

Placez l’extrémité du tube d’entrée dans un tube de microcentrifugation contenant le tampon d’expérience. Connectez le tube de sortie à un tire-seringue réglé en mode retrait. Rincez la chambre avec 150 microlitres de tampon.

Focaliser la caméra CCD sur l’interface fonctionnalisée, aligner les faisceaux d’excitation et blanchir les contaminants fluorescents. Ensuite, versez 300 microlitres d’une solution de 0,25 milligramme par millilitre d’avidine déglycosylée et tamponnez dans la chambre et incubez pendant une minute. Rincez l’avidine déglycosylée non liée de la chambre avec un tampon.

Ensuite, faites couler 300 microlitres de tampon avec une concentration BSA de 0,5 milligramme par millilitre à travers la chambre pour bloquer les défauts de fonctionnalisation de surface. Ensuite, chargez la chambre d’écoulement avec des portions de 150 microlitres de Hsp90 biotinylé marqué par fluorescence dans un tampon contenant du BSA à des concentrations croissantes de Hsp90 jusqu’à ce qu’une densité de surface suffisante soit atteinte. Laver les protéines non liées de la chambre avec 300 microlitres de tampon contenant du BSA.

Chargez 150 microlitres d’une solution de 25 nanomolaires d’AMP-PMP et de BSA étiquetés contenant un tampon dans la chambre et incubez pendant cinq minutes. Répétez le chargement et l’incubation une fois. Ensuite, utilisez un moteur piézoélectrique pour déplacer la chambre d’échantillon perpendiculairement au faisceau d’excitation afin de modifier le champ de vision comme vous le souhaitez.

Ajustez la mise au point de l’image si nécessaire. Démarrez les enregistrements de la caméra dans le logiciel de la caméra en cliquant sur le bouton de prise de signal comme indiqué. Lancez les cycles d’acquisition d’excitation dans le logiciel de déclenchement pour commencer l’acquisition des données.

Pour commencer l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse et importez les vidéos enregistrées par les deux caméras. Cliquez sur Trouver des traces pour déterminer les traces d’intensité de fluorescence correspondant à des molécules uniques potentielles. Pour chaque molécule, calculez la somme de toutes les traces de cette tache avec la même couleur d’excitation.

Évaluez les profils d’intensité dans tous les canaux pour un plateau à peu près plat dans l’intensité brute conjointe et une seule étape de blanchiment pour toutes les couleurs d’excitation. Recherchez un comportement anti-corrélé dans les canaux de détection appropriés et l’apparition d’une fluorescence rouge dans la trace. Si tous les critères sont remplis, conservez les traces de fluorescence pour une analyse plus approfondie.

Seule la molécule indiquée remplit les critères de cet exemple. Excluez les traces qui n’ont pas de plateaux plats, qui montrent des événements de clignement plutôt qu’une anti-corrélation ou qui ont plusieurs étapes de blanchiment. La sélection de traces est une étape critique dans toutes les techniques à molécule unique.

Seules les traces qui répondent à des critères bien définis doivent être sélectionnées. Ici, ces critères sont l’anti-corrélation, les étapes de blanchiment uniques et les plateaux plats. Ensuite, affichez les molécules enregistrées l’une après l’autre et un ensemble de traces d’intensité sélectionnez un intervalle de temps pendant lequel tous les quatre étages sont déjà blanchis.

Calculez l’intensité de fond du faisceau pour cet intervalle de temps, puis sélectionnez la plage d’efficacité FRET dans laquelle les deux colorants sur Hsp90 sont présents, en veillant à exclure les traces avec des événements de clignotement. Calculez les traces de fluorescence partielle. Exclure les molécules ayant un faible rapport signal/bruit dans les traces.

Ensuite, générez des projections 2D de liaison des données de fluorescence partielle et démarrez l’outil de calcul de la population relative. Cliquez sur Initialiser. Dessinez un polygone autour du pic d’intérêt.

Et cliquez sur le nombre de clics pour calculer la population relative de ce pic. Générez un histogramme 3D des données de fluorescence partielle et normalisez l’histogramme. Dépassez les paramètres initiaux pour un ajustement gaussien 3D et ajoutez les populations d’état à la fin du vecteur de paramètre.

Ajustez les données et affichez les résultats. Après avoir défini la position et la largeur de chaque état dans l’espace fluorescent partiel 3D, initialisez l’interface du modèle de Markov caché. Sélectionnez le nombre d’états, le nombre de dimensions du signal d’entrée et le type d’entrée.

Optimisez les paramètres HMM pour déterminer les estimateurs du maximum de vraisemblance pour les probabilités de transition. Répétez la sélection de la population, l’ajustement et l’optimisation HMM pour les sous-ensembles de données. Enfin, calculez l’intervalle de confiance pour les probabilités de transition et réduisez les états conformationnels pour simplifier les données et permettre une analyse plus approfondie.

Les états conformationnels de la protéine Hsp90 ont été étudiés avec une molécule unique de trois couleurs FRET en présence du nucléotide rapporteur marqué AMP-PMP. Cinq états conformationnels se distinguaient par des intensités de fluorescence, dont quatre étaient fonctionnellement distincts. La FRET à molécule unique tricolore a permis d’obtenir des données de fluorescence partielle couvrant un espace 3D.

Des projections 2D ont été utilisées pour aider à séparer les états, car tous les états théoriquement attendus dans les conditions de l’expérience se distinguent par leur floraison partielle dans les projections 2D. Les populations relatives de ces états ont été déterminées à partir des projections 2D et ont été utilisées comme contraintes pour les ajustements gaussiens 3D. L’optimisation et la modélisation 3D HMM d’ensemble ont fourni les probabilités de transition d’état extraites.

Des intervalles de confiance ont été calculés pour chaque constante de vitesse extraite. La répétition des expériences en présence de 250 micromolaires supplémentaires non marquées AMP-PMP a permis d’élucider l’influence de la liaison d’un nucléotide sur le deuxième site de liaison dans le dimère Hsp90. L’effondrement des conformations liées et non liées a permis de calculer le temps de séjour moyen pour la dissociation fluorescente de l’AMP-PMP de Hsp90 en présence et en l’absence d’AMP-PMP supplémentaire non marqué.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire des informations cinétiques d’un système protéique dynamique à l’aide d’un FRET multicolore et d’un microscope TIRF. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs en sciences de la vie pour déterminer les interactions corrélées dans les systèmes multiprotéiques. Ceci est important pour une compréhension plus approfondie des mécanismes de régulation fondamentaux tels que la coopérativité.