Combinant les dosages quantitatifs-la prise alimentaire et activation par la force des neurones pour étudier l’appétit chez la drosophile

L’objectif global de cette procédure est de mesurer quantitativement l’apport alimentaire de la drosophile adulte, ce qui permet d’évaluer les effets des manipulations génétiques telles que les activations thermogénétiques et optogénétiques des neurones. Ces mesures peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’alimentation, telles que la neuromécanique de la faim, de la satiété et de l’appétit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle quantifie simultanément l’ingestion alimentaire de plusieurs groupes de mouches, ce qui la rend particulièrement utile pour identifier les mouches qui se nourrissent anormalement dans les écrans génétiques.

Pour commencer, rassemblez des fournitures pour préparer le récipient extérieur. Mettez en suspension 0,5 gramme d’agarose et 50 millilitres d’eau distillée deux fois. Chauffer avec une agitation fréquente et faire bouillir pour se dissoudre complètement sur un agitateur magnétique avec une plaque chauffante.

Lorsque l’agarose à 1 % refroidit à environ 60 degrés Celsius, transférez cinq millilitres dans un récipient extérieur vide et gardez le récipient ouvert jusqu’à ce que l’agarose ait refroidi à température ambiante pour donner un tampon d’agarose. Ensuite, ajoutez 0,5 gramme d’agarose à 50 millilitres d’eau doublement distillée. Chauffer en agitant fréquemment et faire bouillir pour se dissoudre complètement sur un agitateur magnétique avec une plaque chauffante.

Lorsque l’agarose à 1 % refroidit à environ 60 degrés Celsius, ajoutez 1,71 gramme de saccharose à l’agarose pour obtenir 100 millimoles de saccharose. Ajoutez 0,25 gramme de colorant bleu à la solution d’agarose pour obtenir 0,5 % de poids par volume d’aliments étiquetés teints. Préparez ensuite le récipient intérieur.

Placez les contenants intérieurs vides sur une surface plane et horizontale. Ajoutez ensuite 750 microlitres d’aliments étiquetés en bleu dans des récipients alimentaires individuels. Laisser solidifier pendant au moins cinq minutes.

Transférez un récipient intérieur rempli dans un récipient extérieur préparé et placez-le au centre du tampon d’agarose. Préparez les chambres d’alimentation avec des aliments sans colorant pour la soustraction de fond. Laissez les chambres d’alimentation ouvertes à température ambiante pendant 40 minutes, jusqu’à ce que la paroi du récipient extérieur soit exempte de condensation.

Avant les expériences comportementales, équilibrez les chambres d’alimentation préparées à la température expérimentale de 30 degrés Celsius pendant deux heures pour vous assurer que la température est relativement uniforme dans les chambres d’alimentation. Pour commencer le processus d’alimentation, transférez soigneusement 20 mouches de leur flacon domestique dans une chambre d’alimentation préchauffée en tapotant doucement. Continuez le processus d’alimentation à 30 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Cessez de vous nourrir en congelant les chambres d’alimentation à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférez soigneusement 20 mouches d’un flacon dans une chambre d’alimentation en tapotant doucement. Ensuite, placez la chambre sur le côté sur la configuration de l’éclairage.

Pour la manipulation optogénétique, utilisez un réseau de LED orange comme source de stimulation lumineuse et fixez une plaque de plexiglas horizontale au-dessus des LED pour soutenir les chambres d’alimentation pendant l’éclairage. Conservez l’installation dans un incubateur à 25 degrés Celsius avec 60 % d’humidité. Stimuler les mouches de contrôle génétique en parallèle avec les mouches Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, mais dans des chambres d’alimentation différentes.

Poursuivez le processus d’alimentation pendant 60 minutes avec rétroéclairage par la lumière orange. Congelez ensuite les chambres d’alimentation à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir cessé de nourrir, versez les 20 mouches de la chambre d’alimentation sur un morceau de papier de pesée.

Transférez-les ensuite dans un tube de 1,5 millilitre à l’aide d’une brosse douce. Ajoutez 500 microlitres de PBST dans le tube et homogénéisez les mouches à l’aide d’un broyeur à 60 hertz pendant cinq secondes. Confirmez ensuite une homogénéisation suffisante par l’observation lorsqu’il n’y a pas de fragments détectables de parties du corps.

Faites tourner les tubes avec des homogénats pendant 30 minutes à 1300 tr/min pour éliminer les débris. Après centrifugation, transférez 100 microlitres de surnageant dans un puits de 96 plaques de puits. Pour éviter les erreurs de calcul des absorbants causées par les débris, retirez délicatement le tube utilisé de la centrifugeuse et déposez délicatement le surnageant sans déranger la palette.

Une fois tous les échantillons chargés, placez la plaque dans un lecteur de plaques pour mesurer les absorbants des échantillons à 630 nanomètres. La réponse alimentaire a été quantifiée en inspectant visuellement et en notant les mouches avec un colorant détectable dans l’intestin. Après l’activation des neurones Taotie, environ 58 % des mouches Taotie dTRPA1 ont présenté de forts comportements alimentaires.

Et 23 % d’entre eux ont montré des comportements alimentaires légers. Les neurones aigus Taotie-GAL4 activés par TRPA1 ont considérablement augmenté l’apport alimentaire, ce qui suggère que les neurones marqués Taotie-GAL4 participent à la régulation de l’apport alimentaire de la drosophile adulte. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la quantité de nourriture ingérée après avoir manipulé l’activité des neurones pour étudier les mécanismes neurologiques du contrôle de l’alimentation chez Drosophila melanogaster adulte.