4.3: Spectrométrie de masse MALDI-TOF

La désorption ionisation laser assistée par matrice, ou MALDI, est une source ionique de spectrométrie de masse idéale pour l’analyse des biomolécules. La plupart des sources d’ions éliminent les informations structurelles des grandes biomolécules fragiles. MALDI maintient l’intégrité structurelle, et donc l’information, tout en accélérant les molécules dans l’analyseur de masse, qui sépare les composés en fonction de leur taille et de leur charge. Le plus couramment couplé avec MALDI est l’analyseur de masse à temps de vol, ou TOF. Cette vidéo montrera les concepts de l’ionisation MALDI, une procédure générale, et certaines de ses utilisations en biochimie.

Pour que la spectrométrie de masse fonctionne, les molécules doivent être ionisées à l’état gazeux. Dans MALDI, l’échantillon est incorporé dans une matrice, généralement un composé organique contenant des doubles liaisons aromatiques et conjuguées.

Lorsqu’une impulsion laser frappe ce mélange, la matrice absorbe la majorité de l’énergie, se réchauffe rapidement et est désorbée, ou libérée, de la surface. La matrice énergisée transfère une partie de son énergie aux biomolécules, les désorbant puis les ionisant.

MALDI est généralement associé à un analyseur de masse à temps de vol, ou TOF. Un champ électrique applique de l’énergie cinétique aux ions, les déplaçant dans une région sans champ appelée tube de dérive. La vitesse des ions lorsqu’ils se déplacent dans le tube est liée à leur rapport masse/charge, de sorte que les particules plus lourdes se déplacent plus lentement à travers l’instrument. Un détecteur à l’extrémité du tube mesure le temps de vol de chaque ion. Grâce à ces connaissances, ainsi qu’à la longueur du tube et à l’intensité du champ appliqué, le rapport masse/charge de chaque ion peut être élucidé.

Ce graphique de l’intensité du signal par rapport masse/charge, connu sous le nom de spectre de masse, peut être comparé à une bibliothèque de spectres collectés. Si aucune correspondance n’est trouvée, les molécules peuvent être identifiées par d’autres techniques, telles que la spectrométrie de masse en tandem. Pour plus d’informations, consultez la vidéo de cette collection sur le sujet.

Maintenant que les bases de MALDI-TOF ont été abordées, examinons le processus en laboratoire.

Avant de commencer une expérience, il est important de réfléchir au choix de la matrice à partir de laquelle les échantillons seront désorbés. Il doit absorber l’énergie laser, être stable dans le vide, ne pas réagir avec les molécules cibles et être capable de se désorber. Selon l’échantillon, différentes matrices sont préférées. Pour une grande protéine, une combinaison de CHCA et de DHB a montré une meilleure séparation des pics, appelée résolution, que les matrices individuelles.

Il existe plusieurs façons de préparer des échantillons. Nous allons montrer ce que l’on appelle la méthode « double couche » ou « sandwich ». Pour commencer, nettoyez la plaque MALDI avec des réactifs ultra-purs, car la spectrométrie de masse est très sensible à la contamination. Séchez la plaque avec un jet de gaz inerte.

Ensuite, une solution matricielle saturée est fabriquée, généralement avec un solvant organique. La solution est striée sur la plaque MALDI et séchée. Une deuxième solution saturée de matrice contenant de l’acide trifluoroacétique, ou TFA, est préparée. L’AFT aide les ions à passer dans la phase gazeuse.

Ensuite, la solution d’échantillon est ajoutée au-dessus de la tache de matrice séchée. Ajouter la solution matricielle contenant l’AFT sur l’échantillon, complétant ainsi le « sandwich » matriciel. L’homogénéité de la tache peut être vérifiée à l’aide d’un microscope de faible puissance.

Plaque un étalon d’étalonnage, qui est un mélange avec une large gamme de masses connues et qui est utilisé pour corréler le temps de vol à m/z. Enfin, plaquez la matrice seule comme contrôle négatif.

Pour analyser les taches, placez la plaque cible dans l’instrument. Assurez-vous qu’il n’y a pas de débris, ce qui permet la formation d’un vide étanche. Dans le logiciel, sélectionnez la norme, le contrôle négatif et les échantillons qui vous intéressent. Étiquetez les taches avec l’identification correcte.

Les tensions de la source d’ions et de la lentille peuvent être manipulées pour améliorer les performances de l’analyse. Cela dépendra des spécificités de l’instrument et de l’échantillon. Concentrez-vous sur le spot standard et étalonnez l’instrument avec le logiciel.

Ensuite, collectez des spectres à partir de chacun des points d’échantillonnage. Essayez plusieurs endroits différents sur place pour maximiser la qualité des données collectées. Une fois terminée, la plaque MALDI peut être récupérée et réutilisée après le nettoyage.

Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, examinons certaines des façons dont MALDI est utilisé et une technique d’ionisation différente.

En plus des biomolécules, MALDI peut être utilisé pour analyser des cellules vivantes. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui prennent l’une des différentes formes, en fonction de leur microenvironnement. Après avoir exposé les cellules à diverses molécules de signalisation, ou cytokines, elles peuvent être ajoutées directement à la plaque et analysées. Les spectres MALDI peuvent être utilisés comme des « empreintes digitales » uniques, en fonction de la cytokine utilisée.

Les échantillons biologiques complexes comme les sécrétions sébacées de mammifères nécessitent une étape de purification avant l’analyse MALDI. La chromatographie sur couche mince est l’une de ces techniques qui repose sur la polarité des composants. Les composés sont collectés à partir du pâté CCM, purifiés et transférés dans une matrice MALDI. Les spectres résultants vérifient l’identité et la pureté des biomolécules séparées des sécrétions sébacées des mammifères.

Une autre source d’ions courante pour les biomolécules est l’ionisation par électronébulisation, ou ESI. Dans cette méthode, l’échantillon est injecté dans l’instrument, où une haute tension est appliquée, créant un aérosol de gouttelettes chargées. Au fur et à mesure que le solvant dans la gouttelette s’évapore, la charge est déplacée vers les molécules de l’échantillon, jusqu’à ce qu’elles soient complètement gazeuses. L’ESI ne nécessite pas la procédure de repérage, et l’échantillon peut être injecté directement dans l’instrument. D’autre part, l’ESI est plus sensible à la présence de composants tampons et d’autres contaminants, ce qui signifie que MALDI est plus robuste.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la spectrométrie de masse MALDI. Cette vidéo décrivait la théorie derrière l’instrument, passait en revue une procédure générale et couvrait certaines des utilisations de la technique. Merci d’avoir regardé !