$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Les enzymes sont des catalyseurs biochimiques essentiels à la vie. Les dosages enzymatiques sont utilisés pour étudier les propriétés cinétiques des réactions enzymatiques, élucidant les effets catalytiques des enzymes. Cette vidéo couvrira la cinétique et les dosages enzymatiques, passera en revue une procédure générale et montrera quelques applications.
Les enzymes sont des protéines, ou moins souvent des ARN, qui agissent sur un réactif spécifique, appelé substrat. Une enzyme réduit l’énergie d’activation nécessaire pour initier une réaction biochimique, ce qui accélère la réaction.
Les réactions enzymatiques peuvent être décomposées en trois composants élémentaires. La première est la formation du complexe enzyme-substrat, formé par la liaison du substrat au site actif de l’enzyme. Le complexe peut se décomposer en ses constituants d’origine. C’est la deuxième réaction élémentaire. Alternativement, le complexe peut former le produit et récupérer l’enzyme, la troisième réaction élémentaire.
La cinétique d’une réaction élémentaire est donnée par l’équation de la loi de vitesse élémentaire. Les équations de la loi de vitesse donnent la vitesse en fonction de la concentration des réactifs et d’une constante de vitesse. Chacune des réactions élémentaires a une équation de loi de vitesse individuelle, avec sa propre constante de vitesse. Ces équations peuvent être distillées dans un modèle cinétique connu sous le nom d’équation de Michaelis-Menten. Cela donne la vitesse de réaction en termes de concentration du substrat ; qui peuvent être déterminées expérimentalement. Certaines tendances générales des réactions enzymatiques peuvent être identifiées à l’aide de l’équation de Michaelis-Menten. À une concentration élevée du substrat, un point de saturation est atteint, appelé Vmax. Ici, le taux est limité par la concentration totale de l’enzyme et le nombre de molécules de substrat qu’une enzyme convertit en produit par temps donné, également connu sous le nom de kcat. Dans la cinétique de Michaelis-Menten, kcat est l’une des deux constantes qui régissent la vitesse de réaction. L’autre constante, KM, est connue sous le nom de constante d’affinité. KM est également équivalent à la concentration où la vitesse de réaction est équivalente à un demi-Vmax . Une enzyme avec une affinité plus élevée aura un KM plus faible et atteindra la Vmax plus rapidement, tandis qu’une enzyme avec une affinité plus faible aura une KM plus élevée et mettra plus de temps à atteindre la Vmax. La connaissance de kcat et KM permet de comparer les enzymes. Pour ce faire, nous utilisons un rapport appelé efficacité enzymatique. Un kcat plus élevé et un KM plus faible entraînent des rendements plus élevés, tandis qu’un kcat plus faible et un KM plus élevé entraînent une efficacité plus faible.
Les facteurs utilisés pour élucider la cinétique enzymatique doivent être déterminés expérimentalement. Ces dosages sont généralement effectués en mélangeant une solution d’enzyme et de substrat dans un environnement contrôlé. Les observations sont faites en mesurant les changements de concentration du substrat, du produit ou des sous-produits par rapport au temps.
Le changement de concentration au fil du temps est utilisé pour déterminer la vitesse de réaction. Afin de déterminer la cinétique, il faut obtenir des données de vitesse à plusieurs concentrations. Si un graphique du taux initial inverse par rapport à la concentration initiale inverse, connu sous le nom de graphique de Lineweaver-Burk, est linéaire, alors la réaction suit la cinétique de Michaelis-Menten. La pente et l’ordonnée à l’origine de la droite permettent de déterminer les paramètres cinétiques KM et Vmax, qui peuvent ensuite être utilisés pour calculer kcat et l’efficacité enzymatique.
Maintenant que les principes de la cinétique enzymatique ont été abordés, voyons comment un dosage enzymatique typique est effectué.
Dans cette procédure, un dosage colorimétrique est mis en évidence. ? La première étape consiste à générer une courbe standard, qui corrélera l’absorbance avec la concentration du substrat. Des solutions de concentration connue sont préparées avec un échantillon de contrôle. Une solution de développement qui réagit avec le substrat est ajoutée pour produire un composé coloré. L’absorbance est mesurée et tracée en fonction de la concentration pour générer la courbe standard.
Pour effectuer le test, une concentration connue de substrat est préparée avec la quantité appropriée d’enzyme. L’enzyme et le substrat sont mélangés et laissés incuber pendant un intervalle de temps déterminé. Le pH et la température sont contrôlés à l’aide de solutions tampons et de blocs chauffants. Un agent de trempe est ajouté pour arrêter la réaction. La solution du développeur est ensuite ajoutée aux réactions et mélangée. Les solutions sont ensuite placées dans des cuvettes et l’absorbance est mesurée. La quantité de substrat consommée est déterminée en comparant l’absorbance mesurée à la courbe standard. À l’aide des données recueillies, les vitesses de réaction initiales sont déterminées en traçant la concentration dans le temps. Enfin, avec les données de taux et de concentration, le graphique de Michaelis-Menten est réalisé. Cela permet de déterminer les propriétés cinétiques de l’enzyme, telles que le nombre de renouvellement et l’efficacité de l’enzyme.
Maintenant que nous avons examiné une procédure de test, examinons d’autres façons dont les tests sont effectués et leurs applications.
Dans cette procédure, l’analyse FRET est utilisée pour étudier la cinétique d’une protéase hydrolysant une liaison peptidique d’une protéine. Ces émissions peuvent être mesurées, ce qui permet une analyse continue et quantitative de la consommation et de la production de substrat, ce qui aide à déterminer la cinétique de la réaction.
Les dosages enzymatiques peuvent être utilisés en sciences de l’environnement pour déterminer les niveaux d’activité enzymatique extracellulaire dans l’environnement. Les eaux, les sols et les sédiments peuvent être prélevés dans l’environnement et traités en laboratoire. L’activité enzymatique extracellulaire de ces matériaux peut ensuite être caractérisée à l’aide de dosages enzymatiques. Il s’agit d’un outil utile pour comprendre comment l’environnement traite les matières organiques.
Le mécanisme de réparation de l’ADN d’une cellule peut être évalué en étudiant la cinétique des enzymes présentes dans le noyau. La vitesse à laquelle une enzyme élimine les lésions ou les dommages à l’ADN peut être mesurée à l’aide de balises moléculaires fluorescentes, qui ne deviennent fluorescentes que lorsqu’elles sont liées à des séquences d’ADN uniques. Le niveau de réparation de l’ADN peut être mesuré en temps réel en détectant les produits de clivage marqués par fluorescence.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la cinétique et les dosages enzymatiques. Cette vidéo expliquait la cinétique des enzymes, couvrait les concepts de test, passait en revue une procédure générale et décrivait certaines applications.
Merci d’avoir regardé !
