4.13: Reconstitution des protéines membranaires

La reconstitution est le processus de restauration d’une biomolécule isolée à sa forme ou à sa fonctionnalité d’origine. Cette approche est souvent utilisée lors de l’étude des protéines membranaires, qui permettent de nombreux processus cellulaires importants et affectent le comportement des lipides voisins. Cependant, la complexité de l’environnement cellulaire rend les fonctions des protéines membranaires difficiles à étudier « in situ ». Les protéines peuvent être extraites et purifiées, mais leurs fonctions réelles ne peuvent pas être évaluées sans membrane. Par conséquent, les protéines membranaires isolées sont « reconstituées » par intégration dans une membrane lipidique artificielle, telle qu’un liposome. Cette vidéo présentera les principes de la reconstitution des protéines membranaires, une procédure générale de reconstitution et quelques applications en biochimie.

Les membranes cellulaires sont principalement constituées de phospholipides et de protéines membranaires. Les phospholipides forment une bicouche dans laquelle les têtes de phosphate hydrophiles interagissent avec l’intérieur et l’extérieur aqueux de la cellule, tandis que les queues d’acides gras hydrophobes interagissent entre elles dans la bicouche.

Certaines protéines membranaires n’interagissent avec la membrane que par des interactions électrostatiques ou non covalentes. D’autres, appelées « protéines intégrales », sont intégrées dans la bicouche lipidique.

Comme la bicouche, les protéines intégrales ont des extrémités hydrophiles et un centre hydrophobe, et sont maintenues en place par des interactions hydrophobes. Les protéines intégrales qui s’étendent sur toute la membrane sont appelées « protéines transmembranaires ».

Les interactions entre ces protéines et la membrane sont si fortes que même la lyse des cellules ne les séparera pas. Un tensioactif spécial appelé détergent est utilisé pour extraire les protéines. Semblables aux phospholipides, les détergents ont des têtes hydrophiles et des queues lipophiles, et peuvent pénétrer librement dans la membrane.

À l’intérieur de la membrane, les queues lipophiles du détergent interagissent avec le noyau protéique hydrophobe. Celle-ci entoure la protéine d’une coquille de têtes détergentes hydrophiles, ce qui perturbe les interactions protéine-lipide.

Le complexe protéine-détergent se sépare maintenant facilement de la membrane. Le détergent rend le complexe soluble dans des solutions aqueuses et prêt à être reconstitué dans une membrane artificielle.

Les protéines sont souvent reconstituées dans les membranes des liposomes, qui sont des vésicules artificielles. Pour préparer les liposomes, les lipides séchés sont hydratés et agités pour induire la formation de vésicules. Lorsqu’un détergent est ajouté, il est incorporé dans les membranes des liposomes.

Pour reconstituer la protéine, les protéines solubilisées et les liposomes sont combinés, puis le détergent est retiré de la solution par dialyse ou adsorption chimique. Les protéines et les liposomes s’assemblent rapidement en protéoliposomes, de sorte que seuls les groupes hydrophiles sont exposés. Les protéines fonctionnent alors comme elles le feraient dans une membrane cellulaire et peuvent être étudiées de manière isolée.

Maintenant que nous avons couvert les bases de la reconstitution des protéines, passons en revue un protocole de reconstitution des protéines membranaires dans les liposomes.

Pour commencer à isoler les protéines membranaires, les cellules sont lysées. Les cellules non brisées sont éliminées par centrifugation.

Le surnageant est centrifugé à une vitesse plus élevée pour granuler les membranes. Le granulé est remis en suspension et un détergent est ajouté pour extraire les protéines.

Les débris cellulaires restants sont éliminés par centrifugation supplémentaire. La protéine est purifiée du surnageant par chromatographie sur colonne, puis concentrée ou purifiée davantage selon les besoins.

Pour commencer à préparer les liposomes, une suspension de phospholipides dans un solvant organique est séchée sous de l’azote ou de l’argon.

Les phospholipides sont hydratés avec un tampon d’hydratation, et le mélange est soniqué pour finir de créer les liposomes.

Un détergent est ajouté pour solubiliser les liposomes, qui sont ensuite combinés avec les protéines.

Le détergent est ensuite éliminé par adsorption sur des billes de polystyrène, une dialyse ou une colonne de liaison détergente. Les protéoliposomes résultants sont prêts à être purifiés et utilisés dans des expériences ultérieures.

Maintenant que vous connaissez les bases d’une procédure de reconstitution de protéines membranaires, examinons quelques applications de la reconstitution des protéines en biochimie.

Une protéine de transport membranaire a été reconstituée pour mieux comprendre son mécanisme de transport. Sa fonction post-reconstitution a été vérifiée avec un efflux d’ions iodure. Ensuite, l’activité de transport a été étudiée en présence de divers inhibiteurs et potentialisateurs de canaux ioniques à petites molécules. De cette façon, les interactions directes de ces petites molécules avec la protéine de transport ont pu être étudiées.

La chlorophylle et les protéines membranaires liant les caroténoïdes dans les plantes récoltent la lumière, favorisent la séparation des charges et atténuent les dommages causés par la lumière. En reconstituant ces protéines collectrices de lumière, leur dynamique de repliement et leur interaction avec les pigments peuvent être étudiées. Les protéines collectrices de lumière reconstituées avec cette technique avaient des propriétés optiques très similaires à celles des protéines natives. La spectroscopie d’émission de fluorescence peut ensuite être utilisée pour étudier le transfert d’énergie des pigments vers les protéines reconstituées qui collectent la lumière.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la reconstitution des protéines membranaires. La reconstitution est un moyen de transférer des protéines importantes à une imitation cellulaire pour une enquête plus approfondie. Cette vidéo couvrait les principes de la reconstitution des protéines, un protocole de reconstitution et quelques applications en biochimie. Merci d’avoir regardé !