Name: TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Découvrez une méthode modifiée d'injection de cellules souches embryonnaires pour augmenter la production de chimères sans équipement supplémentaire. Cette technique simple améliore l'efficacité et réduit les délais de transmission germinale.

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Cette recherche a été financée [en partie] par le programme de recherche intra-muros de la NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Merci à Shyamal Peddada pour l’analyse statistique. Nous tiens également à remercier Humphrey Yao, Gary Bird et Yuki Arao pour l’examen de ce manuscrit et Franco dereve pour ses conseils et son soutien continus.

Toutes les opérations ont été effectuées dans le cadre du fonctionnement normal de l’installation du NIEHS Knock Out souris Core. Toutes les souris ont été maintenus sur un 12:12 cycle h lumière : obscurité et ont été donner une nourriture de NIH-31 et de l’eau ad libitum. Toutes les expériences ont été effectuées conformément à la protection des animaux et le Comité d’urbanisme de l’Institut National de Environmental Health Sciences.
1. la préparation animaux
<ol><li>Race de souris de donateurs, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris femelles à 8-10 semaines d’âge naturellement à B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris mâles entre 8 et 26 semaines d’âge. Bouchons de vérifier visuellement le lendemain matin (E0.5).</li>
	<li>Nichent souris destinataires, Swiss Webster souris femelles entre 6 et 9 semaines d’âge sont naturellement élevés à des souris mâles Swiss Webster vasectomisés. Bouchons de vérifier visuellement le lendemain matin (E0.5).</li>
</ol>2. préparation de cellules ES
<ol><li>129-derieved AB2.2 CSEh, culture des cellules en DMEM supplémenté avec 15 % FBS, 1 % de Glutamine, 1 % Penn/strep et 0,1 % β-mercaptoéthanol. Culture de toutes les autres cellules ES selon les instructions du fournisseur de cellules ES, à l’aide de leurs protocoles recommandés.</li>
</ol>3. la collecte des embryons
<ol><li>
Dissection animale
	<ol>
<li>Préparer plusieurs boîtes de 60 mm, environ 1 par 5 souris plus 3 extra, avec 10 mL blast collection médias (BCM) (10 % BF en DMEM), et un 4 bien plat avec 0,5 mL BCM / puits. Equilibrer à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
		<li>Euthanasier B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J souris femelles à E3.5 à l’aide de CO2 asphyxie, avec un débit de 10 %.</li>
		<li>Après l’euthanasie, placez les souris en décubitus dorsal et mouiller l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Faire la première incision à travers la peau seulement, au milieu de l’abdomen, rendant l’ouverture aussi large que possible. Ensuite, ouvrez à travers la paroi abdominale, encore une fois faire l’incision aussi large que possible. Remarque : Ce faisant en deux étapes permet de réduire ou éliminer la contamination de la fourrure.</li>
		<li>À partir de l’ovaire et tenant de la garniture de l’ovaire avec une pince émoussée, retirer soigneusement l’ovaire, oviducte et utérus, prendre des précautions supplémentaires pour maintenir le tissu adipeux au minimum. Enlever l’utérus comme une seule unité ou cornes individuels, sans changement dans la procédure suivante.</li>
		<li>Après le retrait, placez l’utérus dans un plat de 60 mm contenant les médias collection blast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Élimination de l’embryon
	<ol>
<li>Préparez une seringue de 10 mL remplie de BCM et dotée d’une aiguille 25 G.</li>
		<li>Un utérus à un moment, retirer le plat de la tenue du BCM, les éponger sur un mouchoir en papier pour enlever le sang excédentaire et placer dans un plat de 60 mm sous un grossissement faible binoculaire.</li>
		<li>Tenez soigneusement et délicatement l’utérus juste en dessous de l’extrémité distale (près de l’oviducte) avec pinces de dissection et insérez l’aiguille au centre de l’utérus en parallèle un avion que possible. Insérer l’aiguille juste au-delà de l’extrémité de la pince.</li>
		<li>Appliquer une pression à la pince pour maintenir l’utérus à l’aiguille et d’expulser environ 1 mL de BCM à travers la corne de l’utérus. Remarque : Il faut à cette étape, trop de pression sur la seringue qui provoquerait un flux incontrôlable de médias, laissant souvent le plat.</li>
		<li>Après le rinçage de l’utérus, l’utérus entiers jusqu'à 5 par plat de 60 mm, placer la capsule dans l’incubateur jusqu’en collection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collecte des embryons
	<ol>
<li>À l’aide d’une pipette de verre dessiné de main et un appareil de pipette de bouche, recueillir des blastocystes sous une dissection étendue, situé entre 25 X et 35 X. (Figure 1). Remarque : Appareil de pipette de bouche se compose de 30-40 cm de tuyau flexible, moins de 5 mm ø int. Insérer un 1, 000 de pipette µL, pointez tout d’abord à une extrémité et d’apposer la pipette de verre dedans. Ajouter un filtre de seringue à l’autre extrémité, avec un joint 1 cc seringue, sans piston, d’agir comme un embout buccal.</li>
		<li>Enlèvement des contenants de l’incubateur et à l’aide d’un quadrillage, examinent chaque partie du plat pour les embryons. Les embryons sont pris individuellement vers le haut et placez sur la goutte de BCM dans un plat secondaire.</li>
		<li>Après le rassemblement de tous les plats, laver les embryons une fois de plus une baisse des frais BCM et ensuite placer dans le plat bien 4 pour attendre l’injection.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. embryon Injection
<ol><li>Ramasser les cellules ES individuellement avec l’aiguille d’injection basée sur la confirmation.<ol>
<li>Préparer un plat d’injection en ajoutant 5-7 mL des fluides d’injection (DMEM, 10 % FBS et 20 mM HEPES) à un plat en verre fond injection. Les injections sont effectuées à température ambiante.</li>
		<li>Microinjector un air ou huile, appliquez au vide à l’aiguille d’injection pour dessiner des cellules ES dans. Prenez soin de garder en tant que peu d’espace que possible entre les cellules. Compter les cellules ES ici, ou à l’étape de l’injection.</li>
		<li>Sélectionnez les cellules ES qui sont des moyennes et petites dimensions par rapport à l’ensemble de la population de cellules, avec une surface lisse et sans défauts apparents tels que les vacuoles. Remarque : Les populations de cellules ES varient considérablement en qualité morphologique et les normes utilisées devront s’adapter avec eux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter des embryons avec environ 15 cellules ES (Figure 1).<ol>
<li>Attacher une pipette holding astuce pour un deuxième microinjector d’air et un embryon près de l’ouverture du titulaire du poste. Appliquer le vide pour fixer l’embryon au titulaire.</li>
		<li>Réglage de l’axe z en déplaçant la pipette tenue vers le haut ou vers le bas afin que l’embryon est juste toucher la lame, suivie d’une mise au point fine sur le zona. Ensuite, ajustez l’axe Z de l’aiguille d’injection afin que les cellules ES près de la pointe sont en discussion.</li>
		<li>Réglez maintenant l’embryon en poussant doucement de l’aiguille d’injection en haut ou en bas, tournant pour mettre l’ICM dans la position désirée.</li>
		<li>Insérer l’aiguille d’injection par le zona et l’ICM ou par le trophoblaste, à l’aide d’une pression ferme mais contrôlée. Exercer une légère pression sur le microinjector de l’aiguille d’injection pour aider à empêcher le blastocèle de s’effondrer.</li>
		<li>Une fois l’aiguille a pénétré le blastocèle, appliquer une pression de la microinjector pour transférer les cellules ES vers le blastocèle de l’embryon. Pause brièvement comme le biseau de l’aiguille commence à sortir de l’embryon pour laisser descendre la pression dans l’embryon pour revenir à la normale, tout en conservant les cellules. NOTE : Suite à un traditionnel ES cellules injection protocole9, prenant soin de ne pas pour toucher l’ICM, référence groupe ES des cellules ont été injectées normalement. Les cellules ES étaient aussi injectés par le biais de l’ICM, poussant l’aiguille directement grâce à l’ICM (TICM) (Figure 2film supplémentaire).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. transfert d’eEmbryos
<ol><li>Transfert des embryons de souris Swiss-Webster à E2.5, à l’aide d’un dispositif de transfert d’embryon non chirurgical, par des procédures de la manufacture. Cette procédure non-chirurgicale ne nécessite aucune anesthésie ou soins postopératoires spéciaux. Souris domestiques individuellement après le transfert d’embryons et par livraison et sevrage ultérieur.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.

On a longtemps pensé que toute perturbation de l’ICM pourrait conduire à la mortalité, en effet, les protocoles actuels de microinjection de blastocyste toujours avertissent de cette12,13. Ce que nous avons montré ici est que la microinjection par le biais de l’ICM ne nuire pas à l’embryon et augmente le rendement de chimères.
Le mécanisme exact de cet effet n’a pas été identifié. Cependant, la rupture mécanique de l’ICM et le hypoblas...

Depuis près de 25 ans, la création de souris génétiquement ciblées est un processus lent, souvent entravé par un goulot d’étranglement au stade de blastocystes ES cellules microinjection pour la génération de la lignée germinale transmettant des chimères. Des avancées récentes, y compris CRISPR/Cas91,2 , le ciblage des cellules ES et ES haut débit cell consortiums de génération comme KOMP, ont amélioré la génération/disponibilité des cellules génétiquement modifiées. Cependant, la génération de la lignée germinale chimères reste un goulot d’étranglement dans la création de souris génétiquement modifiées de ces ES cellules3,4. Projets de production de haut débit ES cellules ont été en proie à la grande variabilité dans la qualité de cellules ES, ce qui est essentielle pour le succès de la création de chimères de la lignée germinale. En outre, certains des lignées de cellules ES couramment utilisées sont connus pour aneuploïdie élevée et la production difficile de germline chimères compétentes5.
Plusieurs méthodes ont été développées pour la création de souris avec une chimère soit supérieure ou complètement ES cellule dérivée souris6,7,8,9,10. Alors que chacun de ces systèmes a ses propres mérites, ils ont aussi leurs défauts. La génération de chimères tétraploïdes, tout en générant des cellules ES 100 % provenant de souris, est inefficace et généralement limité à des lignes non consanguins 5,6. Des méthodes plus récentes de l’injection de morula peuvent céder le pourcentage élevé de chimères, approchant les 100 %, mais généralement nécessitent un équipement supplémentaire significatif (lasers ou piezos) et la formation10,11. Dans les laboratoires où ces techniques sont déjà en place, cette nouvelle méthode ne peut pas être nécessaire.
Cette étude avait pour but de trouver une méthode qui utilise les techniques courantes et des équipements disponibles pour augmenter le taux de génération de chimère, augmentant les chances de transmission de la lignée germinale de l’allèle mutant pour établir la colonie de souris ultérieures.

<table><tbody><tr><td>Aiguille d’injection ES Cell</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif NSET</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (technologies de la vie)</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (technologies de la vie)</td><td>10439-024</td><td>Les lots doivent être testés individuellement pour la compatibilité des cellules ES.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946 ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulateur</td><td>Leica</td><td>Micro manipulateur</td><td></td></tr><tr><td>micro-injecteur</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique de 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, États-Unis</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>Souris Swiss Webster</td><td>Taconic, États-Unis</td><td>Tac :SW</td><td></td></tr><tr><td>Injection Dish</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-intérieur cellulaire massive injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Dans le but d’accroître l’efficacité dans la création de souris génétiquement modifiées par l’intermédiaire de méthodes ES cellules, nous présentons une adaptation à l’actuel protocole d’injection de blastocyste. Nous rapportons ici qu’une simple rotation de l’embryon et l’injection à travers une masse cellulaire interne-Trans (TICM) a augmenté le pourcentage de souris chimériques de 31 % à 50 %, sans équipement supplémentaire ou une formation plus spécialisée. 26 différentes lignées autofécondées clones et 35 totales clones ont été injectés sur une période de 9 mois. Il n’y avait aucune différence significative dans les taux de grossesse ou les taux de récupération d’embryons entre des techniques d’injection traditionnelles et TICM. Par conséquent, sans aucune modification majeure dans le processus d’injection et un positionnement simple du blastocyste et injecter par l’intermédiaire de l’ICM, libérant les cellules ES dans la cavité du blastocèle peut potentiellement améliorer la quantité de production chimérique et ultérieures transmission de la lignée germinale.

Traitement de lignée cellulaire comme l’effet aléatoire, un modèle linéaire à effets mixtes a été utilisé pour analyser les données dans le logiciel (p. ex. SAS (version 9.2)). Chaque analyse contrôlée pour le nombre d’embryons transférés et la lignée cellulaire. La deuxième analyse également contrôlée pour le nombre de chiots qui ont survécu.
Pour cette étude, chaque lignée cellulaire ES et clone a été injecté avec traditionnel...

Nous présentons ici un protocole visant à augmenter la production de chimère sans l’utilisation de nouveaux équipements. Un changement d’orientation simple de l’embryon pour injection peut augmenter le nombre d’embryons obtenus et potentiellement réduire la chronologie à la transmission de la lignée germinale.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

L’objectif global de cette procédure modifiée est d’augmenter la production chimérique sans encourir de coûts supplémentaires ni de longues périodes de formation. Cette méthode peut aider les laboratoires à devenir plus efficaces dans la production de chimères, en particulier dans les cas où les cellules ES ne sont pas optimales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun équipement supplémentaire ni aucune formation spécialisée.Thomas Hagler fera la démonstration de la procédure aujourd’hui. C’est un biologiste et un étudiant diplômé qui travaille dans le laboratoire principal. Pour récolter les embryons, épongez l’utérus sur un tissu de laboratoire pour éliminer l’excès de sang et placez l’organe dans une nouvelle boîte de 60 millimètres sous un microscope de dissection à faible grossissement.À l’aide d’une pince à dissectionner pour tenir soigneusement et doucement l’utérus près de l’oviducte, insérez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 10 millilitres contenant 10 millilitres de produit de collecte de souffle au centre de l’utérus juste au-delà des pointes de la pince dans un plan aussi parallèle que possible. Appliquez une pression

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En raison de la chorion dur et d'embryons non alcoolisées, la manipulation d'embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Cette vidéo montre étape par étape, les procédures pour la manipulation des embryons de medaka, y compris dechorionation, montage d'agarose pour l'imagerie et la transplantation de cellules pour la production de chimères. Ces procédures sont essentielles à utiliser le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire de tirer pleinement parti de leur...

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Utiliser pointe fine micropipettes nous injectons ADN plasmidique dans les sous-domaines de somites de poulet ou de tubes neuraux. La concentration du plasmide est ajustée pour produire seule des cellules transfectées. Nous avons ensuite permettre aux cellules de se développer en des populations clonales.

La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

Nous démontrons ici que la reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) peut être utilisé comme un outil pour générer des modèles de souris avec des pré-définis récepteur des cellules T (TCR) des spécificités. Ces souris Transnuclear exprimer la correspondante du TCR de leur locus endogène, sous le contrôle du promoteur endogène.

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