TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

L’objectif global de cette procédure modifiée est d’augmenter la production chimérique sans encourir de coûts supplémentaires ni de longues périodes de formation. Cette méthode peut aider les laboratoires à devenir plus efficaces dans la production de chimères, en particulier dans les cas où les cellules ES ne sont pas optimales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun équipement supplémentaire ni aucune formation spécialisée.

Thomas Hagler fera la démonstration de la procédure aujourd’hui. C’est un biologiste et un étudiant diplômé qui travaille dans le laboratoire principal. Pour récolter les embryons, épongez l’utérus sur un tissu de laboratoire pour éliminer l’excès de sang et placez l’organe dans une nouvelle boîte de 60 millimètres sous un microscope de dissection à faible grossissement.

À l’aide d’une pince à dissectionner pour tenir soigneusement et doucement l’utérus près de l’oviducte, insérez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 10 millilitres contenant 10 millilitres de produit de collecte de souffle au centre de l’utérus juste au-delà des pointes de la pince dans un plan aussi parallèle que possible. Appliquez une pression sur la pince pour fixer l’aiguille dans l’utérus et rincez doucement environ un millilitre de milieu à travers la corne utérine. Lorsque tous les blastocystes ont été expulsés, assemblez l’appareil de pipette buccale et utilisez la pipette buccale pour transférer les embryons individuels dans des gouttes uniques de milieu de collecte de souffle dans une deuxième boîte de 60 millimètres.

Ensuite, lavez chaque embryon dans une deuxième goutte de milieu de collecte et transférez les embryons dans un plat à quatre puits jusqu’à leur injection. Pour commencer, utilisez un micro-injecteur pour appliquer le vide sur l’aiguille d’injection. Placez une boîte de cellules ES sous le microscope d’injection où l’aiguille d’injection et la pipette porte-embryon sont fixées.

Il est essentiel pour la réussite de l’injection de prendre le temps de bien régler le microscope. Cela inclut la quantité appropriée de support dans l’aiguille et l’alignement correct de l’axe z. À l’aide d’un micro-injecteur, appliquez le vide sur l’aiguille d’injection.

En gardant le moins d’espace possible entre les cellules, aspirez des cellules embryonnaires de petite à moyenne taille à surface lisse sans défauts évidents de la boîte d’embryons. Après avoir collecté au moins 15 cellules, placez un embryon près de l’ouverture du support. Appliquez un vide pour fixer l’embryon au support et déplacez la pipette de maintien vers le haut ou vers le bas pour ajuster l’axe z jusqu’à ce que l’embryon touche juste la lame.

Concentrez-vous sur la zone pellucide et ajustez l’axe z de l’aiguille d’injection jusqu’à ce que les cellules embryonnaires près de l’extrémité de l’aiguille soient nettes. Si nécessaire, utilisez l’aiguille d’injection pour faire rouler doucement le blastocyste jusqu’à ce que la masse cellulaire interne soit dans la position appropriée pour l’injection. À l’aide d’une poussée ferme mais contrôlée, insérez l’aiguille d’injection à travers la zone de pellucide dans la masse cellulaire interne et appliquez une légère pression sur le micro-injecteur de l’aiguille d’injection pour aider à empêcher le blastocèle de s’effondrer.

Une fois que l’aiguille a pénétré dans la blastocèle, appliquez une pression sur le micro-injecteur pour transférer toutes les cellules souches embryonnaires dans l’embryon, en faisant une courte pause lorsque le biseau de l’aiguille commence à sortir de l’embryon pour permettre à la pression dans l’embryon de revenir à la normale tout en conservant les cellules. Lorsque tous les blastocystes ont été injectés, utilisez un dispositif de transfert d’embryons non chirurgical pour livrer les embryons au stade embryonnaire 2.5 des souris Swiss Webster selon les instructions du fabricant et hébergez les souris individuellement après chaque transfert jusqu’à l’accouchement et le sevrage ultérieur. Dans cette expérience représentative, les taux de gestation n’ont pas changé entre la masse cellulaire interne trans injectée et les groupes témoins traditionnellement injectés et un nombre égal de petits ont survécu jusqu’au sevrage dans chaque groupe.

Notamment, alors que le nombre de souris au sevrage est resté inchangé, un nombre significativement plus élevé de petits du groupe trans injecté dans la masse cellulaire interne a montré un chimérisme de couleur de robe par rapport au groupe témoin injecté. La meilleure partie de cette technique est qu’elle ne nécessite qu’un simple changement dans l’orientation de l’embryon pour faciliter une plus grande production de chimères. Une bonne configuration du microscope est essentielle.

Si le microscope et les manipulateurs ne sont pas correctement configurés et bien entretenus, le processus d’injection ne fonctionnera pas. Si vous débutez dans les injections d’embryons, la répétition est la seule façon d’apprendre. Pour les débutants, la manipulation des embryons a tendance à être la partie la plus difficile de la procédure.

Être capable de déplacer efficacement les embryons d’une boîte à l’autre sans en perdre est la partie la plus cruciale de l’expérience. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont un simple changement de votre technique d’injection standard peut vous aider à devenir plus efficace dans la production de chimères.