Transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET)

Le transfert d’énergie par résonance de Förster, ou FRET, est un transfert d’énergie non radiatif entre des molécules électroluminescentes, et est souvent utilisé pour étudier les interactions biochimiques à courte portée. La FRET ne se produit que lorsque les molécules fluorescentes sont espacées à moins de 10 nm les unes des autres. L’analyse FRET peut être combinée à d’autres techniques pour obtenir des informations structurelles détaillées. Cette vidéo présentera les principes sous-jacents du FRET, résumera un protocole et une présentation de données, et discutera de certaines applications biochimiques.

Une molécule photoluminescente telle qu’un fluorophore est excitée en absorbant le rayonnement électromagnétique à une longueur d’onde dans son spectre d’absorption. En se détendant, il émet de la lumière à une longueur d’onde dans son spectre d’émission. Pour plus d'informations sur la fluorescence, consultez la vidéo de JoVE sur la microscopie à fluorescence. Différents fluorophores absorbent et émettent de la lumière à différentes longueurs d’onde, qui se chevauchent fréquemment. Si le spectre d’émission d’un fluorophore chevauche de manière significative le spectre d’absorption d’un autre fluorophore, le « donneur » libérera un photon virtuel, qui est absorbé par « l’accepteur ». Lorsqu’un donneur excité se trouve à moins de 10 nm d’un accepteur, l’énergie est transférée du donneur à l’accepteur par des interactions dipôle-dipôle. La libération d’énergie par l’émission de lumière du donneur diminue en conséquence. Pendant ce temps, l’accepteur excité émet de la lumière à sa longueur d’onde d’émission. La réponse FRET est évaluée en termes d’efficacité, ou le pourcentage d’énergie libérée du donneur par FRET plutôt que par la fluorescence ou d’autres processus radiatifs. L'efficacité dépend fortement de la distance entre le donneur et l'accepteur, ce qui permet à la FRET d'agir comme une règle « moléculaire » ou « spectroscopique ».

En biochimie, le FRET est souvent utilisé qualitativement pour observer les changements de conformation des molécules en surveillant les fluorophores lorsqu’ils entrent et sortent de la plage FRET les uns des autres. De même, les fonctions cellulaires peuvent être étudiées avec des molécules contenant une paire FRET. Si la molécule marquée est clivée par l’activité enzymatique, le FRET s’arrête et la longueur d’onde de fluorescence observée change.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent le FRET, examinons une vue d'ensemble d'un protocole et quelques façons de présenter et d'interpréter les données.

Avant l’expérience, les biomolécules d’intérêt, généralement de l’ADN ou des protéines, sont modifiées à l’aide de marqueurs fluorescents, à l’aide de techniques de biologie moléculaire. Les méthodes courantes d’introduction du matériel génétique modifié dans les cellules comprennent la transfection et l’électroporation.

Ensuite, les cellules sont préparées pour la visualisation FRET sur un microscope à fluorescence. Par exemple, les molécules peuvent être immobilisées sur une lame pour le FRET à molécule unique, ou les échantillons sont chargés dans des puits pour un criblage à haut débit.

Ensuite, les lasers d’excitation, le microscope et l’équipement associé sont préparés. (A) Les expériences FRET impliquent souvent des lasers puissants ; (B) l’utilisation d’un EPI et de procédures de sécurité appropriés doit être utilisé. L’échantillon est ensuite placé dans l’instrument et éclairé par le laser d’excitation.

Pour les expériences de surveillance du comportement des cellules, des images couleur montrant les différences ou les changements d’intensité d’émission sont utilisées. Les intensités d’émission du donneur et de l’accepteur sont tracées ensemble pour suivre la réponse FRET au fil du temps.

données FRET peuvent également être adaptées à diverses fonctions pour des analyses plus complexes. Selon l’expérience, les données peuvent être présentées de plusieurs façons pour représenter au mieux les résultats, ce qui fait du FRET un outil expérimental flexible.

Maintenant que vous connaissez les bases de l'exécution et de l'analyse d'une expérience FRET, examinons certaines applications de FRET dans la recherche en biochimie.

La FRET peut être utilisée pour étudier les changements conformationnels ou les processus cellulaires en marquant les parties de la protéine ou de la cellule qui se déplacent à moins de 10 nm les unes des autres avec une paire FRET. Par exemple, les capteurs de protéines sont préparés en marquant les récepteurs avec une paire de fluorophores. La réponse FRET est surveillée en direct par microscopie confocale. La variation de la longueur d’onde et de l’intensité de l’émission indique des changements conformationnels.

Le FRET peut également être utilisé en préparant des molécules avec une paire FRET active et en observant les changements dans la réponse. Lorsque le substrat est clivé, le FRET est perturbé, ce qui entraîne une augmentation des émissions du donneur et une diminution de l’émission de l’accepteur. Les émissions sont analysées pour déterminer les contributions par donateur, accepteur et FRET. Une fois que les facteurs d’émission directe sont calculés pour les protéines fluorescentes cyan et jaune, la concentration et les paramètres cinétiques du substrat peuvent être déterminés.

Les cellules conçues pour exprimer des monomères contenant l'une ou l'autre des paires FRET fonctionnent comme des « capteurs » pour les interactions entre ces monomères. Si l’agrégation de ces monomères est induite, une réponse FRET est observée. Cela peut être utilisé pour étudier l'agrégation de protéines déclenchée par l'ensemencement de protéines mal repliées. Ici, les cellules ont été transduites avec des agrégats de la protéine d’intérêt, incubées et analysées par cytométrie en flux.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le transfert d'énergie de résonance de Förster, ou FRET. Cette vidéo contenait les principes sous-jacents du FRET, la préparation et l’analyse d’une expérience FRET, ainsi que quelques applications biochimiques.

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