Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

L’objectif global de ce protocole est d’identifier de manière impartiale les modèles d’état combinatoire de la chromatine dans les tissus tumoraux et les lignées cellulaires cancéreuses. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique du cancer, telles que la façon dont un état de modification des histones stériles pourrait contribuer à la genèse tumorale. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs modifications d’histones, ainsi que plusieurs échantillons, peuvent être traités à la fois simultanément et efficacement.

Tout d’abord, dissociez manuellement 50 milligrammes de tissu de mélanome et deux millilitres de solution saline équilibrée de Hank ou HBSS, à l’aide d’une lame de rasoir stérile. Hachez le tissu en morceaux de trois ou quatre millimètres pendant environ cinq minutes dans une boîte de culture de tissus stérile. Transférez la solution tissulaire dans un tube dissociateur et ajoutez un autre huitième millilitre de HBSS.

Dissocier davantage le tissu, à l’aide d’un dissociateur, jusqu’à homogénéisation. Ensuite, réticulez le tissu, en ajoutant 200 microlitres de formaldéhyde à 16 % pour trois millilitres de HBSS. À l’aide d’un mélangeur, agitez le mélange à 10 tr/min pendant exactement 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Après avoir retiré l’échantillon de l’incubateur, ajoutez 200 microlitres de glycine tumorale par trois millilitres d’échantillon et agitez le mélange à 10 tr/min pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Faites tourner l’échantillon à 934 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Lorsque vous avez terminé, retirez le surnageant et ajoutez cinq millilitres de PBS glacé.

Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon à 934 fois g, puis retirez le surnageant. Ajoutez 300 microlitres de tampon de récolte ChIP avec inhibiteurs de protéase par 50 milligrammes de tissu et lysez les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace. Pendant que les cellules lysent, allumez le perturbateur à bain d’eau et le système de refroidissement associé et laissez la température atteindre quatre degrés Celsius.

Placez le tube du sonicateur dans le perturbateur du bain-marie et sonicez le tissu du mélanome pendant 60 cycles à 30 secondes de marche et 30 secondes d’arrêt pour obtenir des fragments de chromatine de 200 à 600 paires de bases. Pour huit milligrammes de tissu de mélanome, incubez trois microgrammes de chaque anticorps d’histone avec 20 microlitres de billes magnétiques de protéine g et 100 microlitres de tampon de blocage de liaison pendant deux heures à quatre degrés Celsius avec rotation, à l’aide d’un revolver à tube. Après la sonication, diluez l’échantillon cinq fois à l’aide du tampon de dilution ChIP pour ramener la concentration de SDS à 0,1 %Une fois l’incubation des billes magnétiques d’anticorps et de protéine g terminée, retirez le tampon de dilution ChIP et remettez les billes en suspension dans 240 microlitres de tampon frais.

Ensuite, placez 20 microlitres d’aliquotes des billes dans 12 tubes séparés, chacun d’entre eux sera utilisé pour un échantillon de tissu distinct. Aliquote uniformément le matériau soniqué sur les billes de protéine g avec un anticorps spécifique et faites pivoter les tubes à l’aide d’un revolver à tube pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin après la réticulation inversée, transférez la solution de protéine d’anticorps dans une plaque à 96 puits et placez-la sur un support magnétique.

Après avoir laissé les billes adhérer pendant au moins 30 secondes, retirez le surnageant. Lavez les billes cinq fois avec 150 microlitres de tampon de lavage RIPA glacé à l’aide d’une pipette multicanaux. Déplacez l’aimant en continu pendant 30 secondes par lavage, puis retirez le surnageant.

Après les étapes de lavage, ajoutez un mélange maître de tampon d’élution, contenant 44 microlitres de tampon d’élution directe, un microlitre de Rnase et cinq microlitres de proténase k par puce et entrez l’échantillon pour la réticulation inverse. Incuber les échantillons à l’aide d’un thermocycleur PCR pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, quatre heures à 50 degrés Celsius et huit à 16 heures à 65 degrés Celsius. Le lendemain matin, replacez les échantillons sur l’aimant et transférez le surnageant dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits qui contient l’ADN précipité d’amino.

Ajoutez 2,3 billes paramagnétiques à la solution et pipetez soigneusement de haut en bas 25 fois à l’aide d’une pipette multicanaux. Ensuite, incubez à température ambiante pendant quatre minutes. Replacez ensuite les échantillons sur l’aimant et incubez à température ambiante pendant encore quatre minutes.

Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 150 microlitres d’éthanol à 70 % aux échantillons et incubez à température ambiante pendant 30 secondes sans déranger les billes. Après avoir laissé sécher les billes, retirez les échantillons de l’aimant et ajoutez 30 microlitres de traceal de 10 millimolaires. Mélanger par pipetage 25 fois.

Après avoir incubé les échantillons à température ambiante, remettez-les sur l’aimant et incubez à température ambiante pendant quatre minutes supplémentaires. Transférez 20 microlitres de chaque échantillon dans une nouvelle plaque à 96 puits pour la préparation de la bibliothèque. Après l’amplification par PCR, prélever les échantillons et porter le volume total à 100 microlitres en utilisant de l’eau sans noyau.

Effectuez une sélection de taille paramagnétique double face en ajoutant d’abord 55 microlitres de billes à chaque échantillon et en mélangeant 25 fois avec une pipette. Ensuite, incubez à température ambiante pendant quatre minutes. Replacez les échantillons sur l’aimant et incubez à température ambiante pendant encore quatre minutes pour obtenir de gros fragments sur les billes qui ne conviennent pas au séquençage.

Après l’incubation, transférez le surnageant dans une nouvelle plaque de PCR à 96 puits. Ajoutez encore 25 microlitres de billes paramagnétiques et mélangez en pipetant 25 fois et incubez à température ambiante hors de l’aimant pendant quatre minutes. Après l’incubation à température ambiante, replacez les échantillons sur l’aimant et incubez à température ambiante pendant quatre minutes.

Jetez ensuite le surnageant. Tout en laissant les échantillons sur l’aimant, ajoutez 150 microlitres d’éthanol à 70 % et incubez à température ambiante pendant 30 secondes sans déranger les billes. Retirez l’éthanol et répétez le lavage.

Après avoir laissé sécher les billes, retirez les échantillons de l’aimant et ajoutez 25 microlitres de 10 millimolaires de pH traceal 8,0. Mélanger en pipetant 25 fois et incuber à température ambiante, hors de l’aimant pendant quatre minutes. Après l’incubation à température ambiante, replacez les échantillons sur l’aimant et incubez à température ambiante pendant quatre minutes.

Maintenant, quantifiez les banques à l’aide d’un instrument d’électrophérogramme d’ADN à haute sensibilité avant le multiplexage pour vous assurer que les tailles sont adaptées au séquençage. Ce protocole permet l’immunoprécipitation de tissus tumoraux congelés et de lignées cellulaires qui peut être réalisée sur des dizaines d’échantillons et en parallèle à l’aide d’une méthode à haut débit. Les fragments de chromatine doivent varier entre 200 et 1000 paires de bases pour une immunoprécipitation optimale.

L’ADN ChIP purifié doit être quantifié avant de procéder à la préparation de la banque. Les banques complètes adaptées au multiplexage et au séquençage de nouvelle génération doivent comporter entre 200 et 600 paires de bases et être dépourvues de dimères d’amorces. Lors du post-séquençage, de nombreuses mesures de contrôle de la qualité doivent être respectées avant de passer aux étapes suivantes du pipeline, telles que les appels de pointe macs et l’analyse chromHmm.

Les échantillons de ChIP doivent être enrichis au fil de l’ADN d’entrée et chaque modification d’histones doit afficher un profil distinct représentant une composante spécifique du paysage épigénétique. L’algorithme chrome HMM utilise un modèle de Markov caché multivarié pour identifier les motifs de chromatine combinatoire et spatiale récurrents les plus importants en fonction des modifications d’histones étudiées. À l’aide de ces six modifications, chrome HMM identifie des états de chromatine fonctionnellement distincts représentant à la fois les domaines répressifs et actifs, tels que la répression polycombe, la répression hétérochromatique, la transcription active et les amplificateurs actifs.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours, si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de déterminer les conditions de sonication optimales et les spécifications des anticorps avant de poursuivre la préparation de la bibliothèque et l’analyse des données. Pour apprendre cette procédure, d’autres méthodes, telles que le séquençage RRS et la capture de confirmation chromosomique, peuvent être effectuées pour déterminer la coalition des parties de l’état de la chromatine avec l’expression des gènes et la structure supérieure de la chromatine.

Après l’expérience, la technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique du cancer pour explorer les modèles d’état de la chromatine dans les échantillons de tumeurs de patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter et de dissocier les tissus tumoraux, d’effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine, de préparer des banques pour le séquençage de nouvelle génération, de traiter les données de post-séquençage et d’obtenir des informations sur les étapes initiales de l’analyse en aval. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec du formaldéhyde, cela peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu’une hotte appropriée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.