Name: Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Découvrez comment établir une infection à Helicobacter chez la souris et analyser les changements histopathologiques gastriques. Cette méthode permet d'étudier la pathogenèse et de développer des stratégies thérapeutiques.

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Les auteurs aimeraient remercier Mme A. De Paoli et Mme Georgie Wray-McCann pour l’assistance technique. Les auteurs reconnaissent l’utilisation des équipements et l’assistance technique de Monash histologie plate-forme, Département d’anatomie et biologie du développement, l’Université Monash. Le laboratoire est pris en charge par le financement de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à RLF (APP1079930, APP1107930). RLF est soutenu par une bourse de recherche Senior du NHMRC (APP1079904). KD et MC reposent tous deux bourses d’études supérieures de Monash. KD est également appuyé par le Centre pour l’immunité innée et Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, tandis que MC a une bourse d’études supérieures internationales de la faculté de médecine, les soins infirmiers et les Sciences de la santé, l’Université Monash. Recherche à l’Institut de recherche médicale de Hudson est pris en charge par programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure.

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<li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129%2FSv+mice+fails+to+suppress+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit l’utilisation d’un modèle de souris in vivo pour l’infection à Helicobacter . Les étapes critiques de la procédure sont la : 1) préparation des inoculums de Helicobacter contenant des bactéries viables et mobiles ; 2) livraison du nombre approprié de bactéries à la souris par gavage gastrique ; 3) détection de l’infection bactérienne par comptage des colonies et/ou PCR ; et 4) traitement des tissus gastriques pour permettre l’évaluation de l’histopathologie infectés estomacs...

Helicobacter pylori est un pathogène humain, Gram négatif, en forme de spirale gastrique présent dans toutes les populations à travers le monde, avec des taux d’infection dans les pays en développement, estimées à environ 80 %1. Bien que la plupart Helicobacter pylori-personnes atteintes sont asymptomatiques, certains développent des maladies plus graves, allant de l’ulcération peptique de cancer gastrique2. Helicobacter pylori-cancers associés se caractérisent globalement par modifications malignes dans les cellules épithéliales (SCAE) ou par la formation des tissus lymphoïdes extra nodales dans l’estomac, qui en résulte dans l’Adénocarcinome gastrique ou associé aux muqueuses lymphoïde Lymphome du tissu (MALT), respectivement. H. pylori est très adapté pour survivre dans la niche écologique sévère de l’estomac en raison de la présence de divers facteurs de virulence et de mécanismes facilitant son adhésion, la croissance et le métabolisme dans ce créneau. En particulier, les souches virulentes de H. pylori possèdent le 40KO cag Pathogenicity Island (cagPAI) qui encode approximativement 30 gènes nécessaires à la production d’un Type 4 sécrétion système (T4SS)3,4 . ACG PAI-positive des souches de H. pylori sont associés à l’induction des niveaux plus élevés d’inflammation chronique chez l’hôte, qui est considéré comme un précurseur essentiel de l’Adénocarcinome gastrique5.
In vivo des modèles animaux, en particulier les souris, ont été très instructives en permettant aux chercheurs d’étudier les contributions relatives de l’hôte, des facteurs environnementaux et bactériennes sur l’infection à H. pylori et maladie issue6. Des études ont démontré précédemment que prolongé Helicobacter pylori infection de la souris sur les résultats de fond génétique C57BL/6 dans le développement d’une gastrite chronique et la glande s’atrophier, les deux maîtres mots de H. pylori infection7. Par ailleurs, l’infection avec des espèces bactériennes feline/canine, H. felis, s’est avérée induire la formation de MALT chez les souris présentant une pathologie similaire et la progression de la maladie comme on le voit l’homme MALT lymphome8,9. Le plus couramment utilisé de H. pylori isolat dans les études de colonisation de la souris est la souche « Sydney 1 » (SS1) souche10, qui est ACGPAI+ mais a un T4SS non fonctionnel (T4SS−)11. Autres souches largement utilisés sont le Helicobacter pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 et X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Pour les infections de H. felis , la souche CS1 (« Cat spirale 1 », ACGPAI–/T4SS−) est généralement utilisé14.
Ici, nous fournissons un protocole décrivant la préparation des inoculums de Helicobacter pour in vivo de l’infection, la procédure pour gavage intragastrique de souris, ainsi que des méthodes pour le traitement des tissus pour l’étude des changements histopathologiques dans l’estomac. En particulier, cet article se concentrera sur les méthodes histologiques permet de visualiser la colonisation bactérienne et d’évaluer les changements histopathologiques, incluant la formation de MALT, dans la muqueuse gastrique de souris infectées. Certaines des méthodes décrites ici peuvent être adaptées à l’étude d’autres pathogènes de l’intestin tels que S. Typhimurium ou c. rodentium.

<table><tbody><tr><td><fort>Réactifs bactériologiques</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>Dissoudre dans de l’eau désinoïsée avant la stérilisation</td></tr><tr><td>Sang de cheval défibriné de qualité supérieure</td><td>Australian Ethical Biologicals</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>Dissoudre dans de l’eau désinonisée avant la stérilisation</td></tr><tr><td>Packs de gaz CampyGen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs histologiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin, tamponné neutre, 10 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alcool absolu, 100 % dénaturé</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (2-propanol)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>Xylène (sans soufre)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Mayer’s Haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>MH-1L</td><td>Filtre avant utilisation</td></tr><tr><td>Éosine, Tache aqueuse</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>Filtre avant utilisation</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa Stain, modifié</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>Diluer avant utilisation (20 % Giemsa, 80 % eau déminéralisée)</td></tr><tr><td>Histolène</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX support de montage</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs de biologie moléculaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>La température de recuit des amorces ureB utilisées dans cette étude est de 61 &deg ; Le kit C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA polymérase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>comprend 10 tampons PCR et chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>dNTPs Bioline</td><td></td><td>BIO-39028</td><td>Diluer à 10 mM dans de l’eau stérile sans nucléase avant utilisation</td></tr><tr><td>Agarose de qualité moléculaire</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénogénocarbonate de sodium</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnésium Sulfate Heptahydrate</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>Dissoudre dans l’eau déminéralisée</td></tr><tr><td>Polymyxine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>Dissoudre dans l’eau désionisée</td></tr><tr><td>Trimethoprime (&ge ; 98 % HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>Dissoudre dans 100 % (absolu)</td></tr><tr><td>Éthanol Amphotéricine</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>Dissoudre dans l’eau désionisée</td></tr><tr><td>Bacitracine à partir de Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>Dissoudre dans l’eau désionisée</td></tr><tr><td>Acide naladixique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>Dissoudre dans l’eau désionisée</td></tr><tr><td><fort>Autres réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthoxyflurane (Pentrhox)</td><td>Medical Developments International</td><td>Sans objet</td><td></td></tr><tr><td>Cire de paraffine</td><td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Equipement et plastique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Anoerobic Jars Thermo</td><td>Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN Pasteur Pipettes</td><td>Interpath Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5810R Recueillir</td><td></td><td></td><td>les granulés bactériens par centrifugation à 2 200 tr/min pendant 10 minutes à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>23 g aiguille de glissement de précision</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Portex tube en polyéthylène à alésage fin</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Cathéters d’alimentation en plastique</td><td>Instech&nbsp ; Laboratoires</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>Seringues jetables à la tuberculine Luer slip de 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Micropilon Eppendorf pour tubes de 1,2 à 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z317314</td><td>Pilon en polypropylène autoclavable utilisé pour l’homogénéisation de l’estomac</td></tr><tr><td>Dissociateur GentleMACs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Utiliser un système gentleMACS prédéfini Programmes pour les tissus de l’estomac de souris</td></tr><tr><td>M Tubes (bouchon orange)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Boucle en plastique stérile</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>Cold Plate, Leica EG1160 Système d’encastrement</td><td>Leica Biosystems</td><td>Sans objet</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus lames de verre</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

modèles de souris de l’infection à helicobacter et pathologies gastriques

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori est un pathogène gastrique qui est présent dans la moitié de la population mondiale et est une cause importante de morbidité et de mortalité chez l’homme. Plusieurs modèles de souris de l’infection à Helicobacter gastrique ont été développés pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires, par lequel les bactéries Helicobacter pylori colonisent l’estomac des hôtes humains et causer la maladie. Ici, nous décrivons les protocoles à : 1) préparer des suspensions bactériennes à l’infection en vivo de souris par gavage gastrique ; 2) déterminer les niveaux de colonisation bactérienne en tissus gastriques de souris, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et compter viable ; et 3) évaluer les changements pathologiques, en histologie. Pour établir Helicobacter infection chez la souris, animaux (SPF) exempts de micro-organismes pathogènes est d’abord inoculées avec des suspensions (contenant ≥ 105 d’unités formant des colonies, UFC) des souches colonisatrices de souris de l' Helicobacter pylori ou autres gastrique Helicobacter spp animaux, tels que Helicobacter felis. À l’heure-points appropriés après l’infection, les estomacs sont excisés et disséqués sagittally en deux fragments de tissus égale, chacun comprenant les régions de l’antre et du corps. Un de ces fragments est ensuite utilisé pour comptage viable ou extraction de l’ADN, tandis que l’autre est soumis à traitement histologique. La colonisation bactérienne et changements histopathologiques dans l’estomac peuvent être évalués régulièrement dans des sections de tissu gastrique tachées de taches (H & E) Warthin-Starry, Giemsa ou hématoxyline et éosine, selon le cas. D’autres analyses immunologiques peuvent également être entreprises par immunohistochimie ou par immunofluorescence sur coupes de tissus gastriques de souris. Les protocoles décrits ci-dessous sont spécialement conçus pour permettre l’évaluation chez les souris des pathologies gastriques ressemblant à ceux d’anthropique Helicobacter pylori maladies, y compris l’inflammation, atrophie de la glande et la formation de follicules lymphoïdes. La préparation de l’inoculum et protocoles de gavage gastrique peuvent également être adaptées à l’étude de la pathogenèse des autres agents entéropathogènes humains qui colonisent les souris, tels que Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.

Ce protocole décrit une technique de gavage oral pour atteindre intragastrique infection par Helicobacter pylori ou H. felis dans des modèles murins souris (Figure 1). Suite à l’euthanasie, les estomacs sont enlevés, pesés et divisés en 2 moitiés égales comprenant l’antre, les corps et les régions non glandulaire de tissus gastriques (Figure 2). La région non glandulaire est retirée avant d’effectuer les analyses.
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Souris représentent un modèle inestimable en vivo pour étudier les maladies infectieuses et maladies causées par des micro-organismes gastro-intestinaux. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour étudier les changements histopathologiques dans des modèles murins de Helicobacter pyloriet colonisation bactérienne-maladie liée.

Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la gastroentérologie sur l’impact des membres du microbiote, en particulier ceux du genre Helicobacter, sur l’inflammation et le cancer. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de l’infection à Helicobacter et de son impact sur l’estomac dans des conditions physiologiques. Les implications de cette technique s’étendent vers le développement de thérapies pour la prévention ou l’élimination de l’infection à Helicobacter ou de ses conséquences, y compris les antibiotiques, les médicaments ou les vaccins.Ces méthodes fournissent un aperçu spécifique à la pathogénie de l’infection à Helicobacter. Cependant, plusieurs des techniques peuvent être adaptées à l’étude d’autres pathogènes gastro-intestinaux. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal avec la préparation d’un inoculum bactérien capable d’établir une infection chez la souris.Il est impératif que les isolats d’Helicobacter soient des souches connues de colonisation de souris qui n’ont pas subi de sous-culture étendue in vitro. En outre, le nombre de sous-cultures in vitro pour ces souches doit être enregistré. Ajoutez des suspensions bactériennes aux tubes de polystyrène de 15 millilitres et utilisez une boucle en plastique pour transférer une gouttelette de 10 à 20 microlitres de chaque culture sur des diapositives individuelles au microscope en verre.Ensuite, évaluez la viabilité et la motilité des bactéries sous microscopie à contraste phase à un grossissement 100 fois. N’utilisez l’inocula H.pylori que si la majorité des bactéries ont une forme bacillaire. H.felis inocula doit principalement contenir des bactéries en forme d’hélicoïque.Et chargez l’inocula dans des seringues individuelles, jetables et d’un millilitre. Équipez chaque seringue d’une aiguille de calibre 23 et utilisez un film en plastique paraffine pour fixer un cathéter de polyéthylène jetable à chaque aiguille. Ensuite, retenez manuellement une souris sans pathogène spécifique et sans helicobacter de six à huit semaines par le scruff du cou et de la queue, et insérez un cathéter au centre de la mâchoire ouverte.Guider le cathéter dans un caudale vers l’œsophage, en étendant le cou de la souris pour permettre une facilité d’accès à l’estomac par l’œsophage et loin de la trachée jusqu’à ce que la majeure partie ou la majeure partie du cathéter ne soit plus visible et qu’une résistance se fait sentir. Ensuite, livrer au moins une fois 10 à la cinquième bactérie pour assurer une colonisation optimale et la pathologie de la maladie. À la fin de l’expérience, utilisez des ciseaux fins et incurvés pour ouvrir la cavité abdominale pour l’excision de l’estomac.Couper l’estomac le long de la courbure plus grande, et laver doucement l’organe deux fois dans un tube de 50 millilitres de PBS frais par lavage pour enlever tous les aliments résiduels. Après le deuxième lavage, placez le tissu dans une boîte de Pétri en plastique goudronnée de six centimètres pour enregistrer le poids humide. Après avoir aplati l’estomac, couper l’échantillon en deux fragments de tissus égaux comprenant les régions de l’antrum, du corps et de la forêt non glandulaire.Retirez la région non glandulaire et pesez la moitié de chaque estomac avant de stocker le morceau de tissu dans la solution appropriée pour l’analyse prévue en aval. Ajouter l’autre moitié du tissu gastrique à un tube conique de 15 millilitres contenant 10% de formaline, aplatissant les tissus contre les côtés supérieur des tubes après 10 secondes. Lorsque les tissus sont fixés aux parois du tube, immerger les échantillons dans la formaline pendant au moins 24 heures.Pour compter le nombre de H.pylori viables dans l’estomac après l’infection, homogénéisez les échantillons d’estomac stockés dans BHI, et effectuez des dilutions périodiques dupliquées des homogénéités gastriques résultantes dans le bouillon frais et stérile. Divisez l’agar de sang de cheval pré-séché, ou HBA, plaques complétées par des antibiotiques supplémentaires en trois ou quatre segments, et, en utilisant une adaptation de la technique Miles et Misra, ajouter 10 à 100 microlitres de chaque dilution homogénéisé de l’estomac sur un segment de chaque plaque d’agar. Étendre les homogénéités avec des boucles stériles en plastique et laisser sécher les plaques.Ensuite, placez les assiettes en position inversée dans des pots de gaz anaéroobe contenant une boîte d’eau Petri et un paquet de gaz. Ensuite, incubez les pots à 37 degrés Celsius pendant quatre à sept jours. Lorsque des colonies peuvent être observées, énumérer les segments contenant entre 10 et 100 colonies isolées.Après l’euthanasie, l’estomac est récolté chez les animaux et pesé. La région non glandulaire est enlevée, et l’estomac est divisé en deux moitiés égales comprenant l’antrum et le corps. La colonisation réussie est généralement confirmée en effectuant un comptage viable et l’énumération subséquente de colonies individuelles à partir d’homogénéités gastriques striées sur des plaques HBA.Notez que la présence de bactéries contaminantes provenant du microbiote gastrique de la souris ou d’un grand nombre de colonies de H.pylori peut compliquer l’énumération des FC H.pylori. Alternativement, pcr peut être employé pour vérifier l’infection utilisant des amorces validées spécifiques dirigées à une région de paire de 325-base des gènes H.felis et H.pylori ureB. Dans cette expérience représentative, les souris noires-6 de type sauvage de type sauvage ont montré des signes modérés d’inflammation, y compris l’hyperplasie et l’atrophie de glande à six mois après infection avec H.felis, aussi bien que l’infiltration cellulaire du submucosa.Une inflammation plus grave est observée chez les souris knock-out au même moment, avec la présence supplémentaire de follicules lymphoïdes observés à proximité des infiltrations cellulaires. Les bactéries H.felis peuvent également être visualisées dans les sections tachées de Giemsa du tissu de l’estomac de souris infecté. Après cette procédure, d’autres méthodes comme le PCR quantitatif, l’immunohistochimie ou l’immunofluorescence peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les types de réponses de l’hôte induites lors de l’infection à Helicobacter.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie et de la gastroentérologie pour explorer le rôle causal de Helicobacter pylori dans les maladies de l’estomac chez l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter reproductiblement les souris avec des espèces d’Helicobacter et d’étudier la pathologie associée à l’infection. N’oubliez pas que les souches Helicobacter utilisées dans ce protocole sont infectieuses, et donc les procédures standard de biosécurité doivent toujours être suivies tout en travaillant avec ces bactéries.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Haute résolution microscopie électronique de la Helicobacter pylori Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

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