Purification des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales foie de souris Perfusion

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une perfusion hépatique de souris réussie pour faciliter la purification de populations de cellules hépatiques spécifiques d’intérêt. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hépatologie sur la façon d’aider les fonctions de populations de cellules hépatiques spécifiques dans des essais in vitro ou in vivo. Le principal avantage de cette technique est la grande quantité d’hépatocytes dans les cellules endothéliales sinusoïdales qui peuvent être obtenues à partir de chaque foie.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est essentiel de voir la couleur et la forme d’un foie digéré de manière optimale pour préserver la viabilité cellulaire. Pour placer le cathéter de la veine porte, utilisez d’abord l’arrière d’une pince pour déplacer les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale de la souris, exposant la veine porte, et utilisez une pince incurvée pour glisser un morceau de fil à coudre en polyester de 20 centimètres sous la veine porte entre le foie et la veine pancréato-duodénale supérieure. À l’aide de la pince, tirez délicatement le fil de l’autre côté de l’animal, de sorte qu’il soit centré sous la veine porte.

Et faites un nœud lâche autour de la veine porte. Placez la pince incurvée sous la veine et tirez doucement tout le tissu vers la queue pour redresser la veine. Ensuite, placez le biseau d’une aiguille de cathéter vers le haut et parallèlement à la partie inférieure de la veine porte près de la pince, et percez doucement la veine avec l’aiguille.

Lorsque le biseau est dans la lumière de la veine, rétractez l’aiguille à ressort et continuez à pousser le cathéter de palmier à travers la veine, jusqu’à ce que le biseau soit près de la zone ramifiée de Vénus. Après avoir fixé le nœud autour du cathéter, réglez immédiatement la pompe péristaltique à quatre millimètres par minute et connectez l’extrémité mâle du tube à l’extrémité femelle du cathéter, à ce moment-là, vous devriez commencer à voir la branche du foie. Coupez l’aorte abdominale pour le drainage.

Utilisez du ruban adhésif pour immobiliser le tube sur le sous-coussin. Utilisez les ciseaux pour couper la peau abdominale verticalement, afin de permettre le drainage du sang et du liquide de perfusion. Ensuite, pressez le vaisseau sanguin de l’effluent plusieurs fois avec la pince droite pour gonfler le foie, en vous assurant que tout le sang s’est écoulé, et perfuser le foie avec du PBS jusqu’à ce que le tissu hépatique blanchisse.

Pour récolter les hépatocytes, changez d’abord le tube d’écoulement de la fiole d’un litre de PBS en une fiole de 125 millilitres, contenant le tampon deux, complété par de la collagénase-4. Lorsque la collagénase atteint le foie, pressez brièvement mais fermement le vaisseau sanguin de l’effluent pour augmenter la pression et permettre au tampon de digestion de remplir tous les lobes du foie. Relâchez le vaisseau avant que le tampon n’éclate à travers le tissu conjonctif entourant le foie.

Et laissez le tampon perfuser à travers le foie jusqu’à ce que tout le volume ait coulé à travers les tissus. Ensuite, placez un plat de cristallisation contenant 10 millilitres de tampon à côté de la souris et utilisez des pinces droites et des ciseaux pour transférer le foie dans le plat. Transférez la boîte dans une hotte de culture de tissus stériles et, à l’aide d’une technique stérile, saisissez le foie pour retirer la capsule.

Secouez doucement les cellules du tissu hépatique et versez la solution cellulaire résultante à travers un filtre de 100 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez ensuite les restes de foie du filtre avec plus de tampon. Lorsque le foie semble dépourvu de cellules, filtrez le filtrat tiré à travers un filtre de 40 microns dans un deuxième tube de 50 millilitres et collectez les cellules par centrifugation.

Versez la cellule non parenchymateuse et l’hépatocyte mort contenant du surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres sur de la glace en un seul mouvement, pour préserver la pastille et remettez la pastille en suspension dans 40 millilitres de tampon frais pour la prochaine centrifugation. Pour isoler les cellules endothéliales sinusoïdales, centrifugez les surnageants contenant des cellules non parenchymateuses. Tirez les suspensions cellulaires dans un seul nouveau tube conique de 50 millilitres et portez le volume total à 35 millilitres.

Prélevez les cellules extraites par centrifugation et utilisez une pipette de 25 millilitres pour transférer soigneusement les 25 millilitres supérieurs de la cellule non parenchymateuse contenant du surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Ajoutez 25 millilitres de milieu frais dans le tube et remettez la pastille en suspension pour une deuxième centrifugation et une élimination du surnageant. Ensuite, centrifugez le surnageant et ajoutez 15 millilitres d’une solution Percoll à 50 % dans un nouveau tube de 50 millilitres.

À l’aide d’une pipette réglée à la vitesse d’éjection la plus basse, superposez 20 millilitres de Percoll à 25 % sur la solution de Percoll à 50 %, puis remettez en suspension les cellules non parenchymateuses dans 10 millilitres de milieu à quatre degrés Celsius. Superposez soigneusement les cellules sur la solution Percoll. Et séparez les cellules par centrifugation à gradient de densité.

Ensuite, aspirez les 30 premiers millilitres de solution et utilisez une pipette de transfert en plastique de cinq millilitres pour collecter les cellules endothéliales sinusoïdales et de Kupffer situées à l’interphase de la solution à gradient de densité de 25 à 50 % dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Lavez les cellules avec 50 millilitres de milieu et remettez la pastille en suspension tout en rinçant les côtés du fond du tube dans 12 millilitres de milieu chaud. Pour séparer les cellules endothéliales sinusoïdales des cellules de Kupffer, transférez la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri en polystyrène dans un incubateur de culture de tissus humidifié pendant huit minutes.

À la fin de l’incubation, utilisez une pipette de 25 millilitres pour aspirer le surnageant et utilisez le surnageant pour rincer la boîte avec la pipette réglée à la vitesse la plus basse pour recueillir les cellules endothéliales sinusoïdales restantes. Transférez ensuite les cellules endothéliales sinusoïdales dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ensuite, collectez les cellules par centrifugation pour leur remise en suspension et leur placage dans des boîtes de culture cellulaire enrobées de collagène.

La microscopie électronique à balayage du foie d’une souris après une perfusion infixitive PBS, d’une manière similaire à celle qui vient d’être démontrée, révèle une vue claire de la micro-anatomie hépatique et des microvillosités entre les hépatocytes. Les hépatocytes récoltés lors des essorages à basse vitesse au début de la procédure démontrent une grande pureté après quatre lavages dans des tampons contenant de l’albumine sérique bovine. La séparation des cellules endothéliales sinusoïdales par adhésion sélective sur une boîte de Pétri en polystyrène recouverte de collagène permet d’obtenir une pureté de 83 à 90 % qui dépend en grande partie de l’efficacité globale de la digestion de la collagénase.

Les mesures quantitatives effectuées par microscopie optique à partir d’une procédure de séparation représentative, comme nous venons de le démontrer, révèlent des résultats d’isolement typiques d’une population d’hépatocytes purs à près de 100 %. Et une population de cellules endothéliales sinusoïdales pures à un peu plus de 89 %. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cathétiser une veine porte de souris et de la façon de purifier à la fois les hépatocytes et les cellules endothéliales sinusoïdales du foie de la souris.

Cette procédure peut également être utilisée pour purifier les cellules satellites de la fraction non parenchymateuse après isolement des hépatocytes en utilisant différents gradients de densité et vitesses de centrifugation.