Ingénierie « Golden » Fluorescence par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques et analyse des protéines par spectrométrie de masse et de Fluorescence

Le but de cette expérience est de remplacer un acide aminé canonique par un acide aminé non canonique pour la production de protéines recombinantes par incorporation sélective de pression pour produire la nouvelle protéine fluorescente d’or. La méthode d’incorporation sélective par pression est destinée à produire des protéines avec de nouvelles caractéristiques chimiques. Ceci est particulièrement utile lorsque vous essayez de comprendre ou de modifier la fonction des protéines.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple à réaliser car elle s’apparente à la production de protéines recombinantes courantes. La fluorescence corrélée dans le temps et la longueur d’onde est utile pour étudier la dynamique de l’état excité de la protéine modifiée, ce qui facilite la compréhension de l’influence de l’acide aminé non canonique introduit dans le chromophore sur les propriétés optiques. SPI peut, en principe, être appliqué à tout environnement de production de protéines pour lequel des souches auxotrophes et des milieux chimiquement définis sont disponibles.

Cela inclut d’autres souches bactériennes ainsi que la culture de cellules de mammifères. Le moment et la configuration des conditions d’expression sont critiques car il est obligatoire de supprimer la production de la protéine de type sauvage non modifiée. C’est pourquoi certains paramètres tels que la température, le temps d’induction ou la composition du milieu de culture doivent être optimisés.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après des études initiales d’extraits de protéines contenant des acides aminés contenant du méthyle tels que la sélénométhionine. La démonstration de la procédure sera assurée par Almut Pelzer, un étudiant de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, transformez les cellules E. coli auxotrophes du tryptophane avec le plasmide d’expression de l’ECFP.

Utilisez une seule colonie pour inoculer une préculture de cinq millilitres de milieu LB complété par de l’ampicilline dans un tube de culture. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Le lendemain, inoculez 100 millilitres de milieu NMM19 supplémenté en utilisant un millilitre de culture de nuit dans un erlenmeyer d’un litre.

Ensuite, incubez la culture pendant la nuit dans un agitateur orbital à 200 tr/min et 30 degrés Celsius. Le lendemain, mesurez la densité optique à 600 nanomètres toutes les 30 minutes jusqu’à ce que la valeur change de moins de 0,05 en 30 minutes. Ensuite, centrifugez la culture à 5 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour récolter les cellules bactériennes.

Jeter le surnageant par décantation. Remettre en suspension les cellules dans le milieu NMM19 complété par de l’ampicilline jusqu’à un volume total de 100 millilitres. Transférez cette suspension dans le même erlenmeyer.

Ajouter du 4-amino-indole à une concentration finale d’un millimolaire. Incuber dans un agitateur orbital pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius et 200 tr/min. Après 30 minutes, ajoutez IPTG à la culture jusqu’à une concentration finale de 0,5 millimolaire pour induire l’expression du gène cible.

Incuber toute la nuit dans un agitateur orbital à 30 degrés Celsius et 200 tr/min. Le lendemain, récoltez les cellules bactériennes en les centrifugeant à 5 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jeter le surnageant par décantation.

Congelez la pastille cellulaire à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à effectuer la purification des protéines cibles. Tout d’abord, préparez le lysat de cellules bactériennes comme indiqué dans le protocole de texte. Après avoir préparé la colonne de chromatographie selon les instructions du fabricant, utilisez un tampon de liaison pour équilibrer la colonne de chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisés.

Chargez le lysat sur la colonne jusqu’à ce qu’il soit terminé. Remarquez la protéine de couleur dorée liée à la résine de chromatographie. Lavez la colonne avec un tampon de liaison.

Ensuite, éluez la protéine cible à l’aide d’un tampon d’élution. Collectez et regroupez toutes les fractions éluées qui contiennent de la protéine fluorescente d’or, qui peut être identifiée par la couleur dorée visible. Après cela, préparez une membrane de dialyse avec une coupure de poids moléculaire comprise entre 5 000 et 10 000 selon les instructions du fabricant.

Dialyser un échantillon d’un millilitre contre au moins 100 millilitres de tampon pendant au moins deux heures. Pour commencer, utilisez le tampon MS pour diluer l’échantillon de protéines à 0,1 milligramme par millilitre, de sorte que le volume final soit de 80 microlitres. Pipeter soigneusement pour mélanger.

Transférez la solution dans un flacon d’échantillonneur automatique MS avec insert en verre et fermez-le avec un bouchon. Agissez le flacon pour éliminer les bulles d’air. Ensuite, préparez un blanc contenant une mémoire tampon MS dans un deuxième flacon.

Placez les deux flacons dans l’échantillonneur automatique HPLC. Après cela, préparez et calibrez l’instrument MS conformément aux instructions du fabricant. Réglez le volume d’injection de l’échantillonneur automatique à cinq microlitres pour la chromatographie liquide haute performance couplée à la méthode de spectrométrie de masse à temps de vol par ionisation par électronébulisation.

Créez une liste de travail pour l’exécution à vide, suivie de l’exécution d’échantillon GdFP. Attribuez le volume d’injection, les positions correspondantes des flacons de l’échantillonneur automatique et exécutez la liste de travail. Pour commencer, préparez une solution de protéine fluorescente d’or et le détecteur pour le comptage de photons uniques corrélés dans le temps et la longueur d’onde, comme indiqué dans le protocole de texte.

À l’aide d’un logiciel de comptage de photons uniques, acquérez l’émission de fluorescence à un taux de comptage d’environ 200 000 photons par seconde jusqu’à ce qu’environ 10 000 comptages soient accumulés dans le maximum d’acquisition des courbes de décroissance de fluorescence. Après cela, remplacez la cuvette d’échantillon par une cuvette en quartz d’un centimètre remplie de silice colloïdale dans un tampon PBS. Retirez le filtre laser et ajustez le réseau pour l’acquisition de photons de 470 nanomètres dans le canal central du détecteur.

Ensuite, acquérez la fonction de réponse instrumentale jusqu’à ce qu’environ 10 000 comptages soient accumulés dans le maximum d’émission. Convertissez, ajustez et tracez les données résultantes comme indiqué dans le protocole textuel pour obtenir les spectres associés à la désintégration, qui représentent la dépendance des temps de décroissance de la fluorescence sur la longueur d’onde d’émission. Dans cette étude, la spectrométrie de masse est utilisée pour confirmer que la variante fluorophore de type protéine fluorescente verte décalée spectralement vers le rouge, appelée protéine fluorescente dorée, est produite avec succès.

Alors que l’ECFP de type sauvage a une masse protéique calculée de 28 283,9 daltons après la maturation du chromophore, la masse correspondante de protéine fluorescente dorée est de 28 313,9 daltons. Le spectre ESI-MS déconvoluté de la protéine fluorescente d’or présente un pic de masse principal d’environ 28 314,1 daltons, s’écartant de la valeur théorique de moins de 10 parties par million. Cela confirme l’incorporation de l’acide aminé non canonique par incorporation sélective de pression.

Le spectre d’absorption de l’ECFP a deux maxima caractéristiques à 434 nanomètres et 452 nanomètres. En revanche, la protéine fluorescente d’or est caractérisée par une large bande d’absorption décalée vers le rouge avec le maximum à 466 nanomètres. Alors que le maximum d’absorption de l’EGFP est encore décalé vers le rouge à 488 nanomètres, le spectre d’émission de fluorescence de la protéine fluorescente dorée et le décalage de Stokes correspondant de GdFP signifient qu’il s’agit du plus décalé vers le rouge de tous les dérivés de la protéine fluorescente verte d’Aequorea victoria.

L’émission de fluorescence résolue dans le temps surveillée par comptage de photons uniques est illustrée ici. Les courbes de désintégration présentent une décroissance de fluorescence légèrement plus rapide à 600 nanomètres qu’à 550 nanomètres. L’émission de fluorescence de la protéine fluorescente dorée dépend fortement du pH, comme c’est le cas pour de nombreuses variantes de protéines fluorescentes vertes.

Comme on le voit ici, il y a une nette diminution de la fluorescence à un pH plus bas, bien que les caractéristiques spectrales restent constantes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours à partir de colonies de cellules bactériennes transformées ou de stocks de glycérol congelés. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de s’assurer que l’acide aminé ciblé est épuisé.

La ncAA doit être absorbée par la cellule, biocompatible et incorporée dans les protéines par la souche auxotrophe choisie. À la suite de cette procédure, une grande variété de protéines peut être générée à des fins d’ingénierie. Selon les protéines cibles, les méthodes telles que les analyseurs de stabilité des protéines, les tests d’activité enzymatique, la spectroscopie de fluorescence ou la cristallisation des protéines, peuvent être utilisés pour décrire l’influence de l’acide aminé non canonique sur les propriétés fonctionnelles et structurelles.

Après son développement, cette technique s’est avérée très utile dans le domaine de la biologie synthétique, en lui fournissant des protéines et des protéomes nouveaux dans la nature. Cela élargit les capacités chimiques de l’ingénierie des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’incorporer des acides aminés non canoniques dans des protéines recombinantes par incorporation sélective de pression, de vérifier l’introduction d’un acide aminé artificiel par spectrométrie de masse et d’analyser une protéine fluorescente par fluorescence résolue en temps.