Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique

L’objectif global de ce protocole est de produire des baculovirus en culture de cellules d’insectes, de les purifier par chromatographie d’affinité à l’héparine et de se concentrer par ultracentrifugation. Le produit final peut être utilisé pour le transfert de gènes in vivo ou comme vaccin. Cette méthode peut aider les chercheurs qui souhaitent utiliser le baculovirus purifié et concentré pour l’application de la thérapie génique.

Les particules de baculovirus peuvent contenir des débris cellulaires et des protéines provenant de la culture Sf9 qui peuvent induire une inflammation ou une réponse immunitaire lorsqu’ils sont utilisés chez l’homme. Pour éviter la toxicité, le baculovirus est purifié et séparé des particules contaminantes. Certaines parties de la procédure seront démontrées par Marilou Narciso, une assistante de recherche de mon laboratoire.

Pour mettre en place la culture en suspension, semez 50 millilitres de cellules Sf9 dans un milieu de culture d’insectes dans un erlenmeyer en polycarbonate de 250 millilitres. Et placez le flacon dans un incubateur à agitateur orbital. Ajoutez deux millilitres de stock de baculovirus P2 dans les cellules et secouez à 135 tr/min tout en maintenant une température constante de 28 degrés Celsius.

Quatre jours après l’infection, l’ensemble de la population de cellules Sf9 présentera un effet cytopathique, ce qui est une indication de la production de baculovirus à titre élevé. Amplifier séquentiellement le baculovirus jusqu’à l’obtention du volume souhaité, en multipliant par 10 à 50 le volume de culture cellulaire lors de chaque infection subséquente. Après avoir centrifugé le surnageant final du baculovirus pendant 30 minutes à 1000 g et quatre degrés Celsius pour séparer les débris cellulaires, transférez le surnageant dans un récipient propre et traitez-le avec des nucléases à 50 unités par millilitre pendant deux heures à 37 degrés Celsius pour digérer l’ADN génomique et l’ARN.

Enfin, filtrez le surnageant viral à travers une unité de filtration de 0,45 micron. Installez le système de chromatographie en plaçant la ligne de tampon de lavage de l’orifice d’entrée A1 dans une bouteille contenant au moins 500 millilitres de tampon de lavage. Utilisez l’orifice d’entrée du tampon A2 pour charger le tampon d’élution.

Insérez plusieurs tubes coniques de 50 millilitres dans le collecteur de fractions pour recueillir le surnageant du baculovirus de passage de la colonne, le tampon de lavage et le baculovirus éludé. Équilibrez la colonne d’héparine avec cinq volumes de colonne de 7,9 millilitres de tampon de lavage à un débit linéaire de sept millilitres par minute. Chargez 250 millilitres de surnageant à baculovirus sur la colonne d’héparine à l’aide de la pompe d’échantillonnage de l’orifice d’entrée à un débit linéaire de deux millilitres par minute.

Ensuite, faites passer 10 volumes de colonne de tampon de lavage à travers la colonne d’héparine à un débit linéaire de deux millilitres par minute jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette soit revenue à la ligne de base et devienne stable. Échappez les particules de baculovirus de la colonne d’héparine avec cinq volumes de colonne de tampon d’élution à un débit linéaire de quatre millilitres par minute. Surveillez l’apparition d’un pic d’élution brutale de la protéine sur le chromatogramme lorsque les particules du baculovirus se dissocient de la colonne d’héparine.

Après l’élution, diluer immédiatement 10 fois le surnageant du baculovirus éludé à l’aide d’un tampon de phosphate de sodium de 20 millimètres pour empêcher l’activation des particules du baculovirus par choc osmotique lors de la centrifugation ultérieure. Commencer la procédure de concentration en ajoutant un volume égal du surnageant du baculovirus à l’autoclave dans les tubes d’ultracentrifugation. Mesurez le poids du tube à l’aide d’une balance et ajustez le poids du contenu des tubes d’ultracentrifugation avec du PBS stérile.

Placez chacun des tubes de l’ultracentrifugeuse dans un godet opposé du rotor SW 32 Ti et faites fonctionner l’ultracentrifugeuse à 80 000 g pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, ouvrez les tubes d’ultracentrifugation dans une hotte de culture tissulaire et aspirez le liquide de manière aseptique sans retirer la pastille de baculovirus. Ajoutez 200 microlitres de PBS contenant 0,5 % de BSA et remettez en suspension chaque granule en pipetant vigoureusement de haut en bas.

Enfin, transférez 50 à 100 microlitres d’aliquotes du baculovirus concentré dans des flacons cryogéniques et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Les titres de baculovirus ont été estimés par l’infection des cellules HT1080. La ligne reliée par des losanges montre le nombre total d’unités infectieuses de baculovirus dans chaque fraction.

Les particules de baculovirus se lient fortement à la colonne d’héparine, de sorte qu’aucune quantité significative de virus n’est détectée dans le tampon de lavage de la colonne. Un pic brutal de protéines est observé lors de l’élution, ce qui correspond à la fraction du baculovirus. Les paramètres utilisés dans ce protocole maximisent le rendement et minimisent l’inactivation des particules infectieuses de baculovirus.

Ce protocole peut être utilisé pour la purification d’autres virus et protéines qui ont une affinité pour l’héparine.