Name: Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez la microscopie STED pour visualiser l'actine et les microtubules à la synapse immunitaire des cellules B. Cette méthode offre une résolution nanométrique pour étudier l'organisation cytosquelettique.

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Nous remercions l’UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility pour soutenir et maintenir le microscope STED. Ce travail a été financé par subvention #68865 de l’instituts de recherche en santé du Canada (de M.R.G.). Nous remercions m. Kozo Kaibuchi (Université de Nagoya, Nagoya, Japon) pour le plasmide CLIP-170-GFP.

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’University of British Columbia Animal Care Committee.
1. exprimant des protéines de GFP-fusion dans les cellules A20 B-lymphome
<ol><li>Toutes les cellules A20 en culture en milieu RPMI (RPMI 1640, additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF), 50 µM 2-mercaptoéthanol, 2 mM de glutamine, pyruvate de 1 mM, 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine) à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec 5 % De CO2.</li>
	<li>Préparer le réactif de transfection (voir la Table des matières) selon les instructions du fabricant. Remarque : Ce protocole a été optimisé pour les réactifs spécifiques et de protocole de transfection décrit dans la Table des matières. Les autres réactifs de transfection que nous avons essayé n’ont pas donné suffisamment efficacité de transfection.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugeuse 2,5 x 106 A20 cellules (pour chaque transfection) pendant 5 min à 525 x g. remettre en suspension les cellules dans 100 µL de réactif de transfection contenant de 1 à 2,5 µg d’ADN plasmidique. Pour l’ADN codant la GFP-170-CLIP23, utilisez 2,5 µg par transfection. Mélanger doucement.</li>
	<li>Les cellules de transfert vers un puits d’une plaque 6 puits, puis réglez le volume à 2 mL avec préchauffé milieu RPMI complet. La culture des cellules pendant 18 heures à 37 ° C, afin de permettre l’expression de la protéine.</li>
</ol>2. isoler les cellules de souris primaire B et leur activation au LPS
<ol><li>Utiliser des outils chirurgicaux stérilisés pour retirer la rate de souris, suivant les protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux de l’institution.</li>
	<li>Dans la hotte de culture tissulaire, placer une passoire de cellule stérile 70 µm dans une boite de culture de tissus de 35 mm contenant 3 mL de PBS stérile de la température ambiante. Utilisez la partie en caoutchouc du piston d’une seringue de 5 ml pour écraser la rate à travers la crépine de la cellule.</li>
	<li>Pipette la suspension monocellulaire de splenoctyes dans un tube stérile de 15 mL et centrifuger à 525 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Utiliser une isolation magnétique base perle B cell kit (voir Table des matières) pour obtenir une population fortement enrichie des cellules B.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules B à 3 x 10,6/ml en milieu RPMI complet complété avec 2,5 µg/mL LPS plus facteur (BAFF ; une cytokine de survie) d’activation de cellules de B de 5 ng/mL.</li>
	<li>Culture des cellules de 6 heures à 37 ° C.</li>
</ol>3. revêtement couvre-objet en verre avec des anticorps Anti-Ig
<ol><li>Préparer la solution d’anticorps pour enduire les lamelles couvre-objet. Diluer la solution mère d’anticorps Ig anti-chèvre-souris en température ambiante de PBS stérile pour préparer une solution à 12,5 µg/mL ; 400 µL de solution d’anticorps est requis pour chaque lamelle couvre-objet. Remarque : Utilisez la anti-souris IgG de chèvre pour cellules A20 ; Utilisez chèvre anti-souris IgM pour les cellules de B primaires. Les anticorps IgG de chèvre ne lient pas bien aux récepteurs de Fc de souris. Toutefois, pour éviter toute éventuelle liaison aux récepteurs Fc, on peut utiliser F(ab) ou f2 fragments de anti-souris IgG ou des anticorps IgM anti-souris.</li>
	<li>Tremper une lamelle de verre rond 18 mm #1.5 à 100 % de méthanol et laissez-le sécher complètement (~ 10 min).</li>
	<li>Avec une pincette, placer la lamelle séchée dans une culture de tissu de 12 puits plaque et pipette 400 µL de 12,5 µg/mL anticorps solution (5 µg total ; 2 µg/cm2) sur la lamelle couvre-objet pour qu’il forme une bulle au centre de la lamelle et s’étend jusqu’aux bords.</li>
	<li>Veillez à couvrir la lamelle entière, mais ne permettent pas la solution d’anticorps pour s’étendre au delà du bord de la lamelle de verre et sur le plastique de culture de tissus. Incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Laver les lamelles de pipetage 1 mL de PBS stérile dans le bien et par la suite aspirer la solution. Répéter deux fois plus d’enlever les anticorps non fixés.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS stérile dans la cupule contenant la lamelle revêtus d’anticorps jusqu'à ce que les cellules soient prêts à être ajoutés. Remarque : Les lamelles peuvent être conservés à température ambiante, couvert avec du PBS, pour une utilisation sur le même jour.</li>
</ol>4. les lymphocytes B épandage sur Anti-Ig-Coated lamelles couvre-objet
<ol><li>Préparer modifiée HEPES-buffered saline (mHBS) : 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl2à 5 mM, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, dextrose de 1 mg/mL, 2 mM de glutamine, pyruvate de sodium 1 mM et 50 µM 2-mercaptoéthanol). Filtre stériliser cette solution et conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, faire 50 mL de mHBS avec 2 % SVF (mHBS-BF) en ajoutant 1 mL de FBS inactivés par la chaleur à 50 mL mHBS. Réchauffer le mHBS-FBS à 37 ° C avant utilisation.</li>
	<li>Centrifuger l’A20 transfectées ou les cellules de B primaires qui avaient été cultivées avec BAFF plus LPS à 525 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de mHBS-FBS, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer les cellules à 2 x 105 cellules/mL dans le mHBS-FBS.</li>
	<li>Avec une pincette, transférer la lamelle de la plaque de culture tissulaire sur un morceau de pellicule de paraffine.</li>
	<li>Ajouter 250 µL de cellules de B (5 x 104 cellules) à chaque lamelle couvre-objet.</li>
	<li>Incuber les lamelles à 37 ° C pendant 15 minutes dans l’obscurité pour permettre les cellules B à étaler sur la surface anti-IgG-enduit.</li>
</ol>5. fixation et immunomarquage des cellules
<ol><li>Préparer la solution de fixation par dilution de la solution mère de paraformaldéhyde à 16 % et la solution mère de glutaraldéhyde à 50 % dans de l’eau distillée à température ambiante pour donner une concentration finale de glutaraldéhyde paraformaldéhyde et 0,1 % à 3 %. Préparer la solution de fixation sur la journée que c’est de servir et d’ignorer tout excès. ATTENTION : Les solutions mères paraformaldéhyde et glutaraldéhyde ne doivent servir dans une hotte chimique. Suivez les instructions sur la fiche signalétique (FS).</li>
	<li>Préparer le tampon perméabilisation/blocage (3 % de BSA et 0,1 % Triton X-100 dilué dans du PBS). Filtre stériliser cette solution et conserver à 4 ° C. Le jour de l’expérience, réchauffer la quantité requise à la température ambiante.</li>
	<li>Préparer le tampon de coloration (1 % de BSA et 0,1 % de saponine dans du PBS). Stériliser cette solution filtre 0,2 µm et conserver à 4 ° C. Le jour de l’expérience, réchauffer la quantité requise à la température ambiante.</li>
	<li>Pipette 350 µL de la solution de fixation sur chaque lamelle, veiller à ce que la surface soit entièrement recouverte. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Enlever la solution de fixation de la lamelle couvre-objet en aspirant soigneusement le bord de la lamelle couvre-objet à l’aide d’une micropipette. ATTENTION : La solution de fixation doit être jetée comme des déchets chimiques dangereux.</li>
	<li>Laver les lamelles couvre-objet avec 500 µL de tampon de perméabilisation/blocage. Ajouter le liquide.</li>
	<li>Permeabilize et bloque les cellules en ajoutant 250 µL de tampon de perméabilisation/blocage à chaque lamelle et en incubant pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Diluer l’anticorps anti-tubuline lapin au 1/100 en souillant la mémoire tampon.</li>
	<li>Aspirer au large de la mémoire tampon de perméabilisation/blocage de le lamelles et ajouter 50 µL de la solution d’anticorps anti-tubuline dilué dans chaque lamelle couvre-objet. Incuber à température ambiante pendant 30 min à l’obscurité.</li>
	<li>Préparer la solution de tache d’anticorps secondaire/actine en diluant l’anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 532 et la phalloïdine conjugué Alexa Fluor 568 au 1/100 en souillant la mémoire tampon.</li>
	<li>Laver les lamelles 3 fois pour enlever l’excès d’anticorps primaire en ajoutant 500 µL de tampon de coloration et aspirant puis il.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de la solution de tache d’anticorps secondaire/actine dans chaque lamelle et incuber 30 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les lamelles 3 fois pour enlever l’excès anticorps secondaire en ajoutant 500 µL de tampon de coloration et aspirant puis il.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de réactif de montage d’une lame de microscope. Monter la lamelle sur la lame de microscope avec le côté de la cellule vers le bas. Remarque : Un support de montage « anti-fade » (voir Table des matières) est fortement recommandé de conserver l’intensité de la fluorescence des protéines de fusion de GFP. Éviter l’utilisation de réactifs contenant DAPI, qui peut interférer avec l’imagerie des fluorophores lors de l’utilisation du laser STED de montage.</li>
	<li>Laisser les lames sécher pendant la nuit dans l’obscurité. L’image de la glisse le lendemain. Remarque : Les diapositives d’imagerie dès que la lamelle est sec est fortement recommandé, comme la fluorescence GFP va diminuer au fil du temps.</li>
</ol>6. l’imagerie utilisant le Microscope STED
Remarque : Veuillez noter que toutes les étapes de logiciel décrites ci-dessous sont spécifiques au microscope et logiciel, nous avons utilisé (voir la Table des matières). Les étapes et paramètres devront être ajustées si l’imagerie est réalisée à l’aide d’un microscope/logiciel différent.
<ol><li>Allumez le microscope STED, activer les lasers et la lampe d’éclairage épifluorescence et lancer le logiciel de microscope.</li>
	<li>Définissez les paramètres pour les lasers de déplétion STED. Remarque : Cela dépendra du microscope spécifique utilisé et les lasers qui elle est équipée. Certains ont recommandé les paramètres sont lumière blanche (WLL) 70 % ; 592 nm laser 80 % ; 660 nm laser 80 %.</li>
	<li>Activer les paramètres STED et aligner les faisceaux laser STED utilisant l’objectif X 100.</li>
	<li>À l’aide de l’oculaire, l’accent de l’échantillon et sélectionnez une cellule avec l’expression de la GFP modérée. NOTE : Expression de la GFP faible sera pas visible car STED réduit l’intensité des émissions. À l’inverse, forte expression de CLIP-170-GFP induit la formation spontanée de grands groupes, qui ne reflète pas la morphologie complexe de protéine plus-fin normale microtubule et la distribution. En sélectionnant une cellule avec l’expression de la GFP modérée est essentiel pour l’imagerie avec précision les structures du cytosquelette sur le site de contact de l’antigène.</li>
	<li>Zoomer dans la cellule sélectionnée et choisissez la région d’intérêt à être photographié. Ajuster le focus pour que le plan x-y de la cellule B qui est plus proche de la lamelle est au point.<ol>
<li>Pour ce faire, placer l’objectif progressivement de la lamelle couvre-objet pour que les structures du cytosquelette cellulaire B puis aller hors du foyer et venir dans le foyer. Puis déplacer progressivement l’objectif dans le sens inverse jusqu'à ce que les structures du cytosquelette cellulaire B tout d’abord revenir dans le foyer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimiser les paramètres, y compris la puissance du laser et faisceau d’excitation détecteur de portée. Commencez avec les paramètres recommandés par le fabricant. Puis faire des ajustements selon les besoins afin d’optimiser le signal pour les échantillons. Tous les échantillons à comparer les uns aux autres avec les mêmes paramètres de l’image.</li>
	<li>Sous l’onglet « acquérir » du logiciel, affectez l’acquisition d’image acquisition de trame séquentielle dans le panneau inférieur gauche « Scan séquentiels » en cochant l’option « entre cadres ».</li>
	<li>Définir la séquence d’acquisition. Remarque : Nous acquérons la fluorescence GFP tout d’abord afin d’éviter la dégradation du signal GFP. Selon la combinaison des fluorophores utilisés en plus de la GFP, le signal de fluorescence plus longs longueur d’onde d’imagerie tout d’abord peut donner de meilleurs résultats. Toutefois, l’ordre dans lequel les fluorophores ou protéines fluorescentes sont soumis à l’épuisement de l’émission stimulée et imagés doit être optimisé pour obtenir les plus forts signaux de fluorescence et la meilleure résolution.</li>
	<li>Sélectionner et régler la puissance de laser STED pour chaque fluorophore sous l’onglet « Acquérir » du logiciel et utilisez la barre de défilement pour le 592 nm ou le laser STED de 660 nm pour ajuster la puissance du laser. Régler la puissance du laser de déplétion 592 nm pour GFP et Alexa Fluor 532. Régler la puissance du laser de déplétion de 660 nm pour Alexa Fluor 568.</li>
	<li>Pour augmenter la résolution et réduire le signal de fond, allez dans les paramètres « Acquisition » sous l’onglet « Acquire » du logiciel, augmenter la ligne et/ou la trame en moyenne en sélectionnant une valeur supérieure à 1 en utilisant le menu déroulant pour chaque option.</li>
	<li>En outre, acquérir le signal fluorescent utilisant STED temps-dépendants en cochant l’option de blocage pour le fluorophore sous l’onglet « Acquérir », en indiquant les valeurs pour cloisonnement temps (voir note ci-dessous). Augmenter la puissance du laser STED pour améliorer la résolution, mais cela augmentera également le photoblanchiment des fluorophores. Remarque : Le temps de blocage devra être optimisé pour le microscope, échantillon et fluorophores utilisés. Un blocage de temps de 0,3 à 6 ns est recommandé. Après fixation, GFP est particulièrement sensible aux laser haute puissance. Pour réduire le photoblanchiment de GFP, temps de déclenchement doit être appliquée et la puissance du laser STED devrait être réduite.</li>
	<li>Pour capturer des images 3D de STED, utilisez le curseur pour modifier le point de fonction (PSF) d’étalement pour « STED 3D ».</li>
	<li>Manuellement l’acquisition des images multiples pour assurer la reproductibilité. Donne les images (voir Figure 1) en utilisant un logiciel de déconvolution paquet41(voir Table des matières).</li>
</ol>

<ol><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).</li>
<li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li>
<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+B+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li>
<li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+who%2C+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts%3A+Synapses+and+Kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Self+Nonself%22%5BJournal%5D)">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li>
<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311(2010).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873(2009).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunter+to+gatherer+and+back%3A+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+B+cells+capture%2C+process+and+present+antigens%3A+a+crucial+role+for+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li>
<li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk%3A+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li>
<li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li>
<li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li>
<li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li>
<li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%2BTIPs+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li>
<li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li>
<li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li>
<li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Lymphocyte+Migration%3A+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586(2015).</li>
<li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap+GTPases+regulate+the+migration%2C+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li>
<li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology%2C+immune-synapse+formation%2C+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li>
<li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion%2C+cell+spreading%2C+actin+polymerization%2C+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li>
<li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li>
<li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li>
<li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li>
<li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li>
<li>Yuseff, M. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuss%2C+JC+%22The+Image+Processing+Handbook%2C+Sixth+Edition%22">The Image Processing Handbook, Sixth Edition</a>. , CRC Press. (2011).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li>
<li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des images détaillées des structures du cytosquelette peuvent être obtenus à l’aide de la microscopie STED Super-résolution, qui peut théoriquement atteindre une résolution de 50 nm, par rapport à la microscopie confocale classique, pour lequel la résolution diffraction-limited est ~ 200 nm 24. la capacité de résoudre des structures plus fines est encore améliorée en utilisant un logiciel de déconvolution pour calculer la position très probablement de la source lumineuse originale du signal de flu...

Quand les cellules B lient à polarisé tableaux d’antigènes (p. ex., affichés sur l’aire des présentatrices d’antigène cellules (CPA)), le récepteur des cellules B (BCR) qui en résulte la formation d’une structure classique de synapse immunitaire, qui a été décrit dans les disques de signalisation T les cellules1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Au départ, amas de forme de RCO antigène liée à la périphérie de la cellule B : APC Contactez le site. Ces amas se déplacent ensuite vers le centre du site contact de l’antigène, où ils se fondre en une grappe d’activation supramoléculaire central (cSMAC) qui constitue le noyau de la synapse immunitaire. La formation des synapses immunitaire optimise la signalisation de la BCR et facilite l’extraction induite par la BCR l’antigène de la membrane APC14. Cette acquisition d’antigène, qui est suivie de l’internalisation médiée par BCR antigène et du traitement subséquent de l’antigène, permet aux cellules de B de présenter peptide : MHC complexes II aux cellules T et susciter des lymphocytes T aide14. Parce que la formation des synapses immunitaire favorise l’activation des lymphocytes B, élucider les mécanismes qui établissent que ce schéma fonctionnel de l’organisme récepteur peut fournir de nouveaux aperçus de comment d’immunité humorale sont initiées ou réglementés.
Réorganisation de l’actine et microtubules cytosquelettes est essentielle pour la formation des synapses immunitaire. BCR localisé signalisation stimulée par un tableau polarisé dans l’espace des antigènes induit rapide et spectaculaire de remodelage de l’actine cytosquelette1,15. La formation de structures dendritiques actine à la périphérie de la cellule B exerce des forces poussant sur la membrane plasmique et favorise la propagation des cellules B. Cela permet à la cellule B balayer une surface plus grande de la surface de l’antigène-roulement et augmente le nombre des RCO qui se lient à l’antigène et activer la BCR, voies de signalisation. Dans le même temps, la MTOC et le réseau de microtubules sont réorientés vers le site de contact de l’antigène. La MTOC approche le site contact de l’antigène, les microtubules émanant de la MTOC s’étendent le long de la face interne de la membrane plasmique à l’interface entre la cellule de B et de l’antigène-roulement surface16,17. Ces microtubules juxtamembrane peuvent alors servir de pistes pour le mouvement centripète dynéine-mediated de liaison antigène BCR amas18, conduisant à la formation d’un cSMAC.
La réorientation et la polarisation de la MTOC vers la synapse immunitaire nécessite l’actine intact et cytosquelettes des microtubules et dépend souvent des interactions entre l’actine corticale réseau et les microtubules16,17, 19,20. Protéines actine corticales, tels que IQGAP1, peuvent capturer des microtubules en interagissant avec des complexes protéiques qui décorent les microtubules plus-extrémités21. Ces dynamiques complexes de protéines liant le bout plus incluent EB1 et CLIP-170, qui sont collectivement désignés comme les microtubules plus-fin suivi de protéines (+ conseils)21,22. + Conseils aux extrémités des microtubules peuvent se lier aux protéines qui sont associées à la membrane plasmique ou le cytosquelette d’actine corticale. Cela permet les mécanismes générateurs de force (par exemple, la fin du moins de mouvement de dynéine corticalement ancrés le long des microtubules dirigé) pour exercer une force de traction sur les microtubules et ainsi replacer la MTOC. CLIP-170 peut se lier à la protéine d’échafaudage associées à l’actine IQGAP123, et nous avons montré que tous les deux de ces protéines sont nécessaires pour la polarisation induite par le BCR MTOC vers la synapse immunitaire17. Cette interaction IQGAP1-CLIP-170 peut jouer un rôle clé dans le remodelage du cytosquelette d’actine avec le repositionnement de la réseau de microtubules à la synapse immunitaire de B-cellule de coordination.
La microscopie en fluorescence conventionnelle a révélé la réorganisation dramatique de l’actine et des microtubules cytosquelettes lors de B-cellule immunitaire synapse formation2. Toutefois, cette approche ne peut pas résoudre les petites structures cellulaires en détail en raison de la limite de diffraction de la lumière, qui, conformément à la Loi de l’Abbe, dépend de la longueur d’onde de la lumière utilisée pour éclairer l’échantillon et l’ouverture de l' objectif24. Cette limite de diffraction limite la résolution des microscopes à lumière conventionnelles à 200-300 nm dans le sens latéral et de 500 à 700 nm dans le sens axial25. Par conséquent, plus petites structures subcellulaires, ainsi que les détails fins de l’actine et des microtubules cytosquelettes, pourraient être observées seulement au microscope électronique. Microscopie imagerie du cytosquelette prend du temps, nécessite des protocoles de fixation et préparation de témoin sévères qui peuvent altérer les structures biologiques et sont limite à médiée par les anticorps de détection. La capacité de réagissent et simultanément plusieurs protéines d’image ou de structures cellulaires est un avantage considérable de la microscopie de fluorescence. Par ailleurs, exprimant des protéines de fusion fluorescent dans des cellules permet une imagerie en temps réel et est utile lorsque des anticorps efficaces pour immunostaining la protéine d’intérêt ne sont pas disponibles.
Les progrès technologiques récents en microscopie de Super-résolution ont dépasser les limites de la diffraction de la lumière et a permis la visualisation des nano structures cellulaires24. Une telle technique de microscopie de Super-résolution est appelée émission stimulée épuisement (STED) microscopie. STED emploie deux lasers, où un seul laser excite le fluorophore et un deuxième laser avec un motif en forme de beignet sélectivement supprime l’émission de fluorescence autour le fluorophore. Ceci réduit la fonction de point-propagation (zone apparente) d’une seule particule fluorescente et fournit une diffraction sous limite image fluorescente25,26. Microscopie de l’appauvrissement de l’état fondamental emploie également basés sur la fluorescence des techniques d’acquisition d’images de Super-résolution. Cependant, les temps d’acquisition et de la reconstruction image sont longs, il y a seulement un nombre limité de fluorophores qui peut être utilisés, et l’imagerie haute résolution simultanée de plusieurs composants du cytosquelette est techniquement difficile parce qu’il est maintenant structures d’actine et les microtubules nécessite des procédures différentes de fixation. Par conséquent, STED a plusieurs avantages par rapport à la microscopie électronique et autre microscopie Super-résolution s’approche car elle offre d’acquisition d’images rapide, a des exigences minimales de post-traitement et emploie les mêmes fluorophores et techniques de coloration qui sont utilisés pour la microscopie de fluorescence conventionnels d’échantillons fixe26.
Super-résolution microscopie a maintenant été utilisée pour visualiser des structures de l’actine à la synapse immunitaire aux cellules tueuses naturelles de (NK) et T cellules26,27,28,29,30, 31. Toutefois, imagerie de Super-résolution du cytosquelette de microtubules, ainsi que la réorganisation coordonnée de l’actine et des microtubules cytosquelettes au cours de la formation des synapses immune, a seulement récemment rapporté17. Nous avons utilisé la microscopie STED pour les cellules d’image B qui avaient été autorisées à diffuser sur les lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui stimulent la BCR de signalisation et de lancer la réorganisation du cytosquelette. Quand plaqué sur les anticorps anti-Ig immobilisés, les cellules B subissent dramatique s’étalant actine-dépendante, qui récapitule les événements initiaux au cours de la formation des synapses immunitaire. Ce qui est important, la microscopie STED a révélé les détails de l’anneau dendritique d’actine-F qui se forme à la périphérie du système immunitaire font synapse et a montré que la MTOC, ainsi que les microtubules attachées à elle, avaient déménagé à proximité de l’antigène contact site17. Ces microtubules étendu vers l’extérieur vers l’anneau périphérique d’actine-F. En outre, imagerie STED multicolore de diverses combinaisons de F-actine, tubuline, IQGAP1 et GFP-étiquetée CLIP-170 + conseils ont montré que les microtubules plus-extrémités marquées par CLIP-170-GFP étaient étroitement liés avec le réseau d’actine périphérique et IQGAP1, un corticale capture protéines17.
Nous présentons ici un protocole détaillé d’imagerie de l’actine et des microtubules cytosquelettes à la synapse immunitaire à l’aide de la microscopie STED. Ces méthodes ont été optimisées en utilisant la ligne de murin B cellule A20, qui a été largement utilisée pour l’étude de signalisation de la BCR et synapse immunitaire formation17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. parce que les anticorps commerciaux à CLIP-170 ne fonctionnent pas bien pour l’immunomarquage dans des expériences antérieures, nous décrivons en détail l’expression de la GFP-étiquetée CLIP-170 dans les cellules A20, ainsi que de protocoles pour visualiser simultanément jusqu'à la coloration trois éléments du cytosquelette ou protéines associées au cytosquelette. Méthodes pour l’utilisation de la microscopie STED à l’actine image aux synapses immunitaires de cellules NK ont été décrits précédemment40. Ici, nous étendre cela à acquérir des images de Super-résolution multicolore de cytosquelettes fois l’actine et les microtubules dans les cellules de B.
Un facteur critique pour la microscopie de Super-résolution est en utilisant les procédures de fixation appropriés pour le maintien des structures cellulaires et prévenant les dommages aux protéines fluorescentes. La fixation et coloration des méthodes présentées ici ont été optimisés afin de conserver la fluorescence GFP et fournir une imagerie des réseaux actine et les microtubules. En exprimant des protéines fluorescentes, il convient de noter que les cellules B sont généralement difficiles à transfecter. Utilisant ce protocole, 20-50 % de l’A20, cellules expriment généralement la protéine de fusion de GFP transfectée, et parmi cette population, les niveaux d’expression de protéine sont variables. Néanmoins, l’imagerie Super-résolution d’actine et les microtubules en utilisant les procédures que nous décrivons est assez robuste et sont facilement obtenir des images de haute qualité. Malgré leur petite taille par rapport aux cellules A20, nous montrons que ces procédures peuvent également servir à l’image du réseau de microtubules dans les cellules de B primaires qui ont été brièvement activés avec le lipopolysaccharide (LPS). Nous avons montré qu’activés par le LPS des cellules de B primaires peuvent être transfectées avec siARN à relativement haute efficacité (c.-à-d., tels que l’appauvrissement de protéine peut être détectée par immunoblotting), ce qui les rend une bonne alternative à l’utilisation de lignées cellulaires B pour certaines études 17.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 souris cellules de lymphome B</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Lymphome murin à cellules B d’origine Balb/c qui exprime un BCR contenant des IgG à sa surface</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; R0883</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Inactivation thermique à 56 oC pendant 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid, 10 000 unités</td></tr><tr><td><fort>Matériaux supplémentaires pour cellules B primaires</fort></td>70-&micro<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ; Filtre à cellules m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de cellules B à base de billes magnétiques</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Mouse B Cell Kit d’isolement</td></tr><tr><td>de lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS de E. coli 0111 :B4</td></tr><tr><td>Facteur d’activation des cellules B (BAFF)</td><td>R& D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td><Nom>fort</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Transfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Codage plasmidique CLIP-170-GFP</td><td></td><td></td><td>Don du Dr Kozo Kaibuchi (Université de Nagoya, Nagoya, Japon) ; décrit dans Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>Recommended transfection reagents and equipment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Suivez les instructions du fabricant pour mélanger les réactifs de transfection avec l’ADN</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programme L-013 utilisé</td></tr><tr><td>Plaques Falcon 6 puits, traitées TC, stériles</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Coating coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-mm de diamètre rond #1.5 lunettes de couverture</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Produit similaire : Marienfield-Superior catalogue #117580</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Pince à échardes extra fines pour dissection</td></tr><tr><td>Falcon Plaque de culture de tissus en polystyrène stérile à 12 puits</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100 % méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-souris de chèvre</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>Pour les cellules A20</td></tr><tr><td>Anticorps IgM anti-souris de chèvre</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>Pour les lymphocytes B primaires de souris</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Coloration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (solution mère à 16 %)</td><td>Microscopie électronique</td><td>Sciences 15710</td><td>Diluer avec du PBS à concentration de travail</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde (solution mère à 50 %)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Diluer avec du PBS à la concentration de travail</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA), Fraction V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-tubuline</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab52866</td><td>Dilution 1:250 recommandée mais doit être optimisée</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532 chèvre conjuguée anti-lapin IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>Dilution 1:100 recommandée mais doit être optimisée</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjuguée phalloïdine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>Dilution 1:100 recommandée mais doit être optimisée</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>sans DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution</td><td>software Scientific Voume Imaging</td><td></td><td>Voir https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la synapse immunitaire de b-cellule émission stimulée par épuisement (sted) microscopie

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Les lymphocytes B qui se lient aux antigènes membranaires (par exemple, sur la surface d’une cellule de présentatrices) forment une synapse immunitaire, une structure cellulaire spécialisée qui optimise la signalisation de cellules B récepteur (BCR) et acquisition d’antigène induite par la BCR. Le remodelage du cytosquelette d’actine et de la réorientation de la réseau de microtubules vers le site de contact de l’antigène sont essentiels pour la formation des synapses immunitaire. Remodelage du cytosquelette d’actine dans un anneau périphérique dense d’actine-F est accompagnée par la polarisation du pôle Organisation des microtubules vers la synapse immunitaire. Protéines microtubule bout plus contraignantes, ainsi que les protéines corticale plus-fin capture la médiation des interactions physiques entre l’actine et des microtubules cytosquelettes, qui leur permettent d’être réorganisé de manière coordonnée. Élucider les mécanismes que cette réorganisation du cytosquelette, mais aussi comprendre comment ces structures du cytosquelette façonner la formation des synapses immunitaire et BCR de signalisation, de contrôle peuvent apporter un nouvel éclairage sur l’activation des lymphocytes B. Cela a été favorisé par l’élaboration de méthodes de microscopie de Super-résolution qui révèlent de nouveaux détails de l’organisation en réseau du cytosquelette. Nous décrivons ici une méthode pour microscope émission stimulée épuisement (STED) simultanément les structures image actine, microtubules et plus-fin transfectées GFP-étiquetée microtubule protéines dans les cellules de B. Pour modéliser les événements précoces dans la formation des synapses immunitaire, nous laisser diffuser sur lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui déclenchent la BCR de signalisation et de remodelage du cytosquelette des cellules B. Nous fournissons des protocoles étape par étape pour exprimer les protéines de fusion de GFP dans des cellules A20 B-lymphome, pour la diffusion cellulaire induite par l’anti-Ig et pour la fixation ultérieure de cellule, immunomarquage, acquisition d’images et image déconvolution étapes. Les images haute résolution obtenues à l’aide de ces procédures permettent de visualiser simultanément les structures de l’actine, les microtubules et les protéines de liaison de plus en bout de microtubules qui peuvent lier ces deux réseaux du cytosquelette.

Pour les cellules de B épandage sur immobilisé anti-Ig, microscopie STED utilisée en conjonction avec le logiciel de déconvolution fournit des images de résolution supérieure des structures du cytosquelette de microscopie confocale. Cela est évident dans la Figure 1, où le réseau d’actine F a été visualisé en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Une comparaison des confocale et STED Super-résolution images du même échantillon montre que les images STED on...

Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

L’objectif global de ce protocole est de colorer les cytosquelettes d’actine et de microtubules au niveau de la synapse immunitaire des cellules B pour la déplétion par émission stimulée, ou microscopie STED, et l’imagerie de leur structure, de leur organisation dans des relations spatiales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’organisation du cytosquelette lors de l’activation des lymphocytes B, y compris la réorganisation des cytosquelettes d’actine et des microtubules lors de la formation des synapses immunitaires. Le principal avantage de la microscopie STED multicolore est qu’elle permet l’imagerie simultanée du cytosquelette d’actine, du réseau de microtubules et des protéines clés associées au cytosquelette à une résolution nanométrique.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’activation des lymphocytes B, elle peut également être appliquée à la formation des synapses immunitaires d’autres types de cellules immunitaires telles que les cellules tueuses naturelles et les cellules T. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode constateront qu’il faudra un peu de pratique pour optimiser les paramètres du microscope

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre l’imagerie de cellules vivantes de la topologie des synapses immunologiques, en étudiant les interactions entre les lymphocytes T et les cellules épithéliales porteuses d’antigènes fluorescents. La microscopie à fluorescence révèle un déplacement du cytoplasme rouge et des anneaux membranaires jaunes dans les cellules endothéliales, indiquant la formation de synapses immunologiques.

Évaluation de la topologie immunologique des synapses par l’imagerie de cellules vivantes

Ici, nous montrons le protocole pour l'imagerie par deux couleurs STED nanoscopie la synapse immunitaire cytotoxique des cellules NK récapitulés sur le verre. En utilisant cette méthode, on obtient la résolution nm sous-100 de protéines synaptiques et le cytosquelette.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Nous décrivons ici une combinaison de la technique de bicouche lipidique soutenue par du verre pour former des synapses immunologiques avec la technique d’imagerie à super-résolution de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs les instructions nécessaires pour mener à bien ces deux techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Pour étudier les vitesses d’écoulement et la directionnalité de l’actine filamenteuse au niveau de la synapse immunologique des lymphocytes T, l’imagerie à super-résolution des cellules vivantes est combinée à la fluorescence par réflexion interne totale et quantifiée par spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

Ici nous décrivons deux approches pour caractériser des événements de polarisation de cellules dans les lymphocytes de B pendant la formation d'un IS. La première, implique la quantification du recrutement d'organites et des réarrangements de cytosquelette à la membrane synaptique. La seconde est une approche biochimique, pour caractériser les changements dans la composition du centrosome, qui subit une polarisation à la synapse immunitaire.

Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse

Ce protocole image à la fois la formation de synapse immunologique et le trafic sécréteur polarisé suivant vers la synapse immunologique. Des conjugués cellulaires ont été formés entre une cellule Raji à impulsion de superantigène (agissant comme cellule de présentation d'antigène) et un clone de Jurkat (agissant comme lymphocyte T d'aide d'effecteur).

Imagerie de la synapse immunologique humaine

Ici, nous présentons un protocole utilisé pour effectuer des expériences de microscopie de force de traction sur les cellules B. Nous décrivons la préparation de gels polyacrylamides mous et leur fonctionnalisation, ainsi que l’acquisition de données au microscope et un résumé de l’analyse des données.

Microscopie de force de traction pour étudier l’activation de lymphocyte de B

Nous présentons ici le protocole pour la reconstitution par étapes de cellules synthétiques présentatrices d’antigènes à l’aide de bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur utilisation pour interroger la sortie synaptique des cellules T activées.

Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T

Découvrez la microscopie STED pour visualiser l'actine et les microtubules à la synapse immunitaire des cellules B. Cette méthode offre une résolution nanométrique pour étudier l'organisation cytosquelettique.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

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