Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

L’objectif global de ce protocole est de colorer les cytosquelettes d’actine et de microtubules au niveau de la synapse immunitaire des cellules B pour la déplétion par émission stimulée, ou microscopie STED, et l’imagerie de leur structure, de leur organisation dans des relations spatiales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’organisation du cytosquelette lors de l’activation des lymphocytes B, y compris la réorganisation des cytosquelettes d’actine et des microtubules lors de la formation des synapses immunitaires. Le principal avantage de la microscopie STED multicolore est qu’elle permet l’imagerie simultanée du cytosquelette d’actine, du réseau de microtubules et des protéines clés associées au cytosquelette à une résolution nanométrique.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’activation des lymphocytes B, elle peut également être appliquée à la formation des synapses immunitaires d’autres types de cellules immunitaires telles que les cellules tueuses naturelles et les cellules T. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode constateront qu’il faudra un peu de pratique pour optimiser les paramètres du microscope pour l’imagerie simultanée et plusieurs fluorophores à l’aide de STED. Kate Choi et Caitlin Pritchard feront la démonstration de cette procédure avec Jia et Madison.

Commencez par centrifuger 2,5 fois 10 à la 6e cellule de lymphome B A20 à chaque transfection, puis remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de réactif de transfection complété par un à 2,5 microgrammes d’ADN plasmatique d’intérêt. Mélangez doucement les solutions et transférez chaque aliquote de cellules dans les puits individuels d’une plaque à six puits. Ajustez le volume de chaque puits à deux millilitres avec un milieu complet à 37 degrés Celsius et placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 18 heures.

Le lendemain matin, trempez 1,5 lamelles en verre rond de 18 millimètres dans du méthanol à 100 % et laissez les lamelles sécher complètement pendant environ 10 minutes. Placez les lamelles séchées dans les puits individuels d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits et ajoutez 400 microlitres d’anticorps anti-immunoglobuline G de chèvre au centre de chaque lamelle afin qu’une bulle se forme au centre et se propage sur les bords sans s’égoutter dans le puits. Incuber les lamelles à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, rincez les lamelles avec un millilitre de PBS stérile par puits, trois fois, pour éliminer tous les anticorps non liés. Après le dernier lavage, conservez chaque lamelle dans un millilitre de PBS frais et stérile jusqu’à l’ensemencement cellulaire. Lorsque les cellules transfectées sont prêtes, collectez-les dans un tube conique de 15 millilitres par centrifugation et remettez les granulés en suspension dans un millilitre de solution saline tamponnée HEPES modifiée complétée par FBS.

Après le comptage, diluez les cellules à une concentration de deux par 10 à la 5e cellule par millilitre et une solution saline tamponnée HEPES modifiée plus FBS, et utilisez une pince pour transférer chaque lamelle sur un morceau de film de paraffine. Ajoutez 250 microlitres de cellules à chaque lamelle et incubez les lamelles à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité pour permettre aux cellules de se propager sur les surfaces recouvertes d’anti-immunoglobuline G. À la fin de l’incubation, retirez l’excès de solution saline de chaque lame et enduisez chaque lamelle de 350 microlitres de fixateur, en veillant à ce que toute la surface soit couverte.

Après 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante, à l’aide d’une micropipette, aspirez soigneusement le fixateur du bord de chaque lamelle et lavez les lamelles avec 500 microlitres de tampon de perméabilisation et de blocage. Ensuite, perméabilisez et bloquez les cellules avec 250 microlitres de perméabilisation fraîche et tampon de blocage pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, retirez l’excès de tampon et étiquetez les cellules avec 50 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver la lamelle trois fois avec 500 microlitres de tampon de coloration par lavage et ajouter 50 microlitres de l’anticorps secondaire approprié à chaque lamelle pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir lavé l’anticorps secondaire, ajoutez 10 microlitres de réactif de montage à une lame de microscope et montez les lamelles sur des lames de microscope individuelles, côté cellule vers le bas. Laissez ensuite les lames sécher toute la nuit dans l’obscurité pour l’imagerie du lendemain.

Pour imager les cellules avec la microscopie STED, allumez d’abord le microscope STED. Activez les lasers de la lampe d’éclairage à épifluorescence et ouvrez le logiciel du microscope. Réglez les paramètres des lasers d’appauvrissement STED et chargez le premier échantillon sur le microscope.

À l’aide de l’oculaire, faites la mise au point manuellement sur l’échantillon pour sélectionner une cellule avec une expression modérée de la GFP. Zoomez sur la cellule sélectionnée et sélectionnez la région d’intérêt à imager. Ajustez la mise au point de sorte que le plan XY de la cellule la plus proche de la lamelle soit net.

Ensuite, sous l’onglet Acquérir du logiciel, cochez l’option Entre les images dans le panneau Balayage séquentiel pour définir l’acquisition d’image sur l’acquisition d’images séquentielle. Réglez la puissance laser STED pour chaque fluorophore et utilisez la barre coulissante pour ajuster les puissances laser en fonction des fluorophores utilisés dans l’expérience. Pour augmenter la résolution et réduire le signal d’arrière-plan, ouvrez les paramètres d’acquisition et utilisez le menu déroulant pour sélectionner une valeur supérieure à un afin d’augmenter la moyenne de ligne et/ou d’image.

Vérifiez l’option de gain pour chaque fluorophore et les valeurs spécifiques pour le gain de temps afin d’acquérir le signal fluorescent approprié pour le STED temporel et d’augmenter la puissance du laser STED pour améliorer la résolution. Il est essentiel d’optimiser le gain de temps d’acquisition pour l’échantillon de microscope et les fluorophores utilisés afin d’améliorer la résolution sans perdre trop de signal fluorescent. Ensuite, acquérez manuellement plusieurs images pour assurer la reproductibilité et déconvolution des images à l’aide d’un progiciel de déconvolution conformément aux instructions du fabricant.

Pour les cellules de lymphome B A20, propager des anticorps immunoglobulines NT immobilisés. La microscopie STED utilisée en conjonction avec un logiciel de déconvolution fournit des images à plus haute résolution des structures du cytosquelette que la microscopie confocale seule. Bien que la déconvolution des images confocales entraîne une amélioration substantielle de la résolution de l’image, les images STED déconvoluées fournissent des informations structurelles plus détaillées que les images confocales déconvolutées.

Le STED unicolore peut également être utilisé pour acquérir des images tridimensionnelles à super-résolution de l’ensemble du réseau cytosquelettique des cellules B. Dans ces images STED multicolores, la coloration de l’anneau périphérique de l’actine dendritique peut être observée en conjonction avec la coloration des microtubules. Lors de l’utilisation de cellules transfectées avec des protéines de fusion fluorescentes, l’obtention de niveaux d’expression optimaux et l’évitement des artefacts dus à la surexpression sont des considérations importantes, tandis qu’une expression trop faible de la protéine de fusion fluorescente entraîne également des images de mauvaise qualité.

Il est également essentiel de se concentrer sur l’ensemble de la région d’intérêt. Par exemple, sur cette image, seules des parties du réseau de microtubules se trouvaient dans le plan focal le plus proche de la lamelle, ce qui a empêché une analyse complète de l’échantillon. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours.

Une journée pour la préparation et la coloration de l’échantillon et une journée pour l’imagerie STED. Il est important de ne pas oublier de titrer la quantité de plasma à utiliser pour transfecter les cellules afin d’obtenir une expression suffisante de la protéine fluorescente pour la détection pendant l’imagerie tout en évitant les artefacts dus à la surexpression. Suite à cette procédure, l’expression de différentes protéines de fusion fluorescentes peut être induite pour faciliter la localisation d’autres protéines qui régulent la dynamique et l’organisation du cytosquelette, ou pour visualiser la distribution subcellulaire des protéines impliquées dans d’autres processus cellulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie STED pour l’imagerie des structures et des protéines du cytosquelette qui sont impliquées dans la formation des synapses immunitaires. N’oubliez pas que travailler avec des fixateurs tels que le glutaraldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte chimique doivent toujours être prises lors de l’utilisation de ces types de réactifs.