Name: Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Découvrez le suivi de progression tumorale par imagerie PET non invasive utilisant un gène rapporteur radionucléide-fluorescence chez les rongeurs. Cette méthode réduit l'utilisation animale et permet de visualiser les métastases en temps réel.

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La recherche a été financée par le King College de Londres et UCL complets Cancer Imaging Centre, financé par Cancer Research UK et EPSRC en liaison avec le CFM et le DoH (Angleterre) ; le National Institute for Health Research (NIHR) Centre de recherches biomédicales basé à Guy et St Thomas' NHS Foundation Trust et College London du King's ; le Centre d’Excellence en génie médical financé par le Wellcome Trust et EPSRC sous concession numéro WT 088641/Z/09/Z ; Cancer Research UK multidisciplinaire attribution d’un projet à GOF PJB et subvention santé partenaires d’un roi de GOF. Les scanners nanoPET/CT et nanoSPECT/CT ont été achetés et entretenus par une subvention du Wellcome Trust. Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement celles de la NHS, le NIHR ou le DoH.

<ol><li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li>
<li>Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+molecular+imaging+using+reporter+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive molecular imaging using reporter genes.</a> J Nucl Med. 54 (2), 167-172 (2013).</li>
<li>Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-body+dual-modality+radionuclide+optical+strategy+for+preclinical+imaging+of+metastasis+and+heterogeneous+treatment+response+in+different+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments.</a> J Nucl Med. 55 (4), 686-694 (2014).</li>
<li>Terrovitis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+sodium-iodide+symporter+enables+imaging+of+transplanted+cardiac+stem+cells+in+vivo+by+single-photon+emission+computed+tomography+or+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography.</a> J Am Coll Cardiol. 52 (20), 1652-1660 (2008).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+Macrophage+Migration+Using+Reporter+Gene+Imaging+with+Human+Sodium+Iodide+Symporter+in+Animal+Models+of+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation.</a> J Nucl Med. 51 (10), 1637-1643 (2010).</li>
<li>Diocou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B18F%5Dtetrafluoroborate-PET%2FCT+enables+sensitive+tumor+and+metastasis+in+vivo+imaging+in+a+sodium+iodide+symporter-expressing+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">[18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 946(2017).</li>
<li>Lajtos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+wall+effect+eliminating+method+to+determine+the+contrast+recovery+coefficient+for+small+animal+PET+scanners+using+the+NEMA+NU-4+image+quality+phantom%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom.</a> Phys Med Biol. 59 (11), 2727-2746 (2014).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+the+small-animal+nanoScan+PET%2FMRI+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system.</a> J Nucl Med. 54 (10), 1825-1832 (2013).</li>
<li>Deleye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+small-animal+multipinhole+muSPECT+scanners+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40 (5), 744-758 (2013).</li>
<li>Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2FI-+symporter+%28NIS%29%3A+mechanism+and+medical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact.</a> Endocr Rev. 35 (1), 106-149 (2014).</li>
<li>Dohan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fiodide+Symporter+%28NIS%29%3A+characterization%2C+regulation%2C+and+medical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance.</a> Endocr Rev. 24 (1), 48-77 (2003).</li>
<li>Jauregui-Osoro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+%5BF-18%5Dtetrafluoroborate%3A+a+PET+imaging+agent+for+thyroid+disease+and+reporter+gene+imaging+of+the+sodium%2Fiodide+symporter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (11), 2108-2116 (2010).</li>
<li>Weeks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%5B18F%5D-tetrafluoroborate+as+a+potential+PET+imaging+agent+for+the+human+sodium%2Fiodide+symporter+in+a+new+colon+carcinoma+cell+line%2C+HCT116%2C+expressing+hNIS%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Med+Commun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS.</a> Nucl Med Commun. 32 (2), 98-105 (2011).</li>
<li>Khoshnevisan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B%2818%29F%5Dtetrafluoroborate+as+a+PET+tracer+for+the+sodium%2Fiodide+symporter%3A+the+importance+of+specific+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">[(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity.</a> EJNMMI Res. 6 (1), 34(2016).</li>
<li>Groot-Wassink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+the+transcriptional+activities+of+human+telomerase+promoter+fragments+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice.</a> Cancer Res. 64 (14), 4906-4911 (2004).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioiodine+therapy+of+hepatoma+using+targeted+transfer+of+the+human+sodium%2Fiodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene.</a> J Nucl Med. 47 (5), 854-862 (2006).</li>
<li>Sieger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-specific+activation+of+the+sodium%2Fiodide+symporter+gene+under+control+of+the+glucose+transporter+gene+1+promoter+%28GTI-1.3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3).</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30 (5), 748-756 (2003).</li>
<li>Chisholm, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-specific+transgene+expression+mediated+by+systemic+injection+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles.</a> Cancer Res. 69 (6), 2655-2662 (2009).</li>
<li>Klutz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+radioiodine+therapy+of+neuroblastoma+tumors+following+systemic+nonviral+delivery+of+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene.</a> Clin Cancer Res. 15 (19), 6079-6086 (2009).</li>
<li>Merron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Na%2FI+symporter+as+a+reporter+gene+to+visualize+oncolytic+adenovirus+propagation+in+peritoneal+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (7), 1377-1385 (2010).</li>
<li>Merron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECT%2FCT+imaging+of+oncolytic+adenovirus+propagation+in+tumours+in+vivo+using+the+Na%2FI+symporter+as+a+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene.</a> Gene Ther. 14 (24), 1731-1738 (2007).</li>
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<li>Siddiqui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+considerations+for+incorporating+sodium+iodide+symporter+reporter+gene+imaging+into+prostate+cancer+gene+therapy+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials.</a> Hum Gene Ther. 18 (4), 312-322 (2007).</li>
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<li>Hwang do, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+monitoring+of+neuronal+differentiation+using+reporter+driven+by+a+neuronal+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Edmonds, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+Metal-Chelating+Properties+of+the+Drug+Cargo+for+In+Vivo+Positron+Emission+Tomography+Imaging+of+Liposomal+Nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines.</a> ACS Nano. 10 (11), 10294-10307 (2016).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Heterogeneity+of+Protein+Kinase+Activation+in+Cells+by+Super-resolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 249-257 (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

La première étape pour rendre le cancer cellules traçable in vivo par cette méthode nécessite d’ingénierie pour exprimer le reporter de fusion de NIS-FP. Le choix de la protéine fluorescente dans le recueil de fusion est critique car oligomerizing protéines fluorescentes peut conduire à la journaliste artificielle mise en cluster, ainsi négativement altération de ses capacités. Nous avons eu des succès avec des protéines fluorescentes monomères éprouvées comme mEGFP (avec la mutation monomerizing A206K36,37), mTagRFP ou mCherry. NIS peut être de l’homme ou à l’origine de la souris (hNIS ou msNIS) selon le but de l’expérience et le modèle du cancer. Efficacité de la transduction varie généralement entre lignées cellulaires cancéreuses différent. Cependant, lignées cellulaires cancéreuses générées sont ensuite purifiées par FACS dans ce protocole, ce qui réduit la nécessité pour l’optimisation des conditions de transduction. Transduction avec multiplicité élevée de l’infection n’est pas toujours souhaitable que plusieurs construct intégration dans le génome est susceptible d’entraîner non seulement dans l’expression de construction plus élevée, mais aussi en plus indésirables/non réglementée de modification du génome. Par conséquent, il est important de laisser des cellules transduits polyclonales poussent à la stabilité de l’expression (surveillée par cytométrie en flux) et éviter les clones les plus brillants que par FACS de tri. Il restitue également la validation fonctionnelle des fonctions non-journaliste crucial avant que ces cellules doivent être utilisés pour des expériences in vivo . Une alternative développée récemment à la livraison de gènes viraux est gène édition technologie38, qui offre un contrôle plus précis sur les sites d’intégration virale. Analyse de l’expression par cytométrie en flux et immunoblotting est important. Cytométrie en flux permet l’acquisition des données de cellule unique basée sur la population, par exemple pour examiner s’il y a toute dérive dans les niveaux d’expression de journaliste au fil du temps. Elle s’appuie sur la portion FP uniquement, sauf si les cellules sont également colorées avec un anticorps dirigé contre la surface ou total NIS. Cytométrie en flux n’informe pas sur l’intégrité de journaliste de fusion. En revanche, immunoblotting rapports sur l’intégrité de la journaliste de fusion. Le poids moléculaire de NIS et la FP s’ajoutent pour déterminer le poids moléculaire prévu du choisi NIS-FP. Confocal fluorescence microscopie a démontré fusion journaliste co-localisation avec l’agglutinine de germe de blé-la membrane plasmique marqueur dans tous les nouveaux Faites des lignées cellulaires. Ce fut l’emplacement attendu cellulaire pendant la majeure partie de la protéine et indiqué un jalon feu vert pour la validation fonctionnelle subséquente. Si minime/no NIS-FP a été trouvé sur la membrane de plasma (par exemple uniquement dans des compartiments cellulaires internes), ceci indique probablement un problème biologique cellulaire avec le journaliste de fusion dans cette lignée cellulaire ou une mutation potentielle du reporter fusion affectant sa trafic intracellulaire. Il est à noter que nous n’avons pas observé de ce cas dans aucune des cellules cancéreuses nous avons testé à ce jour, qui comprenait : A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (mélanome humain) ; MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (cancer du sein humain) ; NCI-H1975 (cancer du poumon humain) ; SK-Hep1 (cancer du foie humain) ; 4 t. 1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (cancer du sein inflammatoire murin) ; B16F0, B16F3, B16F10 (mélanomes murins) ; MTLn3 (adénocarcinome du sein de rat).
Fonction de NIS doit être mesurée à l’aide de tests d’absorption avec des substrats radioactifs de NIS. En raison de la SPECT radiotraceur 99 mTcO4– étant générateur-produit et donc largement disponibles dans les hôpitaux sans la nécessité d’une synthèse de traceurs radioactifs ainsi que d’avoir une demi-vie plus longue plus commode (h 6,01 m 99 TC comparativement à 110 min pour 18F), nous avons utilisé ce substrat de NIS pour validation fonctionnelle systématique de nouvelles lignées de cellules exprime NIS-FP. Avant blocage des cellules exprimant le NIS avec le perchlorate de sodium co-substrat NIS a entraîné la réduction/suppression attendue de la captation du radiotraceur, démontrant ainsi la spécificité de la captation du radiotraceur. Ce test de spécificité de NIS est une étape de validation critique. Si une expérience de spécificité de NIS n’entraînerait pas l’absorption réduite de traceurs radioactifs comparables aux cellules parentales respectives, soit une erreur technique lors de l’expérience s’est produite, ou la captation du radiotraceur n’était pas due à NIS. Il est également possible que sodium perchlorate avant blocage réduit la captation du radiotraceur dans une lignée de cellules parentales ; Cela permettrait d’identifier des lignées cellulaires avec expression endogène de NIS fonctionnelle (p. ex. stimulée thyroïde cellules6).
Un avantage crucial du présent protocole d’imagerie, c’est que l’information est recueillie en 3D et au fil du temps. Cela permet la comparaison des images de l’animal même avec le temps, offrant ainsi des données appariées et ainsi surmonter les problèmes causés par les animaux. Cela contraste avec les méthodes d’évaluation plus sans imagerie métastase connexes qui sont inspirent de sacrifier des animaux différents à des moments différents. Dans la Figure 3 b , il est évident comment métastatique propagation et la croissance a progressé au fil du temps dans un animal. Les signaux détectés par imagerie TEP/CT sont fondamentalement causés par l’expression de NIS. Cela inclut tous les signaux de façon exogène les cellules cancéreuses exprimant le NIS ainsi que tous les organes exprimant endogène NIS. Des signaux de NIS endogènes typiques sont trouvent dans la thyroïde et des glandes salivaires, l’estomac et, en faibles quantités dans certaines parties des glandes mammaires et lacrymales. En plus de l’expression endogène de NIS, les traceurs radioactifs [18F] NIS BF4– est également excrétée au niveau des reins, ce qui explique l’absorption traceurs radioactifs dans les vessies rempli d’urine. Absorption de rein n’est plus détectable au point imagerie temps recommandé dans le présent protocole (45 min poste radiotraceur injection6). Si les signaux des vessies rempli d’urine devraient conduire à des problèmes de signal-à-fond, la vessie peut être vidée mécaniquement sous anesthésie avant l’imagerie. Ce qui est important, les signaux endogènes peuvent varier entre souches animales. On notera également qu’expression endogène de NIS dans les glandes mammaires peut être plus élevée en vertu de conditions qui n’allaitaient pas10. Dans le cas présenté et dans les cas de ces lignées de cellules métastatiques caractérisées avec succès avant (cf. liste ci-dessus), nous n’avons pas trouvé expression endogène de NIS considérablement gêner la détection de métastases. Il convient de noter que [18F] BF4– reste plus disponibles pour l’absorption dans les tissus cancéreux comparativement à iodure, parce que l’iodure est métabolisé en hormones thyroïdiennes6. Ce phénomène pourrait également contribuer à des quantités plus grandes de radioiodure dans le sang par rapport à [18F] BF de4le- 6. Pour différentes applications (cellule cancéreuse suivi dans d’autres cancers ou des cellules non cancéreuses applications de suivi), cela peut être différent, et il est donc recommandé d’évaluer si l’expression endogène de NIS est susceptible d’entraîner des problèmes de signal-à-fond à travers expériences préliminaires. Un aspect important dans l’imagerie préclinique est l’activité molaire du radiotraceur. La méthode décrite ici utilise ~1.5 GBq 18F– comme matière départ14 et a été établie pour produire des molaires activités nettement au-dessus de la méthode de substitution a déjà été indiqué12. [18F] BF4– dressée à activités molaire ≤ 1 GBq/µmol12 peut conduire à une absorption réduite dans les tissus exprimant le NIS. Ceci est particulièrement important lorsque la quantité injectée de radioactivité par kilogramme est élevée, c'est-à-dire lorsque les petits animaux comme les souris sont imagés39; Il est moins important chez l’humain mise en40. Une activité molaire élevée est donc impérative pour l’imagerie TEP préclinique de haute qualité. Molaires activités obtenues par le bore trifluorure ajout méthode14, qui s’affiche sous sa forme automatisée dans le présent protocole, surmonter ce problème. En outre, il convient de noter que le protocole présenté pour la synthèse de4– [18F] BF n’est pas conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) et donc impropre à l’usage dans des essais cliniques humains sous cette forme. Un protocole de GMP (via la méthode de substitution de 18F à radiolabel BF4–) est disponible ailleurs40.
L’imagerie TEP/CT permet la visualisation de l’absorption de traceurs radioactifs, qui témoigne de l’absorption de traceurs radioactifs NIS-mediated découlant des cellules cancéreuses exprimant de NIS-FP. Plus important encore, les signaux de PET associés peuvent être quantifiés. Il est nécessaire d’appliquer des procédures de seuillage fiable afin d’assurer une différenciation uniforme et impartiale de signaux pertinents provenant de n’importe quel fond potentiel. Car le fond varie dans différents endroits en vivo, il est important de considérer la segmentation et seuillage local/régional. Une de ces méthodes a été développée par baptisé Otsu34et sa mise en oeuvre 3D est utilisée pour le rendu 3D de la tumeur primitive et des métastases dans le présent protocole. Généralement, l’image vue par l’observateur visuellement correspond le mieux aux valeurs quantifiées % injecté dose (ID %). En ce qui concerne la quantification basée sur une image, c’est aussi important normaliser les valeurs de la radioactivité mesurée des différents tissus et volumes. Il existe deux façons utilisés principalement d’exprimer les résultats normalisés, ID d’i % par volume (par exemple %ID/mL) et (ii) norme absorption valeur (SUV,35). Ils diffèrent en ce que %ID/mL prend en compte le volume individuel uniquement, tandis que le SUV est une mesure qui est par rapport à la radioactivité moyenne dans l’ensemble de l’animal entier. Il est également important de noter que l’imagerie NIS rend accessible, le volume de la tumeur direct (LTV) parce que les cellules mortes/mourant ne pas synthèse ATP ne peut plus importer des traceurs radioactifs10. C’est ce qui explique la grande zone de faible signal au sein de la tumeur primitive (tumeur « en forme de beigne ») en indiquant les domaines de la mort/nécrose des cellules tumorales. Ce qui est important, LTV était une mesure beaucoup plus fiable du fardeau de la tumeur par rapport au volume brut tumeur accessible par des mesures de l’étrier (qui ne tient pas la viabilité compte et évalue les seules régions de tumeur superficielle).
Un avantage majeur de cette stratégie de suivi bi-mode est évident lorsqu’ils pêchent des tissus après abattage animal. Guidés par des images in vivo et secondé par cellules cancéreuses fluorescent au cours de la dissection animale, petites et profondes organes/métastases peuvent aussi être fiable récoltées. Méthodologie de préservation/coupes de tissus congelés permet l’imagerie de fluorescence directe des GFP sans nécessiter de coloration avec un anticorps anti-GFP, mais au détriment de la préservation des tissus structuraux réduite comparativement à fixés au formol méthodologie de paraffine (FFIP). Cette dernière critique nécessite également une coloration anti-FP, car la méthode FFPE est incompatible avec le conservation intacte des protéines fluorescentes (en raison de la fixation/déshydratation/réhydratation). Alors que le signal de fluorescence est révélateur de la présence de cellules de tumeur, il est important de s’assurer que cette classification est confirmée par des mesures de radioactivité ex vivo des tissus récoltés (« biodistribution »). Ex vivo les mesures de la radioactivité sont plus sensibles que la détection visuelle de la fluorescence, peut donc permettre l’identification du cancer des signaux dépendant des lymphocytes qui autrement resteraient inaperçus. Dans le cas d’un terminal d’imagerie session, il est essentiel de noter avec précision les montants à traceurs radioactifs injectés ainsi que les temps des mesures de la radioactivité traceurs radioactifs, injection animale, animaux d’abattage et calibré à scintillation des mesures de tissus récoltés. Cela est crucial pour assurer la correction pour la désintégration des traceurs radioactifs et ainsi permettre une analyse fiable de biodistribution.
TEP/CT d’imagerie active répété non invasif quantification 3D de même que l’évaluation des métastases dans tout l’organisme au niveau de la progression tumorale. Cette fonction est un avantage significatif par rapport aux méthodes conventionnelles, qui reposent souvent sur des cohortes d’animaux qui sont euthanasiés pour l’évaluation de la progression tumorale à différents points dans le temps. Les avantages de cette approche axée sur l’imagerie sont : (i) très sensible non invasif 3D in vivo de quantification, (ii) une réduction significative en nombre d’animaux en raison de la possibilité de répéter imaging, (iii) l’acquisition de données appariées longitudinales d’ultérieures d’imagerie séances d’amélioration des statistiques en excluant la variabilité entre animaux, ce qui réduit davantage le nombre d’animaux, (iv) production automatisée de [18F] BF4– à une activité spécifique élevée et (c) la option intrinsèque ex vivo confirmation dans les tissus par des méthodes de fluorescence telles que la microscopie ou cytométrie en flux.
In vivo des cellules de suivi sont un domaine en pleine croissance. Elle a été alimentée par des avancées récentes en technologie, qui a abouti à une résolution accrue, de limites de détection et de capacité multiplexe (via l’imagerie multimodale) de l’image. Dans ce protocole, nous appliquons ce concept pour suivre la progression des tumeurs dont la métastase cellulaire du cancer spontanée en 3D par imagerie de répéter. Les applications incluent des études visant à éclaircir les mécanismes de la métastase de cellule de cancer spontanée. Par exemple, les cellules de tumeur traçable pourraient être utilisées pour étudier l’impact des composantes différentes cellules immunitaires (comme cadeau/fonctionnelle dans des souches animales de différents niveaux d’immunocompromisation) sur le processus métastatique. De même, l’impact des gènes individuels, soit dans la souche animale ou de la lignée de cellules cancéreuses, pourrait être étudiée. En outre, le protocole présenté pourrait être utilisé pour évaluer/valider l’efficacité des médicaments spécifiques ou des concepts thérapeutiques sur la progression tumorale. Ce qui est important, cette paire de gène : traceurs radioactifs de journaliste pour l’imagerie TEP (NIS : [18F] BF4–) pourraient également être utilisés pour des cellules différentes applications de suivi. Par exemple, plusieurs thérapies cellulaires font leur apparition actuellement des approches thérapeutiques aussi prometteurs. Cela inclut les thérapies cellulaires pour cancer traitement41 mais aussi dans la transplantation42 et44 43,médecine régénératrice. Corps entier en vivo cellule suivi devient de plus en plus important pour le développement et la traduction clinique des thérapies cellulaires, par exemple, pour l’évaluation de la sécurité et de surveillance de la thérapie.

Maladie métastatique est la cause de la plupart des décès liés au cancer 1. Malgré des recherches approfondies dans les processus métastatiques, surveillance fiable des métastases cancéreuses dans des systèmes modèles animaux est difficile à réaliser. Les progrès récents dans les technologies d’imagerie corporelle et des approches d’imagerie multimodales ont permis non invasif en vivo cellulaire, suivi de2,3,4,5. Ce dernier peut être utilisé comme un outil pour contrôler la présence, la distribution, la quantité et la viabilité des cellules, non invasive et à plusieurs reprises à un animal vivant ou un être humain.
Le but de la méthode décrite ici est pour suivre les cellules cancéreuses en 3D dans des modèles de tumeur rongeurs vivants longitudinalement et non invasive. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de quantifier avec précision la progression tumorale dont les métastases en 3D. Par rapport aux techniques traditionnelles non dotés d’imagerie, cette méthode propose l’acquisition de données quantitatives avec nombre d’animaux fortement réduite. Une autre caractéristique de cette méthode est qu’il permet la corrélation entre l’imagerie in vivo et simplifiée en aval ex vivo analyse des chenilles cellules dans les tissus récoltés par histologie ou cytométrie3,6.
La justification de l’élaboration de cette méthode était de fournir un outil in vivo pour la surveillance et à la quantification du processus métastatique ensemble dans les modèles de rongeurs tumeur. Ce qui est important, il a été conçu pour minimiser l’utilisation des animaux tout en réduisant les animaux. Longitudinale imagerie non invasive de tout le corps convient parfaitement pour informer sur l’excroissance métastatique, pour laquelle en soi , il est difficile de prédire avec précision l’heure et le lieu de son apparition. Imagerie 3D confiné a donc été au centre de développement de la méthode. Pour combler cet écart d’échelle entre le corps entier en vivo imagerie et potentiel en aval ex vivo confirmation histologique, une multi-échelle approche d’imagerie basée sur un journaliste bi-mode radionucléide-fluorescence a été adopté3, 6.
Par émission de positrons (TEP) est la plus sensible confiné technologie d’imagerie 3D actuellement disponible offrant profondeur excellente pénétration et quantification absolue de7 avec une résolution de < 1 mm8,9. Actuellement, préclinique cellule de suivi au niveau du corps entier par scintigraphie peut détecter de manière fiable des cellules à des densités de ~ 1 000 cellules par volume de 1 million de cellules3,6 résolutions dans la région de submillimétrique. Contrairement à la microscopie intravitale, il ne peut pas détecter les cellules cancéreuses épandage unique, mais il ne nécessite pas d’interventions chirurgicales (par exemple les chambres de fenêtre), n’est pas limité à un petit champ de vue et non par scatter et pénétration tissulaire faible. Bioluminescence imagerie fournit une alternative peu coûteuse, mais est associée à la dispersion et absorption de la lumière des questions ainsi que pénétration de faible profondeur et par conséquent fortement limitée dans la quantification2. Imagerie de fluorescence corps entier a été utilisé pour l’acquisition d’images 3D, mais il est beaucoup moins sensible par rapport à la bioluminescence ou radionucléides technologies2. Néanmoins, fluorescence offre la possibilité d’effectuer ex vivo des tissus en aval analyse en cytométrie en flux ou en microscopie. Ce dernier ferme l’échelle-écart entre l’imagerie corporelle macroscopique (résolution mm) et fluorescence tissulaires microscopiques analyse (résolution µm)3. Par conséquent, modalités de détection des radionucléides et fluorescence complètent mutuellement, allant du niveau de l’ensemble du corps à l’échelle cellulaire (sous-).
Imagerie de gène de journaliste est idéal pour cellulaire prolongé suivi tel que requis dans la recherche de métastases. Dans cette application, il est supérieur aux cellules direct d’étiquetage il est (i) pas affecté par la dilution de l’étiquette et donc pas limité dans le temps et (ii) mieux refléter les nombres de cellules vivantes. Par conséquent, tout le corps cellulaire suivi est particulièrement utile pour les applications dans lequel traçables cellules prolifèrent ou développez in vivo, par exemple, dans le cancer recherche3,6, pour la détection de la formation de tératome dans la tige recherche de cellules, ou pour la quantification des immunitaire cellulaire expansion5.
Divers gènes axée sur les radionucléides sont disponibles2. Ceux-ci incluent enzymes telles que l’herpès simplex virus HSV11 la thymidine kinase (HSV1 -tk), les transporteurs tels que le symporteur de l’iodure de sodium (NIS) ou le transporteur de la noradrénaline (NET), ainsi que des récepteurs de surface cellulaire telles que la dopamine D2 récepteurs) D2R). NIS est une protéine glycosylée membranaires qui intervient activement dans l’absorption iodure, par exemple dans les cellules folliculaires de la thyroïde pour la synthèse subséquente des hormones thyroïdiennes10. Ce processus est piloté par le symport Na+ et s’appuie sur le gradient de sodium cellulaire qui est maintenu par la Na+/k+-ATPase11. Par conséquent, NIS reflète mieux la vie cellulaire nombre que les autres journalistes comme captation iodure/traceurs radioactifs est liée à un actif Na+/k+ dégradé plutôt que la simple présence du transporteur. Traditionnellement, les radioiodure a été utilisé pour l’imagerie de NIS. Pour le suivi de la cellule, des radiotraceurs NIS alternatifs qui ne sont pas métaboliquement piégés dans la thyroïde ont été signalés à être supérieure de6. Cela s’est développé récemment PET tétrafluoroborate de traceurs radioactifs [18F] ([18F] BF4–)12,13 présente une pharmacocinétique supérieure par rapport aux radioiodure6 tout en étant disponible à une activité spécifique élevée14 sans la nécessité d’installations complexes de radiochimie. [18F] BF4– peuvent être synthétisés par l’intermédiaire de deux façons différentes. La première méthode est basée sur l’échange des isotopes non radioactifs 19F BF4– avec radioactif 18F12. La deuxième méthode est par ajout de 18F au trifluorure de bore non-radioactifs14. Cette dernière méthode a été signalée à rendement plus élevé des activités spécifiques14 et est la méthode de choix pour l’imagerie préclinique.
NIS est fortement exprimée dans les tissus de la thyroïde. Elle est également exprimée dans les glandes mammaires salivaires, lacrymales et allaitantes ainsi que l’estomac, mais à des niveaux inférieurs par rapport à la glande thyroïde10. Par conséquent, imagerie de contraste excellent dans d’autres régions du corps peut être réalisé à l’aide de NIS. Il est également très homologue entre l’humain, le rat et la souris10. En outre, il n’y a aucun cas de toxicité sur l’expression ectopique NIS dans les cellules non-thyroïdien. Ce qui est important, NIS a également pas été associé immunitaire h6te, ni chez l’homme, ni chez les rongeurs. NIS a été utilisé comme un gène rapporteur pour mesurer le promoteur activité15,16,17 et gene expression18,19,20,21,22 ,23 dans plusieurs contextes différents. Il a également été utilisé pour l’imagerie non invasive du gène thérapie vecteurs24,25et de suivre les cellules cardiaque4, hématopoïétiques26, inflammation5et études neural27. Récemment, NIS a également été utilisé comme un gène rapporteur pour suivre les métastases de cancer en vivo3,6.
En résumé, les principaux avantages de cette méthode sur les techniques précédentes sont : (i) très sensible non invasif 3D in vivo de localisation et quantification des métastatique réparties, (ii) production automatisée de [18F] BF4– à activité molaire élevée, (iii) une réduction significative des animaux requis par imagerie longitudinale, (iv) l’acquisition des données appariées de ses sessions ultérieures d’imagerie aboutissant à des données statistiques améliorées, qui réduit davantage l’utilisation des animaux et (v) l’option intrinsèque ex vivo confirmation des cellules cancéreuses dans les tissus par cytométrie en flux ou fluorescence microscopy.

<table><tbody><tr><td>Étape 1) Ingénierie et caractérisation des cellules cancéreuses pour exprimer le rapporteur de fusion radionucléide-fluorescence NIS-FP.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2'-(4-éthoxyphényl)-5-(4-méthyl-1-pipérazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Nom trivial : Hoechst 33342 ; Numéro CAS : 23491-52-3 ; Hoechst 33342, Trichlorhydrate trihydraté - 10 mg/mL Solution dans l’eau.</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire murine de cancer du sein 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td><td>pour plus de détails, consultez le site Web de l’ATCC</td></tr><tr><td>Compteur automatique de cellules, par exemple CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Modèle TT Compteur et analyseur de cellules</td></tr><tr><td>CASYclean Réactif de nettoyage</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>Diluant isotonique CASYton</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à fluorescence, e.g. Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Allemagne</td><td></td><td>équipé de Plan-Neofluor 25&times ; 0,5NA et Plan-Apochromat 63& fois ; Objectifs UV à huile 1.4NA et lasers à diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) et HeNe (543 et 633 nm) ; Un logiciel Leica LAS AF Lite 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) a été utilisé pour l’acquisition et l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Couvertures n° 1,5 d’épaisseur</td><td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td>Supplément avec 10 % (v/v) FBS et L-glutamine (2 mM) pour constituer le milieu de croissance optimal pour les cellules MDA-MB-231.</td></tr><tr><td>Trieur FACS, par exemple BD FACSAria III&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Equipé d’un logiciel BD FACS DIVA, d’un système à 6 lasers (lasers 375/405/488/561/633 nm) - cellules triées avec un 100 &mu ; Buse M sous pression d’écoulement de 20 psi, extension de fenêtre de 2,0 &mu ; m, 2.0 Filtre à densité neutre et tension de plaque 3 kV</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Chaleur inactivée à 56 &deg ; C pour 30 min</td></tr><tr><td>Compteur gamma automatisé, par exemple 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertechnetate fenêtre d’énergie 110-155 keV&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Fenêtre énergétique 18F 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &micro ; g/mL ; DAPI (de différents fournisseurs) peut être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Solution 200 mM concentrée, filtrée stérilement</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine linéaire (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Linéaire, 25 kDa ; réactif de transfection pour lignée cellulaire 293T.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellules cancéreuses du sein humain</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>pour plus de détails, voir le site Web de l’ATCC</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>demande de notre laboratoire</td><td>n/a</td><td>Pour plus de détails (génération et cartes) Voir Informations supplémentaires</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>demande de notre laboratoire</td><td>n/a</td><td>Pour plus de détails (génération et cartes) voir Informations supplémentaires</td></tr><tr><td>plasmides pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>codant pour l’enveloppe VSV-G</td></tr><tr><td>plasmide d’emballage pRRE</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>plasmide d’emballage</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td></td></tr><tr><td>solution de paraformaldéhyde à 4 % (p/v) dans PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Contenant de la pénicilline (10 000 unités/mL) et de la streptomycine (10 mg/mL),</td></tr><tr><td>une solution saline tamponnée au phosphate (PBS</td>) filtrée <td>stérilementSigma</td><td>D8537</td><td>pH 7,4, filtrée de manière stérile et sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Poly(alcool vinylique - acétate de vinyle)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Nom trivial : Mowiol 4-88 ; Numéro CAS : 9002-89-5</td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>À partir de Streptomyces alboniger, reconstitué dans de l’eau stérile&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse, par exemple Rotina 380 R Benchtop centrigfuge</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Supplément avec 10 % (v/v) FBS et L-glutamine (2mM) pour constituer le milieu de croissance optimal pour les cellules 4T1.</td></tr><tr><td>SFCA Filtre à seringue 0,45 &mu ; m</td><td>Seringues Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Seringues jetables non stériles</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence pour culture tissulaire, p.ex. EVOS-FL&nbsp ;</td><td></td><td>Système d’imagerie cellulaire Life Technologies équipé d’un objectif 10&x ; (PlanFL PH2, 10&times ;/0.25, &infin ;/1.2) et d’une caméra couleur</td>Trypsine-EDTA solution 10X&nbsp ;<td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>59418C</td> <td>(0,5 % (p/v) de trypsine, 0,2 % (p/v) d’EDTA) gamma irradié par le procédé SER-TAIN et sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>Agglutinine de germe de blé Alexa Fluor 633 conjugué&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ;</td><td>W21404</td><td>Utilisé à 1:1000 (2 & micro ; g/mL) pour l’immunofluorescence cellulaire</td></tr><tr><td>Étape 2) Etablissement de modèles tumoraux in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Caliper</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Pour l’inhalation</td></tr><tr><td>Torche de fluorescence, par exemple Torche de fluorescence NightSea DFP-1</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Équipé de filtres d’émission GFP et RFP et de lunettes filtrantes NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Seringues 0,3 mL U-100 insuline</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &times ; 1/2'' - 0.33 &times ; 12 mm</td></tr><tr><td>Matériaux/équipements standard pour la technique aseptique et l’entretien des</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>animauxÉtape 3) Production de [18F]BF4- à l’aide d’une plateforme automatisée de synthèse de radiotraceurs.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acétonitrile (anhydre)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>Étherate de diéthyle de trifluorure de bore</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216607</td><td>BF3. OEt2, purifiés par redistillation, &ge ; 46,5 % BF3. CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Plateforme automatisée de synthèse de radiotraceurs (ARS), par exemple FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cassettes jetables pour plateforme ARS, par exemple cassettes FASTLab</td> GE <td>Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Pack de développement</td></tr><tr><td>Polygram Alox N/UV254 Plaques polyester</td><td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>Plaques RadioTLC, 40&times ; Cartouche</td></tr><tr><td>échangeuse d’anions puissante de 80 mm, par exemple Sep-Pak Accell Plus QMA Plus</td><td>Light Waters</td><td>WAT023525</td><td>Condition avec 1M NaCl (10 mL) et H2O (10 mL)</td></tr><tr><td>Cartouche neutre en alumine, par ex. Sep-Pak Alumina N Plus Light</td><td></td><td>Waters WAT023561</td><td>Condition avec H2O (10 mL), acétone (10 mL) et air (20 mL)</td></tr><tr><td>Eau pour injection USP</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen filtre</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Stérile 0,2 & micro ; m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>Étape 4) Imagerie in vivo de cellules exprimant NIS-FP par nanoPET/CT.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>For inhalation</td></tr><tr><td>Instrument d’imagerie multimodale préclinique TEP/TDM, par exemple nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hongrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torche à fluorescence, par exemple NightSea Torche à fluorescence DFP-1</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Équipée de filtres d’émission GFP et RFP et de lunettes filtrantes NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Chambre d’induction d’anesthésie pour rongeurs</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>Avec vannes à trois voies (x2), connecteur de montage sur tube pour l’entrée, tube en PVC pour l’entrée de gaz (2 m) et tube de balayage de 22 mm (2 m)</td></tr><tr><td>Système d’anesthésie des rongeurs</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>Y compris un masque facial pour animaux de taille appropriée pour l’animal d’intérêt et un vaporisateur d’isolflurane</td></tr><tr><td>Solution saline physiologique stérile</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BO0334B</td><td></td></tr><tr><td>seringues 0,3 mL U-100 insuline</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &times ; 1/2'' - 0.33 &times ; 12 mm, pour injection intraveineuse de radiotraceur</td></tr><tr><td>Veterinary Scavenger</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>Mécanisme de pesage de filtre VetScav - 240 V avec compensation automatique de la température et système LED</td></tr><tr><td>5) In vivo data analysis.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Monte Carlo basé sur un algorithme itératif 3D complet</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hongrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>6) Ex vivo analyses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- Méthylbutane&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D</td><td>Pré-refroidi sur azote liquide pour congeler les tissus inclus dans l’OCT</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures 22& fois ; </td> Cryostat <td>VWR International</td><td>SMITMCQ211022X50</td><td></td>de 50 mm</tr><tr><td>, par exemple Cryostat MNT</td><td>SLEE Machine d’enrobage</td><td>d’histologie modulaire en deux parties équipée d’un module d’enrobage, d’un compartiment de stockage de tissus et d’une plaque froide</td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson/Stratech 111-175-144 Utilisé à 1:500 (2 &micro ;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>Lames de microtome, p.ex. Feather S35&nbsp ;</td>Microscope à fluorescence <td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(grand champ ou confocal), par exemple Nikon Eclipse Ti-E Microscope à fluorescence inversée</td><td>Nikon</td><td></td><td>équipé de 10&times ;, 20&times ; (air) et idéalement 40& fois ; objectifs (à huile) et lasers/filtres ou cubes de filtre, respectivement, qui conviennent pour Hoechst 33342, GFP et Cy5</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, par exemple 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertechnetate fenêtre d’énergie 110-155 keV, 18F fenêtre d’énergie 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de fluorescence pour microscope de dissection, par exemple NightSea Adaptateur</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Équipé de filtres d’émission GFP et RFP</td></tr><tr><td>Composé O.C.T.</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Stylo à cire, p.ex. PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Stylo à cire pour dessiner autour de la section du tissu afin de réduire les volumes de solution de coloration/lavage nécessaires Solution de</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde 4 % (p/v) dans PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Anti-souris polyclonale utilisé 1:50 (20 &micro ; g/mL) pour l’immunofluorescence des tissus</td></tr><tr><td>Lames de microscope, par exemple Superfrost</td><td>lames VWR, Lutterworth, Royaume-Uni</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>solution saline tamponnée au Tris (TBS),</td> <td>disponibles auprès de différents fournisseurs.</td><td></td><td>Solution saline tamponnée au tris ; 150 mM de NaCl, 25 mM de Tris/HCl à pH 7,4</td></tr></tbody></table>

gène rapporteur de radionucléide-fluorescence imaging pour suivre la progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Métastase est responsable de la plupart des décès de cancer. Malgré des recherches approfondies, l’interprétation mécaniste des processus complexes qui régissent les métastases demeure incomplète. In vivo modèles sont primordiaux pour la recherche de métastases, mais nécessitent de raffinement. Métastase spontanée de suivi non invasif en vivo imagerie est maintenant possible, mais il reste difficile car elle nécessite une observation longue et haute sensibilité. Nous décrivons une longitudinale combiné radionucléide et fluorescence confiné en vivo imagerie approche pour le suivi de la progression tumorale et les métastases spontanées. Cette méthodologie de gène de journaliste emploie le symporteur de l’iodure de sodium (NIS) fusionné à une protéine fluorescente (FP). Cellules cancéreuses sont machinés pour stablement express NIS-FP, suivie par la sélection basée sur le tri cellulaire activés par fluorescence. Modèles correspondants de tumeur sont établis chez les souris. NIS-FP exprimant des cellules cancéreuses sont suivies non invasive en vivo au niveau du corps entier par tomographie par émission de positrons (TEP) à l’aide de la SNI traceurs radioactifs [18F] BF4–. Animal de compagnie est actuellement le plus sensible en vivo disponible à l’échelle de cette technologie d’imagerie et permet une quantification fiable et absolue. Les méthodes actuelles s’appuient sur des cohortes d’animaux qui sont euthanasiés pour évaluation de métastases à différents points dans le temps ou s’appuient sur l’imagerie 2D à peine quantifiable. Les avantages de la méthode décrite sont : PET traceur production, (iii) une réduction significative en nombre d’animaux requis grâce à des options d’imagerie répétition, hautement sensibles non invasif en vivo 3D TEP et la quantification, (ii) automatisée (iv). l’acquisition de données appariées de ses sessions ultérieures d’imagerie offrant le mieux les données statistiques et (v) l’option intrinsèque ex vivo confirmation des cellules cancéreuses dans les tissus par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux. Dans ce protocole, nous décrire toutes les étapes requises pour systématique NIS-FP-offerte non invasif en vivo cancer cellule suivi à l’aide de la TEP/CT et ex vivo confirmation en vivo desrésultats. Ce protocole a applications au-delà de recherche sur le cancer, chaque fois qu’in vivo de localisation, d’expansion et de surveillance de longue date d’une population de cellules est intéressant.

Les auteurs décrivent un protocole précliniques in vivo suivi des métastases cancéreuses. Il est issu d’un reporter de radionucléide-fluorescence combinant le sodium iodure symport, détecté par non invasive [18F] tétrafluoroborate-PET et une protéine fluorescente simplifiée ex vivo de confirmation. La méthode est applicable pour précliniques in vivo la cellule de suivi au-delà de biologie tumorale.

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

L’objectif global de ce protocole est de suivre la croissance tumorale et les métastases chez les rongeurs vivants via l’imagerie. Un rapporteur de fusion par radionucléide par fluorescence permet une détection in vivo non invasive par tomographie par émission de positrons avec le fluorophore aidant à la confirmation ex vivo des résultats. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés chaque fois que des cellules doivent être suivies chez des animaux vivants sur une période prolongée.Il peut contribuer à la compréhension des métastases à distance et de l’impact des traitements sur la progression tumorale. La technique décrite est le suivi des cellules cancéreuses par imagerie in vivo très sensible et non invasive avec un traceur PET produit par synthèse automatisée. Il offre une réduction significative de l’utilisation des animaux par rapport à la méthodologie conventionnelle.Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent se sentir dépassées par sa complexité. En particulier, la synthèse automatisée du radiotraceur TEP simplifie considérablement ce processus. Nous pensons que la démonstration visuelle de cette méthode démontre ces vues des étapes critiques associées à l’imagerie.Les implications de cette technique s’étendent aux essais précliniques de nouvelles thérapies qui peuvent également être suivies en même temps que les cellules cancéreuses. Cette méthode peut donner un aperçu de la biologie du cancer et du développement de traitements. Chaque fois que la localisation, la relocalisation, l’expansion et le suivi à long terme d’une certaine population in vivo sont intéressants.Pour commencer, utilisez des plasmides de gènes rapporteurs, générez des particules de lentivirus, transduisez des cellules et caractérisez-les. Analysez ensuite la fonction du gène rapporteur par absorption du radiotraceur dans les lignées cellulaires exprimant le NISFP. Ensemencez les cellules purifiées et le milieu de croissance dans des plaques à six puits, en veillant à ce que tous les échantillons soient préparés en trois exemplaires.Le lendemain matin, lavez les cellules avec un milieu de croissance sérique libre et incubez les plaques avec 50 kilo becquerels de tétrafluoroborate F18 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, récupérez le surnageant et transférez 100 microlitres dans un tube de collecte pré-étiqueté. Jetez le surnageant restant, puis lavez les cellules avec un millilitre de PVS glacé contenant du calcium et du magnésium à des niveaux physiologiques.Récupérez la solution de lavage et transférez 100 microlitres de la solution de lavage dans un tube de collecte pré-étiqueté. Répétez ensuite le processus de lavage une fois de plus. Ajoutez 500 microlitres de PVS contenant à la fois de la trypsine et de l’EDTA pour soulever les cellules.Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent, à l’aide d’un microscope pour vérifier le détachement. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de collecte étiqueté. Ensuite, centrifugez les échantillons de cellules à 250 G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius.À l’aide d’un compteur gamma automatisé, comptez les échantillons de chacun des quatre types d’échantillons et obtenez le pourcentage d’absorption à l’aide de l’équation un. Pour commencer la synthèse du tétrafluoroborate F18, installez la plate-forme de synthèse radio automatisée dans un capot chimique approprié et assurez-vous que le bon fichier XML est chargé sur l’ordinateur de contrôle. Pendant le fonctionnement du synthétiseur, le tétrafuoroborate F18 sera produit puis purifié sur une cartouche échangeuse d’anions.La cartouche échangeuse d’anions sera rincée à l’eau puis séchée à l’azote gazeux. Le produit final est tiré de la cartouche échangeuse d’anions avec un millilitre de chlorure de sodium à 0,9 % et transféré dans un flacon de collecte en verre via la conduite de sortie. Pour commencer l’imagerie, anesthésiez et préparez les souris selon le protocole écrit.Ensuite, utilisez une solution saline stérile à 0,9 % pour diluer la solution de tétrafluoroborate F18 à 5 mégabecquerels par 50 microlitres. À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille hypodermique, prélevez 100 microlitres de la solution de tétrafluoroborate F18. Mesurez la radioactivité dans la seringue et notez la valeur et l’heure de la mesure.Administrez 50 microlitres de la solution de tétrafluoroborate F18 dans la queue préchauffée par voie intraveineuse. Mesurez ensuite la radioactivité restante dans la seringue et notez la valeur et l’heure de la mesure. L’injection du radiotraceur dans la veine de la queue est essentielle.Nous l’effectuons sous anesthésie animale pour minimiser le risque d’injection erronée et de déversement de radiotraceur. L’animal reste sous anesthésie jusqu’au début de l’acquisition de l’image TEP. Précisément 45 minutes après l’injection du radiotraceur.Ensuite, réglez une minuterie pour compter à partir de 45 minutes et assurez-vous que la souris est positionnée sur la table en position sternale. Installez les instruments de surveillance chirurgicale appropriés et assurez-vous qu’ils fonctionnent correctement avant de passer à autre chose. Ensuite, réglez les peramètres pour l’imagerie CT et l’acquisition d’images TEP.Lorsque le compte à rebours indique 15 minutes, commencez l’acquisition d’images CT et lorsque la minuterie indique zéro minute, commencez l’acquisition d’images TEP. Mesurez d’abord la radioactivité de la souris euthanasiée entière et notez la valeur et le moment de la mesure. Ensuite, disséquez les souris et récoltez les tissus nécessaires.Mesurer la radioactivité de la carcasse restante avec et sans la queue. Notez ces valeurs et les temps de mesure. Ensuite, pesez tous les tissus prélevés individuellement et prenez des photos des organes cancéreux à la lumière du jour et à la lumière de fluorescence.Ensuite, intégrez les tissus dans l’OCT pour l’histologie en aval. Mesurez la radioactivité de tous les tissus prélevés, notez la valeur et notez l’heure de la mesure. Enfin, présentez les données sous forme de valeurs d’absorption standard ou VUS, comme décrit dans l’équation deux.Dans cette expérience, l’imagerie génétique de l’enregistreur de fluorescence des radionucléides a été utilisée pour suivre la progression tumorale dans un modèle de tumeur de rongeur. La microscopie confocale à fluorescence a démontré une localisation précise de la membrane plasmique des NISFP. La fonction et la spécificité du NISFP ont été quantifiées à l’aide de l’absorption du radiotraceur par NIS.Aucune différence significative n’a été observée entre les lignées cellulaires exprimant le 4T1NISGFP et le 4T1NISRFP avec des niveaux d’expression NIS similaires. Il est important de noter que le bloc de préchlorate a démontré dans toutes les lignées cellulaires que l’absorption du radiotraceur obtenue est due à l’expression spécifique de NISFP. L’imagerie TEP du corps entier d’animaux porteurs de tumeurs a révélé des informations sur la progression tumorale et la propagation métastatique.L’exemple montré ici montre de longues métastases étendues avec plusieurs nodules distincts dans le poumon. Les valeurs de dose injectée en pourcentage et les volumes occupés de métastases individuelles dans les poumons variaient. Cependant, les valeurs normalisées du pourcentage de dose injectée se situaient dans une fourchette similaire.La protéine fluorescente dans le gène rapporteur bimode a permis l’identification des tissus cancéreux sous la lumière fluorescente lors de la dissection animale. La biodistribution ultérieure ex vivo du radiotraceur a révélé des organes à forte absorption de radiotraceurs et donc des tissus exprimant des NIS. Alors que la thyroïde et les glandes salivaires, ainsi que l’estomac, expriment localement le NIS, tous les autres signaux positifs sont indicatifs de tissus cancéreux tels que la tumeur et les métastases.Le rapporteur de fluorescence de radionucléides permet également l’identification des cellules cancéreuses dans les coupes de tissus en aval. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du cancer de visualiser le processus de métastases spontanées et de tester comment les médicaments l’affectent. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de planifier soigneusement toutes les étapes à l’avance.Des lignées cellulaires doivent être établies, des modèles de tumeurs animales doivent être mis en place, et tous les réactifs et équipements d’imagerie doivent être disponibles le jour requis. Nous recommandons de petites expériences pilotes pour commencer. Une fois maîtrisées, la production de radiotraceurs et l’imagerie animale in vivo peuvent être réalisées sur six animaux en une journée de travail de huit heures si elles sont réalisées correctement.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’aborder un gène rapporteur grâce au suivi cellulaire in vivo à l’aide du rapporteur de radionucléides NIS combiné à une protéine fluorescente. Vous devriez également être en mesure de caractériser des lignées cellulaires exprimant un rapporteur NISFP pour produire le radiotraceur TEP requis pour l’imagerie in vivo et pour réaliser des expériences in vivo et ex vivo par distribution. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la fluorocytométrie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires.Par exemple, comment le profil cellulaire immunitaire d’une tumeur et ses métastases sont liés les uns aux autres ou changent au fil du temps. N’oubliez pas de vous assurer que les lignées cellulaires que vous produisez sont exemptes de microplasmides, car il a été signalé que ces derniers affectent les résultats. Il est important de ne pas oublier que travailler avec des radio-isotopes peut être extrêmement dangereux et que la protection de soi-même et des autres doit toujours être une priorité lors de l’exécution de cette procédure.

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Cette vidéo montre le protocole d’implantation orthotopique de cellules cancéreuses du pancréas exprimant des protéines fluorescentes vertes dans le pancréas de la souris. Le modèle murin orthotopique aide à étudier l’efficacité de nouvelles thérapies sur les tumeurs primaires et métastatiques.

Modèle de souris orthotopique fluorescente : implantation de cellules cancéreuses exprimant la GFP dans une souris pour évaluer la progression tumorale in vivo

Source:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institut des sciences biologiques, Université de Brasília, 2Département des processus psychologiques fondamentaux, Institut de psychologie, Université de BrasíliaCette vidéo montre la procédure de suivi de la progression tumorale in...

Imagerie bioluminescente de la progression d’une tumeur mammaire dans un modèle murin femelle

Dans cette vidéo, nous décrivons la tomographie moléculaire par fluorescence ou FMT pour l’imagerie in vivo de xénogreffes de glioblastome marquées par des protéines fluorescentes dans des modèles murins. Cette technique est utile pour élucider les effets des thérapies antitumorales au niveau moléculaire.

Tomographie moléculaire à fluorescence : une technique d’imagerie pour l’imagerie in vivo de xénogreffes de glioblastome marquées par des protéines fluorescentes dans un modèle murin

Nous décrivons un multi-angle de rotation du système optique d'imagerie (Maroi) pour la quantification in vivo d'un marqueur fluorescent émis par la saposine C (SAPC), dioléoylphosphatidylsérine (DOPS) nanovésicules. En utilisant des modèles murins de cancer et l'arthrite, nous montrons comment la Maroi analyse de la courbe du signal peut être utilisé pour la cartographie et la caractérisation biologique précis des processus pathologiques.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

Une procédure visant à implanter orthotopiquement des cellules cancéreuses du pancréas exprimant des protéines fluorescentes vertes (PANC-1 GFP) dans le pancréas de souris Balb-c Ola Hsd-Fox1nu afin d’évaluer la progression tumorale et les métastases est présentée ici.

Fluorescent modèle de souris orthotopique de cancer du pancréas

Nous décrivons une méthode pour l'étiquetage stable de xénogreffes dérivées de patients (PDXs) avec des particules lentiviraux exprimant la protéine et la luciférase reporters vert fluorescent. Cette méthode permet de suivre la croissance de PDXs au niveau du site primaire, ainsi que la détection des métastases spontanées et expérimentales en utilisant des systèmes d'imagerie in vivo.

Étiquetage des xénogreffes de patients dérivés cancer du sein avec traçables Reporters pour la croissance tumorale et la métastase études

Orthotopique injection intracrânienne des cellules tumorales a été utilisée dans la recherche sur le cancer pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique. Nous présentons ici la tomographie moléculaire de xénogreffes tumorales, à fluorescence qui fournit une imagerie intravitale en temps réel et la quantification d’une tumeur de masse dans des modèles précliniques de glioblastome.

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Ce protocole décrit l'établissement d'un modèle de souris tumeur-portant pour surveiller la progression de tumeur et l'angiogenèse en temps réel par la formation image double de bioluminescence.

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Ici, nous décrivons une méthode de surveillance non invasive impliquant l’expression de la luciférase et de la protéine fluorescente verte dans diverses lignées cellulaires de cancer du sein. Ce protocole fournit une technique pour surveiller la formation de tumeurs et la colonisation métastatique en temps réel chez la souris.

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Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

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Découvrez le suivi de progression tumorale par imagerie PET non invasive utilisant un gène rapporteur radionucléide-fluorescence chez les rongeurs. Cette méthode réduit l'utilisation animale et permet de visualiser les métastases en temps réel.

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