Rendu tridimensionnel et l’analyse d’immunomarquées, a précisé réseaux vasculaires villosités placentaires humains

L’objectif global de cette procédure est de générer des rendus tridimensionnels de fragments d’arbres villeux placentaires qui conviennent à l’analyse de leurs réseaux vasculaires contenus. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans notre domaine, telles que pourquoi un enfant peut avoir un retard de croissance ou quel stress et quelle gravité du stress a pu conduire à une naissance prématurée. Le principal avantage de notre procédure est que nous sommes maintenant en mesure d’immunomarquer le tissu lisséntaire clair, puis de visualiser leurs réseaux vasculaires et d’utiliser ces visualisations pour caractériser et analyser ces réseaux vasculaires.

Les implications de cette technique peuvent s’étendre à de nombreux diagnostics et thérapies, car la plupart des sciences de la vie reposent sur une caractérisation histologique bidimensionnelle. Mme Valerie Schwenk fera la démonstration de la procédure qui effectuera l’immunomarquage et l’élimination du tissu placentaire, puis M. Phillip Necaise fera la dissection du tissu placentaire et fera également l’élimination inverse du tissu. Pour se préparer à la dissection de l’arbre villeux, rincez d’abord le tissu placentaire formel et fixe avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Placez ensuite dans une boîte de Pétri sur la platine d’un microscope de dissection. Pour localiser l’arbre villeux, utilisez un scalpel et des pinces fines pour déchirer le tissu placentaire. Ensuite, disséquez des morceaux de l’arbre villeux d’environ cinq millimètres de long et transférez-les dans un microtube contenant un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate.

Remplacez la solution saline tamponnée au phosphate par une nouvelle et attendez 10 minutes en remuant de temps en temps. Ensuite, remplacez la solution saline tamponnée au phosphate par un tampon de perméabilisation pour perméabiliser le tissu et bloquer la liaison non spécifique des anticorps secondaires. Ensuite, incubez pendant 30 minutes.

Ensuite, remplacez le tampon de perméabilisation par une solution saline tamponnée au phosphate contenant deux pour cent de sérum de chèvre avec un anti monoclonal de souris anti CD31 et un anti CK7 de lapin. Laissez le mouchoir à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, éliminez les anticorps restants avec des lavages supplémentaires avec une solution saline tamponnée au phosphate avec deux pour cent de sérum de chèvre.

Ensuite, retirez la solution saline tamponnée au phosphate avec deux pour cent de sérum de chèvre et ajoutez le même tampon, complété par de l’immunoglobuline G anti-souris de chèvre couplée à un fluorophore vert et de l’immunoglobuline G anti-lapin de chèvre couplée à un fluorophore infrarouge. Incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Ensuite, lavez le mouchoir une fois avec du PBS-GS et conservez le mouchoir étiqueté dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’il disparaisse.

Lavez les échantillons trois fois avec du PBS à 10 minutes d’intervalle. Pour déshydrater les tissus, retirez la solution saline tamponnée au phosphate et ajoutez 50 % d’éthanol dans les tissus et incubez pendant 10 minutes. Après l’incubation, jeter puis laver trois fois avec de l’éthanol à 70 % à intervalles de 10 minutes, puis trois lavages avec de l’éthanol à 100 % à intervalles de 15 minutes.

Ensuite, à l’aide d’une pince à pointe fine, transférez le tissu dans un microtube rempli d’un millilitre de solution un pendant quatre heures. Après quatre heures, transférez le tissu dans un microtube rempli de la solution deux et incubez pendant quatre heures supplémentaires. Pour monter le tissu dans une chambre Sykes-Moore, utilisez une pince à pointe fine pour positionner une lamelle ronde de 25 millimètres sur la base de la chambre.

Encore une fois, utilisez la pince à pointe fine pour placer un joint en caoutchouc dans la base de la lamelle. Retirez le tissu immergé dans la solution deux et placez-le au centre de la lamelle. Ensuite, ajoutez une goutte de la solution deux, environ 40 microlitres, sur le tissu.

Ensuite, prenez un deuxième couvercle et placez-le sur le dessus du joint. Ensuite, compressez fermement la lamelle et le joint d’étanchéité en enfilant une bague de verrouillage dans le haut de la base. Ensuite, insérez une aiguille de calibre 25 à travers le joint dans l’orifice de la base.

Ensuite, remplissez une seringue de trois millilitres avec un virgule cinq millilitres de la solution deux. Ensuite, montez une aiguille de calibre 25 sur la seringue et insérez l’aiguille dans le port opposé à travers le joint. Ensuite, commencez à injecter la solution deux dans la chambre et vérifiez que l’air à l’intérieur de la chambre s’évacue par l’autre aiguille de calibre 25.

Lorsque la chambre est pleine, retirez l’aiguille et la seringue et placez le support de chambre Sykes-Moore sur la platine du microscope confocal. Utilisez un objectif 10X pour concentrer le tissu placé sur la chambre. Ensuite, définissez un point de référence pour la platine et déplacez la platine du microscope de haut en bas dans le plan focal pour identifier et régler le haut et le bas du tissu.

Réglez la taille du pas à deux virgule cinq micromètres et collectez un fichier d’image confocal contenant un ensemble d’images du tissu de haut en bas. Ensuite, transférez le tissu dans un microtube contenant plus de 20 fois le volume d’éthanol à 100 % pour inverser la clairance. Ensuite, toutes les heures d’intervalle, remplacez-les par 70 et ensuite par 50 % d’éthanol et enfin par une solution saline tamponnée au phosphate.

Conserver à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’encastrement. Ici, pour montrer le réseau vasculaire placentaire, des images microscopiques et microscopiques confocales d’un placenta humain ont été acquises. Ces images microscopiques du placenta montrent les villeux rayonnants qui ont pénétré le parenchyme placentaire.

Ces images microscopiques montrent la présence d’une portion distale de morceaux d’arbre villeux se terminant par l’amas de villosités. Ensuite, pour montrer la couche trophoblastique de la ville, la partie distale de l’arbre villeux a été immunomarquée. Sur l’image, la couche externe du trophoblaste est représentée en vert et les capillaires sont représentés en rouge.

Ensuite, pour vérifier le tissu placentaire avant et après l’élimination, des images confocales des tissus placentaires non éliminés et clairs ont été acquises. Les images montrent que pour un tissu non éliminé, l’immunofluorescence peut être capturée à une profondeur de 100 micromètres ou moins du tissu. Au contraire, pour le tissu placentaire clair, l’immunofluorescence peut être capturée à une profondeur beaucoup plus élevée.

De plus, pour comparer le tissu conventionnel avec les sections claires inversées, le tissu clair a été déshydraté dans un processus inverse avec de l’éthanol. La coloration immunohistochimique du tissu placentaire avec l’anti CK7 avant et après la clairance ne montre aucune altération significative de la morphologie tissulaire due à la clairance. L’animation montre que le tissu villeux immunocoloré est réparti sur toute la profondeur du volume tissulaire.

Une fois que vous êtes à l’aise pour faire la procédure, vous pouvez vous attendre à ce qu’elle prenne environ 18 heures, réparties sur trois jours. En essayant d’effectuer cette procédure, il est important de se rappeler qu’elle nécessite plusieurs ensembles de compétences différents. Il faut être capable de faire de la pathologie placentaire, de la microscopie confocale.

Vous devez être capable de générer des rendus tridimensionnels de l’imagerie, et vous devez être capable de connaître le traitement et l’analyse immunitaires. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’histologie traditionnelle, la page STS ou le maldi peuvent être effectuées. Avec son développement, cette technique ouvre la voie dans le domaine de la médecine fœto-maternelle, de la néonatalogie et de la biologie du trophoblaste pour explorer les causes profondes sous-jacentes à la pré-éclampsie, à la mauvaise croissance fœtale et à la détresse fœtale.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de nettoyer, de rendre et d’analyser le tissu villositaire placentaire. Merci beaucoup d’avoir regardé la vidéo et bonne chance pour vos expériences.