Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche translationnelle, telles que la possibilité d’étudier des biomarqueurs chez des patients de pays en développement. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de stocker des échantillons de sang et de sérum pendant au moins deux semaines sans congélation et de fournir du matériel de haute qualité pour les analyses en aval telles que la qPCR et l’ELISA. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de maladies telles que le cancer et les maladies infectieuses.

Cette méthode peut également être appliquée dans des domaines de diagnostic ou de recherche comme l’étude des maladies prénatales ou l’analyse de pathologies infectieuses telles que le VIH. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons commencé à comparer des biomarqueurs entre une série de cas caucasiens et une série de cas africains pour lesquels des échantillons congelés n’étaient pas disponibles. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de prélèvement sanguin sont difficiles à apprendre.

Dans cette procédure, trois millilitres d’un échantillon de sang sont prélevés dans un tube de trois millilitres avec 5,4 milligrammes d’EDTA. Inscrivez le numéro de code du patient dans le coin inférieur droit de la carte d’épargne. Remettez soigneusement le sang en suspension à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.

Ensuite, pipetez et transférez une tache de sang sur la carte d’économiseur. À l’aide d’une nouvelle pointe pour chaque aliquote de sang, répétez le spotting pour obtenir un total de trois à cinq taches de sang. Laissez sécher les taches de sang séché pendant la nuit à température ambiante avec le couvercle de la carte d’épargne ouvert en position horizontale sur une surface ouverte et non absorbante et en évitant la lumière directe du soleil.

Le lendemain, conservez la carte à température ambiante dans un sac en plastique avec déshydratant jusqu’à utilisation. L’ADN sera extrait de trois taches de sang séché de la carte de sauvegarde. Commencez par découper chacun des DBS de la carte et séparez-les de la carte.

Coupez le DBS séparé en petits morceaux d’environ un millimètre de diamètre. Placez les petits morceaux d’un DBS dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Pour digérer les échantillons, ajoutez dans le tube 180 microlitres de tampon de lyse provenant d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce, puis ajoutez 20 microlitres de protéinase K.Mix par vortexing.

Placez le tube dans un thermo-incubateur et incubez en secouant à 56 degrés Celsius pendant 60 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez brièvement le tube pour retirer les gouttes du couvercle. Commencez le lavage en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse deux et en tourbillonnant pendant 10 secondes.

Placez le tube dans un thermo-mixeur et incubez à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez la colonne d’élusion dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et jetez l’ancien. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage et centrifugez à 6000 fois la gravité pendant une minute.

Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et jetez l’ancien. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage deux et centrifugez à 6000 fois la gravité pendant une minute. Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et jetez l’ancien.

Centrifuger à 20 000 fois la gravité pendant trois minutes pour sécher la membrane. Pour éluer l’ADN, placez la colonne dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre et jetez le tube de prélèvement. Placez 50 microlitres d’eau distillée au centre de la membrane et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.

Centrifugez le tube à 20 000 fois la gravité pendant une minute. Récupérez l’élué et placez-le à nouveau au centre de la membrane. Centrifugez à nouveau le tube à 20 000 fois la gravité pendant une minute.

Jetez la membrane. Après avoir mesuré la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre, stockez l’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation. Pour cette procédure, sept millilitres d’échantillon de sang périphérique sont d’abord prélevés dans un tube de sept millilitres sans EDTA.

Laissez l’échantillon de sang coaguler à température ambiante pendant 30 minutes. Inscrivez le numéro de code du patient dans le coin inférieur droit de la carte d’épargne. Centrifugez l’échantillon de sang à 1100 fois la gravité à température ambiante pendant 15 minutes.

Retirez le surnageant du tube et transférez-le dans un nouveau tube de 15 millilitres. Remettez soigneusement le sang en suspension à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Pipetez et transférez une tache de sérum sur la carte d’économiseur.

Répétez le spotting pour avoir un total de trois à cinq taches de sang. Laissez sécher les taches sérogènes séchées pendant la nuit à température ambiante avec le couvercle de la carte économiseur ouvert. Le lendemain, conservez la carte à température ambiante dans un sac en plastique avec déshydratant jusqu’à utilisation.

Si la conservation dure plus de 14 jours, conservez-la à moins 20 degrés Celsius. Préparez-vous à l’essai ELISA en décongelant le SSD de chaque échantillon si nécessaire. Pour éluer la protéine du DSS, coupez un DSS en petits morceaux d’environ un millimètre de diamètre et mettez les morceaux dans un tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez quatre microlitres de PBS. Agitez les échantillons à basse vitesse à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utiliser une dilution appropriée de l’élué protéique comme échantillon de sérum pour l’analyse des protéines sécrétées ou des facteurs de croissance à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.

Dans ce protocole, les échantillons de sang et de sérum étaient stockés sous forme de taches séchées sur du papier filtre à température ambiante. Une carte représentative de l’économiseur de protéines est montrée avant et après le prélèvement sanguin. Afin de confirmer que le stockage sur du papier filtre et la procédure d’élution du sang n’interfèrent pas avec la qualité de l’échantillon, des tests ELISA pour les niveaux de protéine de liaison à la vitamine D, ou DBP, ont été effectués sur huit échantillons de sérum prélevés dans un tube de deux millilitres et stockés immédiatement à moins 80 degrés Celsius ou collectés sous forme de taches sériques séchées.

Le coefficient de variation, ou CV, entre les échantillons appariés variait de 2 % à 24 % et le CV moyen était de 9,6 %. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes si elle est correctement exécutée. À la suite de cette procédure, des méthodes en aval de biologie moléculaire ou d’analyse des protéines peuvent être effectuées. Après son développement, cette technique permet à la recherche dans le domaine de la recherche translationnelle et de l’analyse des biomarqueurs de collaborer avec des instituts du monde entier qui ne disposent pas de l’équipement de laboratoire nécessaire pour stocker des échantillons biologiques dans des conditions standard.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de stocker correctement des échantillons de sang dans du sang séché et des taches sériques. N’oubliez pas que travailler avec du sang et des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.