Name: Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez la conservation du sang et du sérum sur papier filtre pour l'analyse de biomarqueurs du cancer sans congélation. Cette méthode permet de stocker des échantillons pendant au moins deux semaines à température ambiante.

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Nous tenons à remercier Gráinne Tierney pour aide à la rédaction.

Sérum et le sang périphérique ont été recueillies et stockées de donneurs sains et de patients qui ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique local conformément aux normes éthiques fixés dans la déclaration d’Helsinki de 1964.
1. sang entreposage à DBS
<ol><li>
Prélèvement d’échantillons de sang
	<ol>
<li>Collecter 3 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube de 3 mL avec 5,4 mg d’acide tétraacétique (EDTA). NOTE : Stocker le sang périphérique comme DBS dès que possible et dans les 8 h.</li>
		<li>Écrire le numéro de code du patient sur le coin inférieur droit de la carte de la veille.</li>
		<li>Soigneusement Resuspendre le sang avec une pipette de 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sang sur DBS
	<ol>
<li>Pipette et une tache de sang (50 µL) sur la carte de la veille (Table des matières), avec une pointe de 50 à 200 µL de transfert.</li>
		<li>Répétez l’étape 1.2.1. pour avoir un total de 3 à 5 gouttes de sang. Jeter la vieille pointe et prendre un nouveau pour chaque sang aliquote.</li>
		<li>Laissez la DBS sécher jusqu’au lendemain à la température ambiante à l’horizontale sur une surface non absorbante ouverte, en évitant les rayons directs du soleil. Laissez le couvercle de la carte de veille ouvert pour faciliter le séchage du sang. Remarque : Les particules dans l’air ou de poussières au cours de cette étape de séchage n’affecte pas les applications en aval.</li>
		<li>Conserver la carte à la température ambiante dans un sac plastique avec déshydratant jusqu'à l’utilisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraction de l’ADN à partir de DBS selon la feuille de données ADN Extraction Kit (Section pour les taches de sang séché)
<ol><li>
Préparation des échantillons
	<ol>
<li>Utilisez 3 gouttes de sang séché de la carte. Couper chacune des taches de sang séché de la carte et les séparer de la carte avec des pincettes. Couper les taches de sang séché séparés en petits morceaux (diamètre d’environ 1 mm).</li>
		<li>Placer les petits morceaux dans un tube à centrifuger 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestion de l’échantillon
	<ol>
<li>Ajouter 180 µL de tampon de lyse 1 fourni dans le kit (Table des matières) dans le tube. Ajouter 20 µL de protéinase K. Ne mélangez pas le tampon de lyse 1 avec la protéinase k avant pipettant également, dans le tube de 1,5 mL de sang repéré la carte. Mélanger au vortex.</li>
		<li>Placer le tube dans un thermoincubator et laisser incuber à 56 ° C pendant 60 min. Si le thermoincubator n’est pas équipé d’un agitateur, vortex l’échantillon toutes les 10-15 min pendant au moins 10 s, en prenant soin de ne pas pour laisser la température de l’échantillon à diminuer. Brièvement centrifuger les tubes pour retirer le couvercle des gouttes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pas de lavage
	<ol>
<li>Ajouter 200 µL de tampon de lyse 2 (Table des matières) et vortexer pendant 10 s.</li>
		<li>Placer les tubes dans un thermomixer ou incubateur orbital chauffée et incuber à 70 ° C pendant 10 min. Si le thermoincubator n’est pas équipé d’un agitateur, vortex les échantillons une fois pendant au moins 10 s, en prenant soin de ne pas pour laisser la température des échantillons à diminuer.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.3.1. Transférer les 400 µL de lysat du tube 1,5 mL à colonne élution (Table des matières). Centrifuger la colonne à 6 000 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Placer la colonne élution dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et jeter le vieux un.</li>
		<li>Ajouter 500 µL de tampon de lavage 1 (Table des matières) et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et jeter le vieux un.</li>
		<li>Ajouter 500 µL de tampon de lavage 2 (Table des matières) et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et jeter le vieux un.</li>
		<li>Centrifuger à 20 000 x g pendant 3 minutes sécher la membrane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Étape d’élution
	<ol>
<li>Placer la colonne dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL et jeter le tube de prélèvement.</li>
		<li>Place 50 µL d’eau distillée sur le centre de la membrane. Incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 20 000 x g pendant 1 min. recueillir l’éluat et placer à nouveau sur le centre de la membrane.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 20 000 x g pendant 1 min. jetez la membrane.</li>
		<li>Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.</li>
		<li>ADN de magasin à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. NOTE : ADN extrait de DBS permet d’effectuer plusieurs analyses comme une évaluation SNP par séquençage de PCR en temps réel ou ADN Sanger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sérum stockage pour DSS
<ol><li>
Prélèvement d’échantillons de sang
	<ol>
<li>Recueillir 7 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube de 7 mL sans EDTA. Laisser l’échantillon de sang à coaguler pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Écrire le numéro de code du patient sur le coin inférieur droit de la carte de la veille.</li>
		<li>Centrifuger l’échantillon de sang à 980 x g pendant 15 min à température ambiante. NOTE : Stocker sérum comme DSS dès que possible et dans les 8 h.</li>
		<li>Retirez délicatement le surnageant du tube et transférez-le dans un nouveau tube de 15 mL. Soigneusement Resuspendre le sang avec une pipette de 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sérum dans DSS
	<ol>
<li>Pipette et transférer un spot de sérum (50 µL) sur la carte de la veille. Répétez cette étape pour un total de 3 à 5 gouttes de sang. Remarque : Veillez à distribuer exactement 50 µL de sérum dans chaque tache. Sérum ne devrait pas aller au-delà de la ligne en pointillé de la carte.</li>
		<li>Laissez le DSS sécher jusqu’au lendemain à la température ambiante. Laissez le couvercle de la carte de veille ouvert pour faciliter le séchage du sang.</li>
		<li>Conserver la carte à la température ambiante dans un sac plastique avec déshydratant jusqu'à l’utilisation. Si le stockage est plu de 14 jours, stocker la carte à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse ELISA à partir de DSS
<ol><li>
Éluer les protéines de DSS.
	<ol>
<li>Si nécessaire, décongeler un SSD pour chaque échantillon. Couper DSS en petits morceaux (environ 1 mm de diamètre). Mettez les morceaux dans un tube de 1,5 mL avec 400 µL de PBS.</li>
		<li>Agiter les échantillons durant la nuit à 4 ° C. NOTE : Secouer à faible intensité. PBS ne devraient pas mouiller le couvercle du tube pendant la secousse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser l’éluat de protéine comme un échantillon de sérum pour l’analyse de facteur de croissance/protéine sécrétée selon les instructions du kit ELISA, après des dilutions appropriées. Remarque : Cette procédure fonctionne bien pour la détection de DBP9. Pour les autres tests ELISA, une étape d’optimisation peut-être être nécessaires.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Le présent protocole examine le potentiel pour le stockage de sérum et sang sur un papier filtre lorsque les laboratoires n’ont pas le personnel ou les infrastructures nécessaires pour la manipulation correcte des échantillons de sang. En particulier, le sang ou le sérum recueillis dans des tubes standards ou par piqûre doigt peut être stockée à l’aide de cette méthode et il n’y a pas besoin de congeler les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C immédiatement après le prélèvement de sang. DBS/DSS peut rester à température amb...

L’objectif principal de la recherche sur les biomarqueurs du cancer est l’identification de nouveaux paramètres biologiques qui peut être utilisé pour le diagnostic, pour prédire pronostic patient et pour déterminer si un patient va réagir à un traitement spécifique. Ce domaine de recherche est fondamental pour la découverte de traitements novateurs contre le cancer et joue un rôle clé dans le traitement sur mesure.
Les procédures effectuées au cours de chaque étape de l’identification de biomarqueurs et de validation doivent être fiables et reproductibles. Des pierres angulaires du succès de la recherche translationnelle sont le stockage correct des échantillons biologiques comme le sang et le sérum. Il s’agit de la première étape vers l’obtention de matériel biologique de qualité qui peut être utilisé pour effectuer des expériences de biologie moléculaire ou analyses de protéines.
Études multicentriques sont souvent nécessaires pour recruter suffisamment patients pour obtenir des données fiables. Pas tous les instituts sont en mesure de conserver les échantillons à-80 ° C ou à envoyer des échantillons d’autres centres internationaux en glace sèche. L’utilisation de papier filtre pour la collecte de sang est une méthode simple pour le stockage de sérum et sang et ne nécessite pas le gel immédiat des échantillons1,2. Une goutte de sang ou de sérum peut être repérée sur le papier, laissé sécher pendant la nuit et puis stocké pendant jusqu'à 14 jours à température ambiante1,2. Cela donne des chercheurs de temps pour envoyer les échantillons d’autres laboratoires. L’utilisation de sang séché taches (DBS) et taches séchées de sérum (DSS) pourraient ainsi simplifier la collaboration entre les instituts dans les pays développés et en développement.
Compte tenu de sa facilité d’utilisation, l’échantillonnage DBS est largement utilisé dans plusieurs types d’analyses pour des analyses sérologiques ou génétiques en aval. Par exemple, dans le passé, la DBS étaient fréquemment utilisés pour le VIH dans les pays en développement1,2,3,4,5. Un autre avantage de cette méthode de stockage est peuvent percevoir des échantillons de sang du doigt-pique, ce qui permet son utilisation pour le dépistage des essais 6,7,8. Exemple simple de manutention et de transport sont a d’autres avantages de DBS, surtout pour les échantillons prélevés dans les sites distants où il n’y a aucun équipement de laboratoire. Dans une publication précédente, nous avons utilisé DBS et DSS pour tester la vitamine D et vitamine D protéine de liaison (DBP) dans une série de patients caucasiens et africaine9. Nos collègues africains n’étaient pas en mesure d’obtenir de la glace sèche. Pour comparer les marqueurs biologiques pour comprendre les différences dans la voie de la vitamine D entre les deux populations ethniques, nous avons encore amélioré la procédure en utilisant des échantillons appariés, stockés dans des conditions normales et sur papier filtre. Après avoir optimisé la procédure DBS/DSS, nous avons pu analyser DBP et vitamine D dans le sérum de patients dans les deux cohortes. Nous avons également évalué un certain nombre de polymorphismes de nucléotides simples (SNP) après extraction de l’ADN du sang pour les personnes de race blanche et de DBS pour africains9. Le présent protocole permet des échantillons de sang de haute qualité doivent être conservés à température ambiante sans affecter les différents types d’analyses en aval allant de la biologie moléculaire aux tests ELISA. Il est recommandé pour une utilisation gérer les matières biologiques dans des études multicentriques ou pour les centres qui n’ont pas d’installations pour des conditions de stockage standard. Le protocole suivant représente l’aboutissement de ces procédures optimisées.

<table><tbody><tr><td>Whatman protein saver cards 903 Carte d’économie de protéines, 100/pk&lrm ;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Utile pour stocker les échantillons à température ambiante pour les analyses en aval</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques Falcon, 5 mL</td><td>Cellule souche</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &micro ; L tips</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Microkit d’ADN QIAamp</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Il s’agit d’un kit d’extraction d’ADN conçu pour isoler de petites quantités d’ADN. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon ATL (inclus dans le microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Ceci est signalé comme Tampon de lyse 1 dans le texte</td></tr><tr><td>Tampon AL (inclus dans le microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Ceci est signalé comme Tampon de lyse 2 dans le texte</td></tr><tr><td>QIAamp mini élu colonne</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Ceci est signalé comme colonne dans le texte</td></tr><tr><td>AW1&nbsp ; (inclus dans le microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Ceci est signalé comme Tampon de lavage 1 DANS LE TEXTE</td></tr><tr><td>AW2&nbsp ; (inclus dans le microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Ceci est signalé comme Wash Buffer 2 dans le texte</td></tr><tr><td>Vitamine D humaine BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du cancer

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Qualité d’échantillon de sang est essentielle pour assurer des analyses précises en aval comme la PCR en temps réel ou de ELISA. Un stockage correct des matériaux biologiques est le point de départ pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Tous les échantillons doivent être traités de la même manière de collecte de sang au stockage. Selon les analyses à effectuer, le sang et les échantillons de sérum doivent être conservées à-20 ° C ou à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Des échantillons de sérum sanguin/devraient également être aliquotés pour éviter les multiples de gel-dégel. Une autre question importante est les conditions de l’échantillon lors de l’expédition d’un laboratoire à l’autre. Si la glace sèche n’est pas disponible ou l’expédition prend plue que quelques jours, autres approches sont nécessaires. Une option consiste à utiliser le papier filtre pour la collecte de sang. Ici, nous proposons une méthode pour le sang et le prélèvement d’échantillons de sérum qui profite du sang séché (DBS) et séché de sérum (DSS). Nous avons développé la procédure pour extraire l’ADN de DBS pour l’évaluation en aval de quelques simples de nucléotide simple (SNP) par PCR en temps réel. Nous avons également optimisé un test ELISA à partir de protéines éluées de DSS. Cette méthode peut être utilisée avec d’autres tests ELISA ou les procédures d’évaluation des protéines.

Nous avons profité des DBS et DSS procédures pour stocker le sang et le sérum à la température ambiante sans affecter la qualité de la matière biologique. La figure 1 montre un exemple de l’épargnant de carte de protéines sans sang et après prélèvement sanguin. Afin de confirmer que le stockage sur un papier filtre et la procédure pour éluer sang n’interfèrent pas avec la qualité de l’échantillon, nous avons effectué une comparaison avec les méthodes de stock...

Ce protocole décrit une méthode simple et utile pour stocker le sang périphérique et le sérum/plasma pour des analyses en aval comme single nucleotide polymorphisme (SNP) évaluation et analyse d’ELISA.

Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche translationnelle, telles que la possibilité d’étudier des biomarqueurs chez des patients de pays en développement. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de stocker des échantillons de sang et de sérum pendant au moins deux semaines sans congélation et de fournir du matériel de haute qualité pour les analyses en aval telles que la qPCR et l’ELISA. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de maladies telles que le cancer et les maladies infectieuses.Cette méthode peut également être appliquée dans des domaines de diagnostic ou de recherche comme l’étude des maladies prénatales ou l’analyse de pathologies infectieuses telles que le VIH. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons commencé à comparer des biomarqueurs entre une série de cas caucasiens et une série de cas africains pour lesquels des échantillons congelés n’étaient pas disponibles. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de prélèvement sanguin sont difficiles à apprendre.Dans cette procédure, trois millilitres d’un échantillon de sang sont prélevés dans un tube de trois millilitres avec 5,4 milligrammes d’EDTA. Inscrivez le numéro de code du patient dans le coin inférieur droit de la carte d’épargne. Remettez soigneusement le sang en suspension à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.Ensuite, pipetez et transférez une tache de sang sur la carte d’économiseur. À l’aide d’une nouvelle pointe pour chaque aliquote de sang, répétez le spotting pour obtenir un total de trois à cinq taches de sang. Laissez sécher les taches de sang séché pendant la nuit à température ambiante avec le couvercle de la carte d’épargne ouvert en position horizontale sur une surface ouverte et non absorbante et en évitant la lumière directe du soleil.Le lendemain, conservez la carte à température ambiante dans un sac en plastique avec déshydratant jusqu’à utilisation. L’ADN sera extrait de trois taches de sang séché de la carte de sauvegarde. Commencez par découper chacun des DBS de la carte et séparez-les de la carte.Coupez le DBS séparé en petits morceaux d’environ un millimètre de diamètre. Placez les petits morceaux d’un DBS dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Pour digérer les échantillons, ajoutez dans le tube 180 microlitres de tampon de lyse provenant d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce, puis ajoutez 20 microlitres de protéinase K.Mix par vortexing.Placez le tube dans un thermo-incubateur et incubez en secouant à 56 degrés Celsius pendant 60 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez brièvement le tube pour retirer les gouttes du couvercle. Commencez le lavage en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse deux et en tourbillonnant pendant 10 secondes.Placez le tube dans un thermo-mixeur et incubez à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez la colonne d’élusion dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et jetez l’ancien. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage et centrifugez à 6000 fois la gravité pendant une minute.Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et jetez l’ancien. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage deux et centrifugez à 6000 fois la gravité pendant une minute. Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et jetez l’ancien.Centrifuger à 20 000 fois la gravité pendant trois minutes pour sécher la membrane. Pour éluer l’ADN, placez la colonne dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre et jetez le tube de prélèvement. Placez 50 microlitres d’eau distillée au centre de la membrane et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.Centrifugez le tube à 20 000 fois la gravité pendant une minute. Récupérez l’élué et placez-le à nouveau au centre de la membrane. Centrifugez à nouveau le tube à 20 000 fois la gravité pendant une minute.Jetez la membrane. Après avoir mesuré la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre, stockez l’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation. Pour cette procédure, sept millilitres d’échantillon de sang périphérique sont d’abord prélevés dans un tube de sept millilitres sans EDTA.Laissez l’échantillon de sang coaguler à température ambiante pendant 30 minutes. Inscrivez le numéro de code du patient dans le coin inférieur droit de la carte d’épargne. Centrifugez l’échantillon de sang à 1100 fois la gravité à température ambiante pendant 15 minutes.Retirez le surnageant du tube et transférez-le dans un nouveau tube de 15 millilitres. Remettez soigneusement le sang en suspension à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Pipetez et transférez une tache de sérum sur la carte d’économiseur.Répétez le spotting pour avoir un total de trois à cinq taches de sang. Laissez sécher les taches sérogènes séchées pendant la nuit à température ambiante avec le couvercle de la carte économiseur ouvert. Le lendemain, conservez la carte à température ambiante dans un sac en plastique avec déshydratant jusqu’à utilisation.Si la conservation dure plus de 14 jours, conservez-la à moins 20 degrés Celsius. Préparez-vous à l’essai ELISA en décongelant le SSD de chaque échantillon si nécessaire. Pour éluer la protéine du DSS, coupez un DSS en petits morceaux d’environ un millimètre de diamètre et mettez les morceaux dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, ajoutez quatre microlitres de PBS. Agitez les échantillons à basse vitesse à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utiliser une dilution appropriée de l’élué protéique comme échantillon de sérum pour l’analyse des protéines sécrétées ou des facteurs de croissance à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.Dans ce protocole, les échantillons de sang et de sérum étaient stockés sous forme de taches séchées sur du papier filtre à température ambiante. Une carte représentative de l’économiseur de protéines est montrée avant et après le prélèvement sanguin. Afin de confirmer que le stockage sur du papier filtre et la procédure d’élution du sang n’interfèrent pas avec la qualité de l’échantillon, des tests ELISA pour les niveaux de protéine de liaison à la vitamine D, ou DBP, ont été effectués sur huit échantillons de sérum prélevés dans un tube de deux millilitres et stockés immédiatement à moins 80 degrés Celsius ou collectés sous forme de taches sériques séchées.Le coefficient de variation, ou CV, entre les échantillons appariés variait de 2 % à 24 % et le CV moyen était de 9,6 %. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes si elle est correctement exécutée. À la suite de cette procédure, des méthodes en aval de biologie moléculaire ou d’analyse des protéines peuvent être effectuées. Après son développement, cette technique permet à la recherche dans le domaine de la recherche translationnelle et de l’analyse des biomarqueurs de collaborer avec des instituts du monde entier qui ne disposent pas de l’équipement de laboratoire nécessaire pour stocker des échantillons biologiques dans des conditions standard.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de stocker correctement des échantillons de sang dans du sang séché et des taches sériques. N’oubliez pas que travailler avec du sang et des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Recherche sur le cancer

Les biomarqueurs sont des indicateurs biologiques directement mesurées de la maladie ou de la santé. Dans la population et les sciences sociales, les biomarqueurs doivent être faciles à obtenir, le transport, et à analyser. Séché tache de sang (DBS) collection répond à ce besoin, peuvent être recueillies sur le terrain avec des taux de réponse élevés et analysé pour une variété de biomarqueurs.

Séché Blood Spot Collection de biomarqueurs de santé pour maximiser la participation à des études de la population

Nous décrivons ici un test de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) à haute performance pour quantifier l’immunosuppresseur tacrolimus dans des taches de sang séché à l’aide d’une simple étape manuelle de précipitation des protéines et d’une extraction en colonne en ligne.

Quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

La préparation et le traitement des taches de sang séché (DBS) pour leur analyse finale sont encore mal standardisées pour la plupart des applications diagnostiques. Pour remédier à cette lacune, un protocole étape par étape complète est suggéré et évalué par la suite en ce qui concerne son efficacité pour la détection des marqueurs des infections virales.

Taches de sang séché - préparer et traiter pour utilisation dans les immunoessais et Techniques moléculaires

Les tumeurs cutanées sont souvent éliminées suite à la chirurgie micrographique de Mohs. Un protocole est décrit ici qui permet au personnel de soutien clinique de traiter et de stocker efficacement les échantillons de tumeur cutanée ( p. Ex., Carcinome épidermoïde, carcinome basique et mélanome) pour des applications en laboratoire en aval sans interférer avec les opérations cliniques.

Création d&#39;un biorepository basé sur une clinique

Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.

Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Les biobanques sont des ressources cruciales pour la recherche biomédicale et l’unité Biobanque de médecine translationnelle et numérique de l’Institut européen d’oncologie est un modèle dans ce domaine. Nous fournissons ici une description détaillée des procédures opérationnelles normalisées des biobanques pour la gestion de différents types d’échantillons biologiques humains.

Biobanque de médecine translationnelle : Modes opératoires normalisés pour une gestion optimale des échantillons

La biopsie liquide a révolutionné notre approche des études translationnelles en oncologie, la collecte, la qualité et le stockage des échantillons étant des étapes cruciales pour son application clinique réussie. Nous décrivons ici un protocole standardisé et validé pour les applications d’ADN libre circulant en aval qui peut être appliqué dans la plupart des laboratoires de recherche translationnelle.

Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

Cet article décrit l’application d’équipements automatisés pour séparer et collecter facilement et efficacement des substances, telles que l’ADN acellulaire et les cellules tumorales circulantes, à partir du sang total.

Séparation et prélèvement automatiques de substances liées au cancer à partir d’échantillons cliniques

Un protocole est présenté pour la détermination de biomarqueurs de faible abondance à partir d’échantillons de sérum séché illustrés par le peptide de libération de progastrine biomarqueur (ProGRP). Les billes magnétiques enrobées d’anticorps sont utilisées pour le nettoyage sélectif et l’enrichissement d’un peptide ProGRP protéotypique. Le peptide capturé est ensuite analysé par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem.

Microéchantillonnage dans l’analyse protéique ciblée basée sur la spectrométrie de masse de protéines de faible abondance

Ce protocole décrit une méthode pour faciliter le prélèvement d’échantillons de prostatectomie radicale. L’objectif est de cartographier, caractériser et micro-macro disséquer des échantillons de tissus à partir des échantillons sur la base de critères anatomopathologiques avant de les stocker dans une biobanque.

Amélioration de la fiabilité des biobanques de tumeurs de la prostate grâce à une technique d’échantillonnage et une caractérisation histologique améliorées

Ce protocole standardise l’analyse SDS-PAGE pour le profilage personnalisé de la corona protéique sur les nanoparticules, permettant une détection reproductible, évolutive et à faible coût de signatures spécifiques au cancer. Conçu pour le diagnostic précoce de l’adénocarcinome canalaire pancréatique, il offre une alternative pratique et alignée sur le REASSURED aux méthodes protéomiques complexes, tant en milieu de recherche que clinique.

Flux de travail standardisé SDS-PAGE pour le profilage personnalisé de la corona protéique dans la détection précoce du cancer

Découvrez la conservation du sang et du sérum sur papier filtre pour l'analyse de biomarqueurs du cancer sans congélation. Cette méthode permet de stocker des échantillons pendant au moins deux semaines à température ambiante.

Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer (Vidéo) | JoVE Journal

Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer

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