Un dosage des terriers/Tunneling pour détection d’hypoxie chez les larves de Drosophila melanogaster

L’objectif global de ce test est d’identifier les larves de drosophile souffrant d’hypoxie tissulaire malgré des niveaux d’oxygène normaux. Chez la drosophile, il existe de nombreuses mutations qui produisent une croissance lente et médiocre des larves et une certaine lenteur des larves. Ce test identifie au sein de cette classe de larves celles qui souffrent d’hypoxie tissulaire.

En fin de compte, ce test aidera à identifier davantage de mutations qui produisent un manque d’oxygène dans les tissus par le biais de divers processus physiologiques. L’idée de ce test est née de l’observation que les larves dont les voies respiratoires ou la trachée étaient endommagées présentaient deux comportements étranges. Ces comportements anormaux sont l’incapacité à s’enfouir dans la nourriture au début de la vie des larves et l’incapacité à creuser des tunnels dans un substrat plus mou pendant la phase d’errance.

Mettre en place le contrôle et les croisements génétiques expérimentaux dans des boîtes de ponte comme décrit dans le protocole textuel. Gardez les mouches dans l’obscurité pendant au moins deux jours avant de commencer les collectes d’œufs chronométrées. Pour la collecte chronométrée des œufs, transférez les adultes dans de nouvelles plaques de gélose aux raisins décorées d’une nouvelle couche de pâte de levure tôt dans la journée et laissez les adultes pondre les œufs sur les plaques pendant quatre heures.

Après quatre heures, transférez les adultes dans des assiettes fraîches de gélose aux raisins. Ensuite, incubez les plaques de collecte de quatre heures pendant la nuit à 25 degrés Celsius. Le lendemain après-midi, la plupart des larves auront éclos.

Prévoyez d’en avoir au moins 50 pour chaque groupe expérimental. Pour une seule série d’essais, préparez au moins cinq plaques d’essai par groupe expérimental. Ajouter 16 grammes de gélose tue-mouches et 700 millilitres d’eau déminéralisée en chauffant.

Préparez un Nipagen de 17,5 millilitres dans de l’éthanol à 95 %. Chauffez la solution de gélose jusqu’à ce qu’elle soit presque complètement dissoute. Ajoutez ensuite la solution de Nipagen à la solution de gélose et faites chauffer jusqu’à ce que la gélose se dissolve complètement.

Refroidissez brièvement la solution de gélose, puis chargez des plaques de 10 centimètres avec 15 millilitres de solution de gélose. Une fois que l’agar se gélifie, placez les couvercles sur les assiettes et laissez-les sécher à température ambiante pendant quelques heures ou toute la nuit. La gélose séchée doit être ferme au toucher et résister à l’effritement lorsque des morceaux en sont coupés.

Une fois que l’agar a durci, utilisez une planche en liège de 1,5 centimètre pour faire un trou central dans le gel d’agar dans chaque plaque. Ensuite, remplissez soigneusement les trous avec de la pâte de levure fraîche. Pour transférer les larves sur la plaque de test, fabriquez un outil simple.

Pliez une courbe dans l’extrémité d’une microspatule en plastique et trempez l’extrémité dans de la pâte de levure pour la rendre adhésive aux larves. Maintenant, ramassez les larves du premier stade individuellement et placez-les sur la plaque de gélose près du monticule de nourriture. Pour chaque groupe expérimental, préparez au moins cinq assiettes, chacune avec 10 larves.

Pour assurer la reproductibilité entre les répétitions d’essai, il est essentiel que seulement 10 larves soient placées sur chaque plaque d’essai. Assurez-vous de vérifier attentivement la plaque de dosage pour déterminer qu’une seule larve est transférée chaque fois que vous libérez une larve avec la pointe de la microspatule. Une fois qu’une assiette est chargée, étiquetez-la, couvrez-la, puis placez-la dans l’obscurité avec le couvercle vers le haut à température ambiante.

Examinez chaque plaque tous les jours jusqu’à ce que toutes les larves soient mortes ou nymphosées. Voici des exemples de plaques pour une souche de type sauvage du deuxième au huitième jour de l’essai. Le deuxième jour, les larves sont enfouies dans la nourriture et il n’y a pas de creusement de tunnels.

Le creusement de tunnels commence le troisième jour et atteint un maximum entre le cinquième et le huitième jour, lorsque les larves cessent de se promener et se nymphosent dans leurs tunnels. Transférez soigneusement les pupes avec une aiguille de taquinerie pliée dans une assiette à raisin et, si vous le souhaitez, comptez le nombre de pupes enfermées. Prenez note de la formation de nymphes et évaluez les pupes pour détecter des anomalies.

Pour imager les tunnels à l’intérieur de la plaque de test, retirez et jetez d’abord soigneusement toute la levure du puits central de chaque plaque. Ensuite, inondez doucement chaque assiette avec de l’eau du robinet et utilisez un pinceau doux pour frotter soigneusement tous les débris qui ont été suivis sur la surface de la gélose. Certains morceaux de gélose peuvent s’effriter là où le creusement des tunnels est le plus intense.

Cela peut être corrigé plus tard. Continuez à remplacer l’eau plusieurs fois et brossez doucement les débris jusqu’à ce que la plaque soit complètement propre. Ensuite, rincez une dernière fois la plaque à l’eau déminéralisée, couvrez-la et laissez-la sécher à température ambiante pendant la nuit.

Il est important d’utiliser un léger écoulement d’eau et un léger coup de pinceau pour nettoyer les plaques de gélose afin de ne pas casser ou endommager des parties du gel de gélose. Le lendemain, préparez une image de fichier tiff de la plaque en utilisant un fond noir pour montrer les tunnels sous forme de lignes blanches brillantes. Les systèmes de documentation sur gel fonctionnent bien pour cette étape.

Ensuite, quantifiez l’effet tunnel dans l’image à l’aide de l’image J avec l’outil Oval, définissez le gel de gélose jusqu’au bord en plastique de la plaque de Pétri, mais sans l’inclure. Appliquez ensuite un seuil automatique pour produire une image inversée de la plaque afin que les tunnels apparaissent sous forme de lignes noires. Pour corriger les zones sombres qui ne contiennent pas de tunnels, utilisez les outils Sélecteur de couleurs et Pinceau pour blanchir ces zones.

Ensuite, dans le menu déroulant Analyser, sélectionnez Définir l’échelle et cliquez pour supprimer l’échelle. Accédez ensuite à la fenêtre Définir les mesures sous Analyser et cochez Zone et Limiter au seuil. Appuyez maintenant sur la touche Ctrl avec la touche M pour obtenir une mesure de la zone noire de l’image dans l’unité de pixels qui représente la zone tunnelisée.

Pour quantifier l’effet tunnel perdu par érosion en gélose autour du trou central, décochez la case Limiter au seuil. Utilisez l’outil Baguette pour définir le trou central et appuyez sur Ctrl plus M pour mesurer sa valeur en pixels. Soustrayez de cette valeur la valeur en pixels d’un trou de 1,5 centimètre de diamètre.

Ajoutez la différence à la valeur de pixel précédemment obtenue pour obtenir la valeur totale du pixel de tunneling. Pour les plaques dans lesquelles la gélose manquante s’étend au-delà de l’anneau central de creusement, une étape supplémentaire est nécessaire pour éviter que la quantification n’inclue des zones à l’extérieur de la région centrale. Utilisez les outils Sélecteur de couleurs et Pinceau pour ajouter une barre noire comme indiqué afin de limiter la zone quantifiée.

L’essai décrit a été utilisé pour étudier l’hypoxie potentielle chez les larves dont la fonction du gène n’est pas gonflable dans les trachaes. Le gène a été supprimé par l’ARNi via Gal4 UAS. Deux lignes Gal4 ont été utilisées.

Breathless Gal4, qui s’exprime à travers tout le développement dans l’ensemble du système trachéal. Ou cut(ue)Gal4, qui s’exprime fortement dans une petite section trachéale au cours de la vie larvaire. Les larves témoins contenaient l’une des lignées Gal4, mais aucun ARNi non gonflable.

Les larves avec cut(ue)Gal4 conduisant l’ARNi non gonflable étaient indiscernables des témoins tout au long du développement, tant en termes de croissance que de comportement. Cependant, une forte suppression de l’ARNi non gonflable dans les trachae avec blt-Gal4 a entraîné l’échec de l’enfouissement pendant la phase d’alimentation et a produit un taux de mortalité élevé. Ces larves ont également montré une absence totale de tunnels pendant la phase d’errance.

De plus, les larves expérimentales de Gal4, à bout de souffle, étaient plus petites, plus minces et plus lentes que les témoins et sont restées à l’état de larves longtemps après la nymphose de tous les autres groupes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester les larves de drosophile pour l’hypoxie tissulaire en surveillant dans quelle mesure elles s’enfouissent dans leurs monticules de nourriture ou creusent des tunnels dans un substrat mou. L’absence totale d’effet tunnel est un indicateur fort d’hypoxie tissulaire.