Écosystème des protocoles de Fabrication (EcoFAB) pour la Construction des écosystèmes de laboratoire destiné à étudier les Interactions plantes-microorganismes

L’objectif général de ce protocole est de définir des approches standardisées pour la construction d’écosystèmes végétaux modèles simplifiés, appelés EcoFABs, qui permettent des expériences de laboratoire contrôlées et répliquées pour étudier les interactions entre les plantes et les microbes qui peuvent être testées davantage sur le terrain. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les interactions entre les microbes des plantes dans des environnements contrôlés, ce qui nous permet d’obtenir des informations mécanistes détaillées sur les fonctions des microbiomes afin de nous permettre de les exploiter pour une agriculture durable. Nous avons contribué à la conception de ce premier Eco-FAB, qui utilise une variété de technologies d’impression 3D disponibles et à la stérilisation des chambres de croissance des plantes qui permettent à la fois des images haute résolution non gênantes et des analyses chimiques.

Le dispositif Eco-FAB développé ici est bien adapté à l’analyse des interactions plantes-microbes car il intègre l’analyse de la morphologie racinaire et l’imagerie par spectroscopie de masse. Suite à la construction des moules Eco-FAB, en utilisant l’impression 3D selon le protocole texte, dans un récipient jetable d’un litre, mélanger 40 millilitres de base en élastomère de siloxane avec différents volumes d’agent de durcissement, en fonction de l’expérience. Placez le récipient dans une chambre à vide pendant au moins 30 minutes pour éliminer les bulles d’air du mélange d’élastomère.

Ensuite, retirez le mélange et versez-le dans le moule en plastique imprimé en 3D assemblé. Afin de générer une couche PDMS uniforme, les bulles d’air doivent être soigneusement éliminées. Utilisez de l’air comprimé pour souffler tous les résidus d’air après avoir transféré le mélange dans le moule.

Conservez le moule sur un bloc chauffant à 85 degrés Celsius pendant quatre heures. Laissez le moule refroidir pendant cinq minutes. Ensuite, retirez doucement l’insert du moule et utilisez un couteau utilitaire pour séparer lentement le PDMS du cadre de coulée.

Appuyez sur la base du moule avec PDMS pour sortir du cadre de coulée. Ensuite, utilisez un couteau ou d’autres outils pour séparer délicatement la couche PDMS de la base du moule sur les bords et décollez-la lentement de la surface du moule. À l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 15, créez un canal d’entrée sur les couches PDMS en faisant des trous de 1,6 millimètre dans cette pièce.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper les bords des couches PDMS. Pour lier de manière permanente les couches PDMS aux lames de microscope, utilisez du méthanol pour rincer le côté de liaison de la couche PDMS sur une lame de microscope de 7,6 x cinq centimètres, puis séchez-les avec de l’air comprimé ou un pistolet à azote ultra-pur. Placez la lame de microscope et la couche PDMS dans un nettoyeur plasma avec leurs côtés de liaison vers le haut.

Fermez la chambre et la soupape de purge de gaz. Ensuite, allumez l’aspirateur et pompez dans la chambre pendant une minute. Allumez le générateur de plasma et réglez la fréquence radio, ou niveau RF, sur élevé pendant une minute.

Ensuite, éteignez à la fois la pompe à vide et l’alimentation plasma, et évacuez la chambre dans l’atmosphère. Retirez la lame de microscope et la couche PDMS de la chambre à plasma et appuyez rapidement sur les quatre bords de la couche PDMS sur la lame avec une pression uniforme. Assurez-vous que la région ovale centrale, qui est la chambre racine, ne touche pas la lame.

À l’aide d’eau ultra-pure, rincez les appareils Eco-FAB. Placez un appareil Eco-FAB dans un récipient Eco-FAB et ajoutez 70 % d’éthanol jusqu’à ce que l’appareil soit immergé. Ensuite, fermez le couvercle du récipient et secouez-le doucement pour mouiller toutes les surfaces à l’intérieur avec de l’éthanol, en vous assurant que la chambre de croissance des racines de l’appareil Eco-FAB est remplie d’éthanol, avec très peu ou pas de bulles d’air.

Après avoir incubé les appareils à température ambiante pendant 30 minutes, versez l’éthanol à 70 % et remplacez-le par de l’éthanol à 100 %. Ensuite, incubez les appareils pendant cinq minutes. Après l’incubation, égouttez l’éthanol et laissez l’Eco-FAB stérilisé dans une hotte à flux laminaire pendant 16 heures pour le sécher complètement.

Si possible, stérilisez le système en allumant la lumière UV dans la hotte pendant une heure. Pour effectuer la stérilisation et la germination des graines, faites tremper les graines dans de l’éthanol à 70 % pendant deux minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirez l’éthanol et utilisez de l’eau stérile pour rincer les graines trois fois.

Ensuite, faites tremper les graines dans une solution d’eau de Javel à 10 % pendant cinq minutes. Ensuite, retirez la solution d’eau de Javel et utilisez de l’eau stérile pour bien laver les graines trois fois. Après les lavages, ajoutez de l’eau stérile aux graines et incubez le tube à quatre degrés Celsius pendant sept jours.

Répartissez uniformément les graines sur 0,5 Murashige et Skoog, ou milieu MS, avec 0,6 % de vitagel. Et avec du ruban adhésif microporeux, scellez les plaques. Ensuite, faites pousser les plantes à une longueur de racine d’environ cinq millilitres.

Pour transférer les plantules dans les Eco-FAB, à l’aide d’une seringue ou d’une micropipette stérile et d’eau stérile, rincez trois fois la chambre racinaire d’un dispositif Eco-FAB, puis remplissez la chambre racinaire avec le milieu de croissance d’intérêt, tel que le milieu 0,5 MS. Maintenant, insérez soigneusement un seul plant dans le réservoir de plantes de l’appareil Eco-FAB. Il est important que les semis soient transférés avec soin de la plaque à l’Eco-FAB afin que les racines ne se cassent pas.

Ajoutez trois millilitres d’eau stérile dans le récipient, en évitant l’appareil Eco-FAB. Cela augmentera l’humidité et réduira l’évaporation du milieu de la chambre racinaire. Ensuite, fermez le récipient et utilisez du ruban adhésif microporeux pour sceller le couvercle.

Placez l’Eco-FAB dans un incubateur de plantes ou utilisez le système d’éclairage Eco-FAB dans un environnement à température contrôlée adapté à la croissance de la plante concernée. Ensuite, réglez la chambre à 24 degrés Celsius. Enfin, effectuez le profilage des métabolites et la spectrométrie de masse, conformément au protocole texte.

Ces figures montrent que Aaabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon et panicum virgatum âgés de sept jours poussent dans les Eco-FABs. La dicotylédone et la monocotylédone ont toutes deux été à la hauteur de leurs stades de reproduction dans l’Eco-FAB. Ces semis représentent un groupe de brachypodium distachyon âgés de 14 jours poussant dans un milieu hydroponique, ainsi que dans du sable et de la terre complétés par un milieu hydroponique et de l’eau, respectivement.

La couche de substrat mince et solide et les chambres de croissance des racines permettent à la lumière de pénétrer pour l’imagerie microscopique des systèmes racinaires. Ici, un semis de brachypodium distachyon a été transféré dans le dispositif Eco-FAB, et sa structure racinaire a été enregistrée par une caméra à l’intérieur d’un imageur de gel biorad. La quantification de la surface racinaire totale sur une période de trois semaines a montré une augmentation progressive au début, suivie d’une tendance de croissance linéaire jusqu’à la fin.

Dans cette figure, un Eco-FAB contenant les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes, pseudomonas simiae, WCS417 a été ajouté dans les systèmes racinaires des plantes à raison de 10 à 6 cellules par plante. Les microbes WCS147 ont colonisé la surface de l’ensemble des systèmes racinaires avec des microbes concentrés autour des extrémités des racines. Lors du rafraîchissement des milieux de culture et de la collecte des exsudats racinaires des Eco-FABs, il est important de ne pas oublier de traiter tout le travail dans une hotte stérile pour éviter toute contamination.

Les dispositifs Eco-FAB peuvent également être fabriqués à l’aide d’un joint physique réversible, soit à l’aide d’une pince imprimée en 3D, soit en modifiant la viscosité du PDMS. Cela permet l’utilisation de milieux de croissance solides et de l’imagerie spectroscopique de masse directe. Après le développement d’Eco-FAB, ce système permettra aux chercheurs du monde entier d’utiliser ces écosystèmes modèles de laboratoire pour étudier les interactions entre les microbes des plantes à l’aide de technologies de biologie des systèmes et d’imagerie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’un système Eco-FAB, ainsi que de ses vastes applications dans les études d’écosystèmes. Nous espérons que cette conception Eco-FAB permettra à d’autres scientifiques d’atteindre leurs objectifs scientifiques spécifiques. Plus important encore, nous espérons que d’autres scientifiques s’appuieront sur cette conception d’Eco-FAB et l’amélioreront, et la partageront avec d’autres scientifiques, afin qu’en tant que communauté, nous puissions construire ces écosystèmes de laboratoire pour nous permettre de mieux comprendre les interactions entre les plantes et les microbes.

N’oubliez pas que travailler avec des microbes et des objets tranchants peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de cette procédure.