Name: Écosystème des protocoles de Fabrication (EcoFAB) pour la Construction des écosystèmes de laboratoire destiné à étudier les Interactions plantes-microorganismes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Apprenez à construire des écosystèmes EcoFAB pour étudier les interactions plantes-microorganismes en laboratoire. Cette méthode utilise l'impression 3D et permet des analyses d'imagerie haute résolution.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche réalisé en laboratoire et développement (LDRD) du Lawrence Berkeley National Laboratory, soutenu par le Bureau de la Science, de l’US Department of Energy, sous le contrat no. DE-AC02-05CH11231 et le prix DE-SC0014079 de l’US Département de Energy Office of Science à l’Université de Berkeley. Travail à la fonderie moléculaire a été soutenu au titre US Département d’énergie contrat no DE-AC02-05CH11231. Nous remercions également Benjamin J. Cole au Lawrence Berkeley National Laboratory, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen et Suzanne M. Kosina pour leur aide.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les protocoles présentés ici pour l’utilisation de fabrication de l’écosystème pour créer Qu'ecofabs fournit des ressources communautaires pour la systématique des plantes dans des conditions très contrôlées en laboratoire des études de biologie. Avances dans l’impression 3D fournissent des technologies largement accessibles pour la construction et de manière itérative raffinage EcoFAB dessins. La chambre de racine, présentée ici s’avère bien adapté pour la microscopie par imagerie et maintien de la stérilité, permettant l’addition contrôlée de microbes pour étudier les interactions plantes-microorganismes. La plate-forme EcoFAB est compatible avec diverses espèces végétales. Il est important de reconnaître les effets physiologiques de plus en plus les plantes dans la chambre de racine étroite telle que des expériences supplémentaires devront avoir généraliser les conclusions aux plantes qui poussent dans des milieux naturels.
L’utilisation des chambres stériles et élèvent la lumière LED permet l’étude des effets des diverses conditions de lumière, y compris la longueur d’onde, intensité et durée, sur la croissance des plantes et des paramètres physiologiques associés en parallèle. Chambres de racine de liaison réversible permettent l’utilisation de substrats solides ainsi qu’à recueillir des échantillons solides pour les analyses biochimiques et génétiques dans l’espace. Les applications des substrats solides, tels que des sols, du sable et des perles de quartz, d’offrir la possibilité d’utiliser EcoFABs pour construire des écosystèmes de laboratoire plus écologiques pertinentes. Cependant, tous les systèmes présentés ici utilisation liquide saturé (cultures hydroponiques) qui ne sont pas un reflet exact de la plupart des sols et il faudra encore peaufiner ces dessins pour maintenir les poches d’air dans le sol tels qu’elles représentent mieux sols naturels.
L’utilisation de caméras simples et microscopes est décrite d’image système racinaire morphologie développement sur les deux en vrac aux niveaux cellulaires. Cette aptitude à l’imagerie de morphologie racine surveillance et quantification sera probablement utile pour comprendre les mécanismes de régulation de signaux physiologiques et moléculaires de plante déclenchées par adaptations génotypique plante à des conditions de croissance. Toutefois, une limitation pour étudier le développement racinaire physiologique est la position horizontale actuelle de l’appareil EcoFAB. En milieu naturel, la réponse gravitropique de racines conduit à un développement principalement vertical du système racinaire. Ainsi, le système horizontal présenté ici probablement diffère en certains facteurs du milieu naturel et la fabrication de systèmes EcoFAB avec placement vertical de la chambre de la racine est un objectif souhaitable pour les futures versions de EcoFAB. Bien que les dispositifs actuels de EcoFAB sont placées horizontalement, l’analyse des paramètres de morphologie de racine dans diverses conditions, ou en réponse aux microbes, est possible. Imagerie à haute résolution peut être appliqué pour saisir la dynamique de colonisation des racines des isolats unique ou des communautés, fournissant des informations sur quelle plante pièces sont colonisés dans diverses conditions suffisantes et déficientes en éléments nutritifs. Il est prévu que ces études fourniront des importantes nouvelles perspectives comment plante microbiomes sont assemblés, et comment ces dynamiques changent avec le temps, pour exemple que les racines se développent.
Dispositifs microfluidiques permettent d’imagerie de très jeunes plants, et généralement la quantité de métabolites collectées n’est pas suffisante pour l’analyse LCMS. Les systèmes axés sur les sols, tels que rhizotrons, permettent l’imagerie de la morphologie de la racine quand les deux plantes sont transformés par chimiluminescence construction (Glo-racine) ou avec des méthodes axées sur le NMR33,34. Les extractions de métabolite de ces systèmes demandent beaucoup de temps en raison du volume important d’échantillons. EcoFABs sont une combinaison des deux : la fabrication est similaire aux dispositifs microfluidiques. EcoFABs ont été conçus pour être simple et peu coûteux à reproduire, mais la taille de la chambre peut être ajustée pour faire pousser des plantes avec leur système racinaire petites ou grandes, jusqu'à des stades de reproduction. Des observations simultanées des changements de morphologie de racine et exsudation racinaire sont possibles. Le système est stérile, ce qui permet l’addition contrôlée de microbes spécifiques.
EcoFABs sont conçus pour permettre l’introduction contrôlée et échantillonnage des microbes et des métabolites. Spécifiquement, échantillons prélevés dans les chambres de croissance racinaire sont jugées suffisantes pour profiler le métabolite masse spectroscopique. L’intégration de l’imagerie de la spectrométrie de masse (p. ex.., NIMS technique présentée ici) propose une approche non destructifs d’étudier la distribution spatiale de métabolite des systèmes racinaires. Cette technique sera probablement utile dans un avenir stable isotope traçage expériences et localisation microbienne de cartographie aux métabolites spécifiques36. Alors que ce protocole a mis l’accent sur des isolats unique, la conception même certainement peut être utilisée que pour des collectivités plus complexes. Le volume des échantillons et la biomasse au sein de la EcoFABs sont probables plus que suffisant pour la poursuite de l’intégration avec les technologies de séquençage de l’ADN, qui sera important pour caractériser et surveiller la communauté microbienne structure et l’expression génique.
En conclusion, ce protocole détaille la fabrication des écosystèmes de laboratoire conçu pour l’étude des interactions plantes-microorganismes, en mettant l’accent sur des méthodes simples et accessibles qui peut facilement être implémentée et étendu par les chercheurs autour de la monde. Les efforts actuels visent à démontrer la reproductibilité entre les laboratoires et l’intégration d’un système de contrôle de température telle que chaque EcoFAB sera ont commandé indépendamment de lumière et température. Une progression supplémentaire du système sera l’intégration de l’échantillonnage automatique et le remplissage des chambres racine EcoFAB et de l’élaboration de protocoles reproductibles pour établir les microbiomes phytosanitaires pertinentes au sein de la EcoFABs.

L’application des microbes bénéfiques de plantes dans l’agriculture offre un grand potentiel d’augmenter l’alimentation durable et la production de biocarburants à fournir pour une population croissante1,2,3,4. Une quantité importante de travail confirment l’importance des plantes microbiomes dans l’absorption des éléments nutritifs végétaux, tolérance aux stress et résistance à la maladie5,6,7,8. Toutefois, il est difficile d’étudier ces mécanismes des interactions plantes-microorganismes dans les écosystèmes de champ en raison de la complexité et la reproducibilité associée et l’incapacité de contrôler avec précision la composition microbiome et génétique (p. ex.., en utilisant les mutants microbienne)4,9,10.
Une stratégie consiste à construire des écosystèmes modèle simplifié pour permettre contrôlée, des expériences de laboratoire répliqué étudie les interactions plantes-microorganismes pour générer des idées pouvant être testé plus loin dans la zone10,11, 12. Ce concept s’appuie sur des approches traditionnelles à l’aide de plantes cultivées dans des pots remplis de terre ou sur plaques de gélose dans les serres ou pépinières d’entreprises13. Même si elles resteront probablement le plus largement utilisé des approches, ils n’ont pas la capacité de précisément contrôler et manipuler des milieux de croissance végétale. À ces fins, rhizoboxes et rhizotrons représentent une amélioration majeure dans la possibilité d’étudier les processus sous terre14,15et, premiers protocoles ont été publiés pour l’analyse des métabolites de la rhizosphère en sol16. Plus récemment, pour permettre l’analyse à haut débit, microfluidique avancé dispositifs13,17 comme plante puce18,19, RootArray20et21de RootChip, ont été mis au point des outils efficaces pour le phénotypage d’usine avec une résolution spatiale-l’échelle du micromètre pour surveiller les premiers stades de croissance de la plante de petit modèle Arabidopsis thaliana en liquide fluide véhiculé. Récemment, une plate-forme d’imagerie de la bicouche a été décrite qui permet l’imagerie poils absorbants d’Arabidopsis thaliana au stade plantule avec une plate-forme de microfluidique22.
Ici, les protocoles détaillés pour la construction d’appareils de laboratoire (EcoFABs) sont fournies, pour étudier les interactions plantes microorganismes et montrent qu’ils peuvent servir à étudier diverses plantes y compris Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, l’écologiquement importante folle avoine Avena barbata et la récolte de bioénergie Panicum virgatum (Panic raide). EcoFAB est une plateforme de croissance végétale stérile qui comprend deux composants principaux : le dispositif EcoFAB et récipient transparent taille plante stérile. La EcoFAB périphérique est issu d’un polydiméthylsiloxane (PDMS), procédé qui consiste à coulée PDMS de fabrication des couches d’un moule en plastique imprimé 3D et collage des couches PDMS sur lames de microscope à l’aide des méthodes précédemment rapporté24,25 . Les procédures détaillées de workflow EcoFAB, telles que la fabrication de dispositifs, stérilisation, la germination des graines, transplantation des semis, microbe inoculation/la co-culture, préparation des échantillons et l’analyse, sont décrits dans le présent protocole (Figure 1). Autres modifications du flux de base sont décrites, y compris l’installation de l’ordinateur contrôlaient LED grow lights et l’utilisation des substrats solides. L’utilisation de techniques pour étudier la morphologie racinaire d’imagerie change, colonisation microbienne des racines, et l’Imagerie spectroscopique masse d’exsudats racinaires sont décrites. Nous prévoyons que le design simple et peu coûteux, issu des matériaux facilement disponibles, ainsi que les protocoles détaillés présentés ici, deviendra la plate-forme EcoFAB une ressource communautaire, normaliser les études en laboratoire usine-microbiome.

<table><tbody><tr><td>Moule personnalisé imprimé en 3D</td>, fichiers <td>LBNL</td><td></td><td>STL disponibles ici www.eco-fab.org ; Les moules EcoFABs décrits ici ont été imprimés par FATHOM : http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 kit transparent en élastomère de silicone</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Spray de dépoussiérage à air</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>tout dépoussiéreur à gaz comprimé doit fonctionner</td></tr><tr><td>Aiguille émoussée de calibre 15</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 5 mL avec Luer-Lok Tip</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3 pouces x2 pouces lame de microscope en verre</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1,75 » x 2,56 » x 3,56 » boîte EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4 » x 3 &frac14 ; &rdquo; lame de microscope en verre</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4,87 » x 4,87 » x 5,50 » boîte EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Pince personnalisée imprimée en 3D</td><td>Fichiers LBNL</td><td></td><td>STL disponibles dans le laboratoire de Trent Northen</td></tr><tr><td>Capot stérile</td><td>AirClean Systems</td><td>AC600 Series PCR Workstations</td><td></td></tr><tr><td>Tube de seringue en PTFE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td> Murashige et Skoog (MS) Glycolage à base de macronutriments Phytotechnologies Laboratories M502 Murashige et Skoog (MS) Glycolage <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> à base de micronutriments Phytotechnologies Laboratories M554 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sol</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-24 Col-4 Columbia type</td><td></td>sauvage</tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>Standard Bd-21 line</td><td>Disponible dans le laboratoire de John Vogel</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td><td>Alamo panic raide</td><td></td></tr><tr><td>Ruban micropore</td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol de qualité LC-MS</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisateur</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVAC</td><td>concentrateur Thermo Scientific</td><td>Savant&trade ; SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV Filtre centrifuge-0.22 &micro ; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Système de chromotographie liquide</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1290 Système</td><td></td>LC</tr><tr><td>Q Exactive Spectromètre de masse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade ; Hybride Quadrupole-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>Puce NIMS et plaque MALDI personnalisée</td><td>LBNL</td><td></td><td>Pour le protocole détaillé, voir : doi :10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse MALDI</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>Bande lumineuse LED nano-revêtue</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation</td><td>LED World Lighting</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur TC420</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>Clips LED en silicone</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet à colle chaude</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>Câble de connecteur LED femelle à nue</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>Câble d’extension de connecteur LED femelle à mâle</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>20AWG Câble 2 fils</td><td>LED World Lighting</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415 Connecteur d’épissure</td><td>LED World Lighting</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

Écosystème des protocoles de fabrication (ecofab) pour la construction des écosystèmes de laboratoire destiné à étudier les interactions plantes-microorganismes

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Interactions plantes-microorganismes bénéfiques offrent une solution biologique durable susceptibles de stimuler la production alimentaire et de la bioénergie de faibles consommations. Une meilleure compréhension mécaniste de ces interactions plantes-microorganismes complexes seront cruciale pour améliorer la production végétale comme écologique bien plus performante basic étudie les interactions sol-plante-microbe chargée de l’enquête. Ici, une description détaillée pour la fabrication de l’écosystème est présentée, à l’utilisation largement disponibles technologies d’impression 3D, pour créer des habitats contrôlées en laboratoire (EcoFABs) pour études mécanistes des interactions plantes-microorganismes dans spécifique environnementale conditions. Deux tailles de EcoFABs sont décrits qui conviennent pour l’étude des interactions microbiennes avec diverses espèces de plantes, y compris l’Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonet Panicum virgatum. Ces dispositifs intermédiaires permettant de contrôlé manipulation et échantillonnage de racine microbiomes, chimie de la racine ainsi que l’imagerie de la morphologie de la racine et localisation microbienne. Ce protocole comprend les détails pour le maintien des conditions stériles à l’intérieur de EcoFABs et montage indépendants systèmes de lumière LED sur EcoFABs. Méthodes détaillées pour l’ajout de différentes formes de médias, y compris les sols, sable et milieux de culture liquide couplée à la caractérisation de ces systèmes à l’aide de l’imagerie et métabolomique est décrites. Ensemble, ces systèmes permettent l’enquête détaillée et dynamique de la plante et plante-microbienne consortiums dont la manipulation de microbiome composition (y compris mutants), la surveillance de la croissance des plantes, la morphologie racinaire, composition de l’exsudat, et localisation microbienne dans des conditions environnementales contrôlées. Nous prévoyons que ces protocoles détaillés servira de point de départ important pour les autres chercheurs, idéalement aidant à créer normalisés systèmes expérimentaux pour l’étude des interactions plantes-microorganismes.

Chaque système EcoFAB muni d’un dispositif EcoFAB et une usine de taille de récipient en plastique transparent. Un seul appareil EcoFAB a un réservoir de l’usine, une chambre de croissance des racines, une entrée de débit de 1,6 mm et une prise de 1,6 mm pour appareil EcoFAB standard (Figure 2D &amp; Figure 3 H) ou à une prise de 10 mm pour dispositif de EcoFAB wide-prise (Figure 2F &amp; Figure 3I ). Le réservoir de l’usine est conçu en forme de trapèze qui possède une ouverture supérieure de 6 mm et 3 mm ouverture en bas, et cette conception réduit le risque de fuite de flux pendant l’injection de liquide et s’assure également de suffisamment d’espace pour la croissance des plantes. La chambre de croissance racinaire adopte une forme ovale avec une profondeur de 2 mm pour s’adapter à des systèmes racinaires des plantes beaucoup de modèles, comme le montre la Figure 2 et E. Canaux d’entrée et de sortie d’un dispositif de EcoFAB standard peuvent être connectés avec la tuyauterie de PTFE afin de solutions nutritives peuvent circuler dans la chambre de croissance racinaire, sans ouvrir le conteneur EcoFAB. Le dispositif de EcoFAB wide-prise grandement réduit la résistance à l’écoulement de la prise et est de préférence utilisé dans la culture des plantes à racines épaisses ou recueillir périodiquement des exsudats racinaires après que des systèmes racinaires complexes sont dérivés de plantes.
Les moules de coulée pour la fabrication de couches PDMS de EcoFAB dispositifs sont créés dans un logiciel de conception, et ensuite 3D imprimées en photopolymères opaque rigide, comme illustré à la Figure 2 et Figure 3. Plantes à l’intérieur de la EcoFABs peuvent être directement observés au microscope à l’aide d’une long travail distance, assurant que la stérile croître environnement (Figure 8 a, Dossier complémentaire 1). EcoFAB dispositifs avec des plantes peuvent également s’adapter sur une scène de microscopie à haute résolution, ce qui permet l’imagerie de résolution plus élevée des interactions plantes-microorganismes (Figure 8 b, Fichier supplémentaire 2). La stérilité n’est pas maintenue dans cet environnement, et l’imagerie haute résolution convienne donc uniquement pour les mesures de point de terminaison.
EcoFABs sont conçus pour permettre des études systématiques des plantes, telles que leur morphologie et métabolismes des communautés microbiennes à leurs stades de développement différents dans l’ensemble de leur cycle de vie. Ici, les EcoFABs ont été examinés comme une plate-forme générale d’étudier une variété d’espèces végétales. Figure 8 -E montrent 7 - jour vieux Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonet Panicum virgatum poussant dans EcoFABs. Tous trois ont été trouvés pour bien se développer dans la EcoFAB pendant plus d’un mois. Les dicotylédones, Arabidopsis thaliana tant les monocotylédones, Brachypodium distachyon trouvées s’acquittent de leurs stades de reproduction dans le EcoFABs.
Le réversible système d’étanchéité permet l’utilisation de substrats solides (p. ex.., sol) au sein de la EcoFABs (étape 2.2). Ce réversible approche d’étanchéité permet un chargement des substrats solides dans les chambres de croissance racinaire et permet également le prélèvement d’échantillons provenant de régions spécifiques de rhizosphères de racine. Figure 8F -H afficher un groupe âgé de 14 jour Brachypodium distachyon croissante en milieu hydroponique, ainsi que de sable et de terre additionnée de milieu hydroponique (sable) et d’eau (sol). La couche mince substrat solide en chambre de croissance racinaire permet à la lumière de pénétrer à travers pour imagerie microscopique des systèmes racinaires.
Morphologie de la racine est définie comme la configuration spatiale et de la distribution d’un système de racine de plante et a été approuvée comme une réponse de physiologie indispensables aux milieux de croissance variés, tels que des éléments nutritifs ou l’eau disponibilité32,33, 34. EcoFABs fournissent une approche commode d’étudier la morphologie végétale dans le temps ou dans des conditions différentes en éléments nutritifs. Figure 9 a-F montrent un exemple d’utilisation de EcoFABs pour suivre les morphologies de racine de Brachypodium distachyon dans les trois premières semaines. Un semis de Brachypodium distachyon a été transféré dans le dispositif EcoFAB et sa structure de racine a été enregistré par une caméra à l’intérieur d’un imageur de gel de BIO-RAD. Programme de traitement des images, comme Image J, python et matlab, peut être appliquée plus loin afin de quantifier les changements de morphologie de la racine dans le temps ou à des environnements différents moyens. La quantification de la surface des racines total au cours des trois semaines ont montré une augmentation progressive au stade précoce (&lt; 1 semaine) suivie d’une tendance de croissance linéaire jusqu’au bout de trois semaines, comme le montre la Figure 9.
Une première motivation pour construire la EcoFAB est d’étudier les interactions plantes-microorganismes. Comme indiqué au point 5.4, les micro-organismes sont transférés dans la chambres de croissance racinaire de EcoFAB périphériques via le canal d’admission. La figure 10 illustre, un EcoFAB contenant Pseudomonas simea (anciennementfluorescens) WCS417 (WCS417), une croissance des plantes rhizobactéries avec des étiquettes de chimiluminescence, a été ajouté dans les systèmes de racine de plante avec une concentration de 106 cellules par plante. Le signal de WCS417 a été détecté avec un imageur de gel, ce qui indiquait une répartition spatiale distincte des microbes WCS417 en chambre de croissance racinaire. Dans les deux MS un milieu liquide avec et sans le sable substrat solid, microbes WCS417 a colonisé les surfaces du système racinaire entier avec microbes concentrés autour des zones de bout de racine, probablement à cause de la production de nutriments actif de radicelles (Figure 10 &amp; H)35. En revanche, les microbes WCS417 dans un substrat de sol accumulent autour de la région de réservoir centrale au lieu de radicelles (Figure 10j’ai). Les microbes ont été ajoutés par le canal de sortie, les microbes étaient également capables de se déplacer dans le substrat du sol, mais n’ont pas accumulé dans la racine, comme observé dans un milieu liquide avec ou sans sable. Cela pourrait indiquer que le sol est une source suffisante de nutriments, et les microbes ont migré vers le réservoir de l’usine pour des conditions optimales de la respiration.
Pour étudier le métabolite profilage des exsudats racinaires de plante ainsi que l’absorption métabolite et libérer des interactions plantes-microorganismes, les solutions de l’exsudat des chambres de croissance racinaire ont été recueillies à travers différentes étapes de la croissance des plantes en EcoFABs. Tel que décrit à l’étape 6, exsudat échantillons sont ensuite extraits pour l’analyse de LC-MS. En utilisant cette méthode, une variété de métabolites exsudé par la plante et consommée par les microbes a été détectée, et le profilage de métabolite connexe d’exsudats racinaires avec et sans colonisation microbes est actuellement sous enquête.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figure 1 : EcoFAB le flux de travail. Plantes sont mises à germer sur la plaque et transférés à la EcoFAB stérilisé, microbes peuvent être ajoutés. Échantillonnage non destructif : exsudats racinaires peuvent être échantillonnés et imagés, et la morphologie racinaire peut être visualisée. Échantillonnage destructeur permet l’analyse de microbe, racine et paramètres de shoot en détail.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figure 2 : les composantes de la 3D imprimés de moules pour la fabrication de dispositifs EcoFAB. (A) vues haut et inclinés d’un châssis de moulage. (B) haut et inclinés vues d’une insertion. (C) haut et inclinés vues d’une base de moule standard. (E) haut et inclinés vues d’une base de sortie d’échelle du moule. (D, F) Assemblé de moules pour la fabrication de dispositifs de EcoFAB standards et sortie d’échelle, respectivement. Les dimensions ovales sont 51 x 34 mm pour le petit moule EcoFAB et 76 x 62 mm pour le grand moule EcoFAB. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figure 3 : fabrication de dispositifs EcoFAB. (A) verser le mélange d’élastomère base et polymérisation d’agent dans le moule. (B) le moule avec le mélange à 85 ° C pendant 4 h. (C), retirer le moule de l’insert de chauffage. (D) qui sépare le PDMS du cadre bâti. (E) en poussant le moule base hors du cadre bâti. (F) à l’aide d’un couteau pour séparer le PDMS de la moisissure sur les bords. (G) la couche PDMS lentement à sortir de la base de la moisissure s’écailler. Trous de piquer (H) pour les canaux d’entrée et de sortie de la couche PDMS standard. (I) piquer un trou pour le canal d’aspiration de la couche PDMS de large-sortie. Couche (J) le PDMS (constituée d’un élastomère de 15:1 base de mélange d’agent de polymérisation) et une lame de microscope sont rincés et transférés dans un plasma de nettoyeur pour le collage. (K) à l’aide pinces pour tenir la couche PDMS (faite d’une base d’élastomère de 5:1 pour mélange agent de polymérisation) sur une lame de microscope. (L) en appuyant sur la couche PDMS (faite d’une base d’élastomère de 30 : 1 au mélange d’agent de polymérisation) directement sur une lame de microscope. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figure 4 : la conception des colliers personnalisés. (A) vues haut et inclinés d’un haut collier plaque. (B) haut et inclinés vues du fond pince plaque. (C) haut et inclinés vues de pince assemblé avec quatre ensembles de vis d’assemblage. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figure 5 : installation LED grow lights. (A) marquage sur les emplacements pour les 9 clips LED dans une spirale autour du récipient EcoFAB. (B) LED pinces fixées au conteneur EcoFAB. (C) une bande de LED dans ces clips de thread. (D) reliant la bande de LED à un contrôleur filaire avec une alimentation de 24V. (E) le schéma de connexions des fils au contrôleur. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figure 6 : transfert de plantules dans EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon plantes cultivées pendant 2 jours sur une plaque de 0,5 MS. (B) remplir la chambre de racine avec substrat de croissance des plantes. (C) à l’aide d’une pince à insérer délicatement la racine dans le réservoir de l’usine. (D) d’étanchéité le conteneur EcoFAB avec ruban micropore, après l’ajout de 3 mL d’eau au fond du récipient. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figure 7 : NIMS imagerie de plante des racines dans EcoFABs. (A) un croissant dans un stérile EcoFAB Brachypodium distachyon . B fixer la couche PDMS avec la plante sur une puce de NIMS pour 20 min. (C) Using cuivre ruban pour attacher la puce NIMS sur une plaque personnalisée de MALDI et chargeant dans un spectromètre de masse MALDI. (D-G) un 7 - jour vieux et un 20 vieux jour Brachypodium distachyon plante utilisée pour NIMS imaging (D, E) et les images correspondantes de NIMS (F, G). Les ions prédominantes ont été soulignées en rouge, vert et bleu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figure 8 : les applications générales de EcoFABs. (A) directement saisir la croissance racinaire de Brachypodium distachyon dans un EcoFAB avec une configuration de microscope travail longue distance. (B) directement observer les interactions de racine-microbe avec une configuration de microscope haute résolution. Panicum virgatum (E) dans un milieu hydroponique 0,5 MS, âgé de 14 jour (F-H) Brachypodium distachyon cultivées en hydroponie 0,5 MS (F), sable (G) et du sol (H), Brachypodium distachyon (D) et (C-E) 7 - jour vieux Arabidopsis thaliana (C) substrat livré avec moyen de 0,5 MS et eau, respectivement. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figure 9 : pour étudier la morphologie de la racine à l’aide de EcoFABs. (A-F) Développement racinaire de Brachypodium distachyon gagne en EcoFABs rempli de 0,5 MS moyen au cours des trois premières semaines : (A) 2 jours, (B) 4 jours, (C) 7 jours, (D) 11 jours, e 14, (F) 21 jours de croissance. (G) surfaces de racine en moyenne ont été estimées en logiciels ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figure 10 : l’utilisation de EcoFABs pour étudier les racines-microbe interactions. (A, B, C) Un groupe d’âge de 15 jour Brachypodium distachyon colonisatrices avec Pseudomonas fluorescens WCS417 sous différentes formes de médias-MS substrats de solution, de sable et de terre liquides. (D, E, F) Photos de champ lumineux de leur système racinaire. (G, H, I) Les images de chimiluminescence correspondantes de ces systèmes racinaires après co-culture de 14 jours. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier complémentaire 1. À l’aide de EcoFAB pour capturer la croissance racinaire. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier complémentaire 2. À l’aide de EcoFAB pour capturer les interactions de racine-microbes. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Cet article décrit les protocoles détaillés pour la fabrication de l’écosystème des appareils (EcoFABs) qui permettent l’étude des plantes et les interactions plantes-microorganismes dans des conditions très contrôlées en laboratoire.

Écosystème des protocoles de Fabrication (EcoFAB) pour la Construction des écosystèmes de laboratoire destiné à étudier les Interactions plantes-microorganismes

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

L’objectif général de ce protocole est de définir des approches standardisées pour la construction d’écosystèmes végétaux modèles simplifiés, appelés EcoFABs, qui permettent des expériences de laboratoire contrôlées et répliquées pour étudier les interactions entre les plantes et les microbes qui peuvent être testées davantage sur le terrain. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les interactions entre les microbes des plantes dans des environnements contrôlés, ce qui nous permet d’obtenir des informations mécanistes détaillées sur les fonctions des microbiomes afin de nous permettre de les exploiter pour une agriculture durable. Nous avons contribué à la conception de ce premier Eco-FAB, qui utilise une variété de technologies d’impression 3D disponibles et à la stérilisation des chambres de croissance des plantes qui permettent à la fois des images haute résolution non gênantes et des analyses chimiques.Le dispositif Eco-FAB développé ici est bien adapté à l’analyse des interactions plantes-microbes car il intègre l’analyse de la morphologie racinaire et l’imagerie par spectroscopie de masse. Suite à la construction des moules Eco-FAB, en utilisant l’impression 3D selon le protocole texte, dans un récipient jetable d’un litre, mélanger 40 millilitres de base en élastomère de siloxane avec différents volumes d’agent de durcissement, en fonction de l’expérience. Placez le récipient dans une chambre à vide pendant au moins 30 minutes pour éliminer les bulles d’air du mélange d’élastomère.Ensuite, retirez le mélange et versez-le dans le moule en plastique imprimé en 3D assemblé. Afin de générer une couche PDMS uniforme, les bulles d’air doivent être soigneusement éliminées. Utilisez de l’air comprimé pour souffler tous les résidus d’air après avoir transféré le mélange dans le moule.Conservez le moule sur un bloc chauffant à 85 degrés Celsius pendant quatre heures. Laissez le moule refroidir pendant cinq minutes. Ensuite, retirez doucement l’insert du moule et utilisez un couteau utilitaire pour séparer lentement le PDMS du cadre de coulée.Appuyez sur la base du moule avec PDMS pour sortir du cadre de coulée. Ensuite, utilisez un couteau ou d’autres outils pour séparer délicatement la couche PDMS de la base du moule sur les bords et décollez-la lentement de la surface du moule. À l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 15, créez un canal d’entrée sur les couches PDMS en faisant des trous de 1,6 millimètre dans cette pièce.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper les bords des couches PDMS. Pour lier de manière permanente les couches PDMS aux lames de microscope, utilisez du méthanol pour rincer le côté de liaison de la couche PDMS sur une lame de microscope de 7,6 x cinq centimètres, puis séchez-les avec de l’air comprimé ou un pistolet à azote ultra-pur. Placez la lame de microscope et la couche PDMS dans un nettoyeur plasma avec leurs côtés de liaison vers le haut.Fermez la chambre et la soupape de purge de gaz. Ensuite, allumez l’aspirateur et pompez dans la chambre pendant une minute. Allumez le générateur de plasma et réglez la fréquence radio, ou niveau RF, sur élevé pendant une minute.Ensuite, éteignez à la fois la pompe à vide et l’alimentation plasma, et évacuez la chambre dans l’atmosphère. Retirez la lame de microscope et la couche PDMS de la chambre à plasma et appuyez rapidement sur les quatre bords de la couche PDMS sur la lame avec une pression uniforme. Assurez-vous que la région ovale centrale, qui est la chambre racine, ne touche pas la lame.À l’aide d’eau ultra-pure, rincez les appareils Eco-FAB. Placez un appareil Eco-FAB dans un récipient Eco-FAB et ajoutez 70 % d’éthanol jusqu’à ce que l’appareil soit immergé. Ensuite, fermez le couvercle du récipient et secouez-le doucement pour mouiller toutes les surfaces à l’intérieur avec de l’éthanol, en vous assurant que la chambre de croissance des racines de l’appareil Eco-FAB est remplie d’éthanol, avec très peu ou pas de bulles d’air.Après avoir incubé les appareils à température ambiante pendant 30 minutes, versez l’éthanol à 70 % et remplacez-le par de l’éthanol à 100 %. Ensuite, incubez les appareils pendant cinq minutes. Après l’incubation, égouttez l’éthanol et laissez l’Eco-FAB stérilisé dans une hotte à flux laminaire pendant 16 heures pour le sécher complètement.Si possible, stérilisez le système en allumant la lumière UV dans la hotte pendant une heure. Pour effectuer la stérilisation et la germination des graines, faites tremper les graines dans de l’éthanol à 70 % pendant deux minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirez l’éthanol et utilisez de l’eau stérile pour rincer les graines trois fois.Ensuite, faites tremper les graines dans une solution d’eau de Javel à 10 % pendant cinq minutes. Ensuite, retirez la solution d’eau de Javel et utilisez de l’eau stérile pour bien laver les graines trois fois. Après les lavages, ajoutez de l’eau stérile aux graines et incubez le tube à quatre degrés Celsius pendant sept jours.Répartissez uniformément les graines sur 0,5 Murashige et Skoog, ou milieu MS, avec 0,6 % de vitagel. Et avec du ruban adhésif microporeux, scellez les plaques. Ensuite, faites pousser les plantes à une longueur de racine d’environ cinq millilitres.Pour transférer les plantules dans les Eco-FAB, à l’aide d’une seringue ou d’une micropipette stérile et d’eau stérile, rincez trois fois la chambre racinaire d’un dispositif Eco-FAB, puis remplissez la chambre racinaire avec le milieu de croissance d’intérêt, tel que le milieu 0,5 MS. Maintenant, insérez soigneusement un seul plant dans le réservoir de plantes de l’appareil Eco-FAB. Il est important que les semis soient transférés avec soin de la plaque à l’Eco-FAB afin que les racines ne se cassent pas.Ajoutez trois millilitres d’eau stérile dans le récipient, en évitant l’appareil Eco-FAB. Cela augmentera l’humidité et réduira l’évaporation du milieu de la chambre racinaire. Ensuite, fermez le récipient et utilisez du ruban adhésif microporeux pour sceller le couvercle.Placez l’Eco-FAB dans un incubateur de plantes ou utilisez le système d’éclairage Eco-FAB dans un environnement à température contrôlée adapté à la croissance de la plante concernée. Ensuite, réglez la chambre à 24 degrés Celsius. Enfin, effectuez le profilage des métabolites et la spectrométrie de masse, conformément au protocole texte.Ces figures montrent que Aaabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon et panicum virgatum âgés de sept jours poussent dans les Eco-FABs. La dicotylédone et la monocotylédone ont toutes deux été à la hauteur de leurs stades de reproduction dans l’Eco-FAB. Ces semis représentent un groupe de brachypodium distachyon âgés de 14 jours poussant dans un milieu hydroponique, ainsi que dans du sable et de la terre complétés par un milieu hydroponique et de l’eau, respectivement.La couche de substrat mince et solide et les chambres de croissance des racines permettent à la lumière de pénétrer pour l’imagerie microscopique des systèmes racinaires. Ici, un semis de brachypodium distachyon a été transféré dans le dispositif Eco-FAB, et sa structure racinaire a été enregistrée par une caméra à l’intérieur d’un imageur de gel biorad. La quantification de la surface racinaire totale sur une période de trois semaines a montré une augmentation progressive au début, suivie d’une tendance de croissance linéaire jusqu’à la fin.Dans cette figure, un Eco-FAB contenant les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes, pseudomonas simiae, WCS417 a été ajouté dans les systèmes racinaires des plantes à raison de 10 à 6 cellules par plante. Les microbes WCS147 ont colonisé la surface de l’ensemble des systèmes racinaires avec des microbes concentrés autour des extrémités des racines. Lors du rafraîchissement des milieux de culture et de la collecte des exsudats racinaires des Eco-FABs, il est important de ne pas oublier de traiter tout le travail dans une hotte stérile pour éviter toute contamination.Les dispositifs Eco-FAB peuvent également être fabriqués à l’aide d’un joint physique réversible, soit à l’aide d’une pince imprimée en 3D, soit en modifiant la viscosité du PDMS. Cela permet l’utilisation de milieux de croissance solides et de l’imagerie spectroscopique de masse directe. Après le développement d’Eco-FAB, ce système permettra aux chercheurs du monde entier d’utiliser ces écosystèmes modèles de laboratoire pour étudier les interactions entre les microbes des plantes à l’aide de technologies de biologie des systèmes et d’imagerie.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’un système Eco-FAB, ainsi que de ses vastes applications dans les études d’écosystèmes. Nous espérons que cette conception Eco-FAB permettra à d’autres scientifiques d’atteindre leurs objectifs scientifiques spécifiques. Plus important encore, nous espérons que d’autres scientifiques s’appuieront sur cette conception d’Eco-FAB et l’amélioreront, et la partageront avec d’autres scientifiques, afin qu’en tant que communauté, nous puissions construire ces écosystèmes de laboratoire pour nous permettre de mieux comprendre les interactions entre les plantes et les microbes.N’oubliez pas que travailler avec des microbes et des objets tranchants peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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Dispositifs microfluidiques peuvent être utilisées pour visualiser processus naturels complexes en temps réel et à l'échelle physique approprié. Nous avons développé un dispositif simple microfluidique qui imite les principales caractéristiques des milieux poreux naturels pour étudier la croissance et le transport des bactéries dans le sous-sol.

Fenêtre sur un micromonde: Simple systèmes microfluidiques pour l&#39;étude de Transports microbienne dans les milieux poreux

Source : Nathoo, N., et al. Un système de co-culture hydroponique pour l’analyse simultanée et systématique des interactions moléculaires et de la signalisation plantes/microbes. J. Vis. Exp. (2017).Cette vidéo fait la démonstration d’un système de co-culture hydroponique pour étudier les interactions plantes-bactéries dans des conditions stériles. Les semis sont transférés dans un milieu de croissance stérile et acide, incubés et inspectés pour détecter toute contamination avant d’être...

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Le développement des communautés microbiennes dépend d'une combinaison de facteurs, y compris l'architecture environnementale, l'abondance des membres, les traits et les interactions. Ce protocole décrit un environnement synthétique et microfabricant pour le suivi simultané de milliers de communautés contenues dans les puits de femtolittes, où des facteurs clés tels que la taille de niche et le confinement peuvent être approchés.

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Nous présentons ici une étude établie dans l’iDiv Ecotron, des chambres de mésocosme terrestres avec des conditions environnementales contrôlées au-dessus et au-dessous du sol, pour étudier les effets indépendants et interactifs de l’histoire des plantes et de l’histoire du sol sur le fonctionnement écosystémique des communautés de prairies le long d’un gradient de diversité végétale.

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Écosystème des protocoles de Fabrication (EcoFAB) pour la Construction des écosystèmes de laboratoire destiné à étudier les Interactions plantes-microorganismes (Vidéo) | JoVE Journal

Écosystème des protocoles de Fabrication (EcoFAB) pour la Construction des écosystèmes de laboratoire destiné à étudier les Interactions plantes-microorganismes

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