Formation de l’ADN Covalent adduits cancérogènes enzymatiquement activés et médicaments In Vitro et leur détermination par ³²P-post-marquage

L’objectif général de ce protocole est de décrire les méthodes utilisant les réactions catalysées par le cytochrome p450 et d’autres enzymes de biotransformation pour étudier la puissance des produits chimiques ou des médicaments pour leur activation en métabolites formant des adduits d’ADN covalents. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du développement du cancer et de son traitement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous montre un type de méthode pour évaluer la puissance des produits chimiques environnementaux ou des médicaments pour former des adduits d’ADN covalents représentant l’initiation du développement du cancer.

Les implications de la technique déterminant le pouvoir cancérogène des produits chimiques. La puissance environnementale, les toxiques et les médicaments et détermine également des méthodes relativement simples pour la formation d’adduits d’ADN covalents formés par de tels composés. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’initiation du développement du cancer et de son traitement, elle peut également être appliquée à d’autres domaines scientifiques.

Telles que l’étude des mécanismes moléculaires, des dommages à l’ADN et les études orales sur l’activation enzymatique et la toxification des produits chimiques. J’ai entendu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque j’ai étudié les processus impliqués dans la phase d’initiation de la cancérogenèse chimique. Préparez d’abord le mélange d’incubation en ajoutant tous les composés et les systèmes enzymatiques jusqu’à un volume final de 0,75 millilitre à quatre degrés Celsius.

Il s’agit d’incuber le cancérogène avec l’ADN en présence du cytochrome p450. Ensuite, ajoutez des microsomes ou du p450 recombinant pur dans du supersome au mélange. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres d’ellipticicine de 0,1 millimolaire dissous dans du DMSO et 42,5 microlitres d’eau pour ajuster le volume final à 0,75 millilitre.

Ensuite, mélangez les composants en faisant tourbillonner le tube pendant cinq secondes. Immédiatement après, incubez le tube à 37 degrés Celsius avec le couvercle ouvert pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, mélangez du phénol ou du phénol chloroforme dans un rapport de un à un avec le mélange d’incubation dans un tube Eppendorf.

Cela éliminera la contamination protéique de l’ADN dans le mélange d’incubation. Remuez ensuite le mélange pour former une émulsion. Ensuite, essorez le mélange à 1600 fois g pendant trois minutes à température ambiante.

Une fois la centrifugation terminée, utilisez une pipette pour transférer la phase supérieure de l’eau dans un nouveau tube en polypropylène. Jetez ensuite l’interface protéique avec la phase organique. Ensuite, mélangez la phase aqueuse avec un volume équivalent de phénol et de chloroforme dans un rapport de un à un.

Répétez ensuite la centrifugation. Ensuite, ajoutez des volumes égaux de chloroforme à la phase aqueuse recueillie et centrifugez-la à nouveau. Précipitez ensuite l’ADN de la phase aqueuse en ajoutant deux volumes d’éthanol froid maintenu à moins 20 degrés Celsius.

Ensuite, mélangez bien la solution. Pour préparer le marquage des adduits à l’ADN, mélangez la solution tampon de bicine avec une solution ATP radiomarquée pour marquer les adduits à l’ADN. Ajouter le mélange d’étiquetage à la solution NP1 ou au mélange d’enrichissement en butanol.

Laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Appliquez ensuite environ 20 microlitres sur l’ensemble de l’échantillon sur la plaque TLC PEI-cellulose. Après avoir repéré l’échantillon sur une plaque TLC PEI-cellulose, laissez la plaque se développer dans la direction D1 pour nettoyer les adduits.

Une fois la plaque sèche, laissez la plaque se développer dans les directions D3 et D4. Pour développer en D3, utilisez un tampon de formiate de lithium à pH 3,5 avec de l’urée. Pour le développement de D4, utilisez le tampon Tris-HCl avec du chlorure de lithium et de l’urée.

Afin d’éviter tout problème de développement dans le sens D4, développez également les plaques dans le sens D5. Tout d’abord, la technique de post-marquage P32 est utilisée pour étudier l’efficacité de l’ellipticine bioactivée médiée par le p450 microsomal dans la formation d’adduits à l’ADN. Les résultats montrent la formation d’adduits à l’ADN covalent dans la désoxyguanosine de l’ADN du thymus du veau en présence de microsomes hépatiques chez le rat et/ou chez l’homme ; Cependant, aucun adduit ne se forme dans le groupe témoin.

Ensuite, le potentiel de l’ellipticine activée dépendante de l’enzyme peroxydase est étudié. L’image montre la formation d’adduits d’ADN covalents dans l’ADN du thymus du veau en présence de peroxydase de raifort, de lactoperoxydase bovine et de myéloperoxydase humaine. En fait, des adduits à l’ADN sont également formés à partir de l’ADN du foie lorsque les rats sont traités avec 40 milligrammes par kilogramme de poids corporel d’ellipticine in vivo.

Il est intéressant de noter que l’enzyme humaine du cytochrome p450 CYP3A4 présente également un fort potentiel pour oxyder efficacement l’ellipticine en métabolites tels que la 12-hydroxyellipticine et la 13-hydroxyellipticine. Ces métabolites peuvent facilement se lier à l’ADN pour former les adduits. Ensuite, les méthodes d’enrichissement en nucléases P1 et en n-butanol sont utilisées pour étudier la formation d’adduits à l’ADN lors de l’activation du 3-nitrobenzanthrone avec la cytosolus réductase telle que NQ01 du rat et de l’homme.

Les résultats montrent la formation d’un maximum de cinq adduits à l’ADN du thymus du veau obtenu à partir du cytosol hépatique humain et du foie de souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée. En tentant cette procédure, il est important de se rappeler la stabilité des systèmes enzymatiques utilisés.

L’activité enzymatique peut diminuer si elle n’est pas stockée sur de la glace. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biochimie, de la biochimie de la cancérogenèse chimique pour explorer la nature des phénomènes à partir des processus d’initiation du développement du cancer dans les organismes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la puissance des produits chimiques environnementaux ou des médicaments à activer enzymatiquement pour métaboliser les adduits génétiques covalents de l’ADN.

Ce processus revêt une grande importance pour le développement de traitements contre le cancer. N’oubliez pas que vous travaillez avec des produits chimiques qui peuvent être extrêmement dangereux. Cancérogènes potentiels, produits chimiques radioactifs, par exemple le phosphore ATP.

Par conséquent, des précautions telles que des gants de laboratoire en latex et des feuilles de plexiglas doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.