Quantification des protéines spécifiques au site Lysine acétylation et stoechiométrie Succinylation spectrométrie de masse indépendante des données Acquisition
4 avril 2018
Nous présentons ici la quantification objective des protéines spécifiques au site acétylation et/ou succinylation occupation (stoechiométrie) un proteome ensemble grâce à une analyse logométrique de modifications endogènes aux modifications introduites après quantitative acylation chimique utilisant des anhydrides stables isotopes marqués. En combinaison avec la spectrométrie de masse sensibles acquisition indépendante des données, mesures d’occupation de site précis sont obtenus.
L’objectif global de ce nouveau flux de travail est de déterminer l’occupation ou la stœchiométrie des modifications post-traductionnelles des protéines à des sites d’acétylation spécifiques. Ce nouveau flux de travail par spectrométrie de masse offre un niveau de quantification plus élevé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la régulation réversible des protéines par des modifications post-traductionnelles, telles que l’acétylation de la lysine ou la succinylation : les sites sont les plus fortement modifiés et peuvent altérer la fonction des protéines. Le principal avantage de cette technique est que la stœchiométrie au niveau du site de l’acétylation de la lysine et de la succinylation et de la succinylation est déterminée avec précision et que la méthode peut déterminer la stœchiométrie à partir de peptides contenant plusieurs résidus de lysine. Cette technique est très pertinente car elle révèle l’acétylation et la succinylation, la stœchiométrie ou la proportion modifiée par rapport à la proportion non modifiée au lieu de mesurer un changement d’abondance relative sans dimension. J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque j’ai réalisé que l’utilisation d’acquisitions indépendantes des données et de la quantification basée sur MS2 pour l’analyse de la stœchiométrie améliorerait considérablement la précision des mesures. Préparez trois répliques de 100
Aperçu
Cette étude présente un nouveau protocole de spectrométrie de masse pour la quantification des modifications post-traductionnelles des protéines, en particulier l'acétylation et la succinylation. La méthode améliore la précision des mesures en déterminant l'occupation ou la stœchiométrie spécifique aux sites de ces modifications.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Spectrométrie de masse
- Protéomique
Contexte
- Les modifications post-traductionnelles jouent un rôle crucial dans la fonction des protéines.
- Comprendre l'acétylation et la succinylation est essentiel pour étudier la régulation réversible des protéines.
- Les méthodes traditionnelles peuvent manquer de précision pour quantifier ces modifications.
- Cette étude vise à améliorer l'exactitude des mesures de stœchiométrie.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole permettant une quantification précise de l'acétylation et de la succinylation des protéines.
- Identifier quels sites de lysine sont le plus modifiés et évaluer leur impact sur la fonction des protéines.
- Fournir une méthode capable d'analyser des peptides contenant plusieurs résidus de lysine.
Méthodes utilisées
- Analyse ratiométrique des modifications endogènes.
- Acylation chimique quantitative à l'aide d'anhydrides marqués par des isotopes stables.
- Spectrométrie de masse avec acquisition indépendante des données.
- Préparation de plusieurs réplicats pour assurer la précision.
Résultats principaux
- La méthode permet une détermination précise de la stœchiométrie au niveau du site.
- Elle révèle la proportion de résidus de lysine modifiés par rapport aux résidus non modifiés.
- Précision de mesure supérieure par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Identifie les sites clés de l'acétylation et de la succinylation affectant la fonction des protéines.
Conclusions
- Ce protocole améliore considérablement la quantification des modifications post-traductionnelles des protéines.
- Il permet d'obtenir des informations sur la régulation de la fonction protéique par acétylation et succinylation.
- La technique est applicable à un large éventail d'études protéomiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification précise de la stœchiométrie de l'acétylation et de la succinylation sur des lysines spécifiques permet une évaluation exacte de l'occupation des modifications post-traductionnelles, ce qui est essentiel pour comprendre la régulation réversible des protéines dans les voies cibles de médicaments. Cette méthode fournit une mesure impartiale et à l'échelle du protéome des niveaux de modification, aidant ainsi la validation des cibles en distinguant les sites d'acylation biologiquement pertinents du bruit de fond. En fournissant des données stœchiométriques plutôt que des variations d'abondance relative, elle renforce la fiabilité prédictive dans la réduction des risques mécanistiques durant les phases précoces de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant l'occupation des résidus lysine par l'acétylation et la succinylation.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques grâce à une mesure précise de la stœchiométrie des modifications, clarifiant ainsi leur impact fonctionnel sur l'activité des protéines.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en identifiant les sites modifiés les plus susceptibles d'altérer la fonction, contribuant ainsi au tri du portefeuille.
Tests et développement de dosages
- Prêt à l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux de travail en aval en fournissant des données d'occupation de l'acylation au niveau des sites.
- Production quantitative : Utilise les aires des pics d'ions fragments provenant de la spectrométrie de masse en analyse par fragmentation indépendante (DIA-MS) pour permettre une quantification précise, réduisant les interférences, adaptée à la standardisation des essais.
- Extensibilité : Facilite la préparation au criblage grâce à une analyse protéomique reproductible et multiplexée de l'acétylation et de la succinylation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie le profilage des modifications en phase de découverte à la validation préclinique en identifiant les sites d'acylation pertinents pour la maladie.
- Dérisquage mécanistique : Met l'accent sur la valeur prédictive en déterminant la stœchiométrie à partir de peptides comportant plusieurs résidus de lysine, permettant une résolution spécifique au site.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller/arrêt en révélant quelles modifications des lysines sont fonctionnellement significatives par opposition à stochastiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification du composé directeur, en fournissant des données stœchiométriques d'acétylation et de succinylation qui éclairent la compréhension mécanistique et les effets des composés sur la fonction des protéines.
- Biologie de la découverte : Facilite la validation d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant l'occupation des modifications spécifiques aux sites en réponse à des perturbations.
- Criblage : Permet la préparation d'essais grâce à une mesure normalisée et quantitative des niveaux de modification dans des échantillons protéomiques.
- Analytique : Fournit des mesures précises de stœchiométrie par quantification des ions fragments en spectrométrie de masse à acquisition indépendante (DIA-MS), permettant une comparaison exacte des états de modification.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en identifiant des sites d'acylation à forte occupation qui pourraient servir de biomarqueurs ou d'indicateurs mécanistiques.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité protéomique réutilisable pour un profilage cohérent des modifications post-traductionnelles (PTM) à travers différents projets et classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive grâce à la stœchiométrie précise au niveau des sites d'acétylation et de succinylation, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité par une quantification basée sur la spectrométrie de masse en mode DIA et Skyline, minimisant la variabilité technique.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en identifiant les sites de modification à forte occupation et à pertinence fonctionnelle, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des preuves fonctionnelles induites par des modifications.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en protéomique basée sur la spectrométrie de masse et en techniques d'enrichissement des PMT.
- Dépend d'instruments compatibles avec l'analyse DIA et de la génération de bibliothèques spectrales pour une quantification précise des ions fragments.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de préparation des échantillons et d'acylation chimique afin d'assurer la reproductibilité.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application du protocole à divers systèmes modèles ou types de tissus.
- Comporte des limites pratiques liées à la détectabilité des peptides et à l'accessibilité des résidus de lysine dans des mélanges complexes.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
