Name: Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Apprenez à identifier les cellules satellites musculaires par immunofluorescence avec laminine et Pax7. Cette méthode permet d'étudier les cellules souches musculaires dans leur environnement physiologique avec une manipulation minimale.

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Nous remercions la Section NIAMS lumière Imaging pour fournir les microscopes et les aides techniques. Les anticorps MF20 et Pax7 ont obtenu de la Banque de hybridome études développement développé sous les auspices de la NICHD et maintenu par le Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de NIAMS de la National Institutes of Health.

Dans le présent protocole, les muscles de la patte antérieure de souris adultes (2 à 6 mois), tibialis anterior (TA) et extensor digitorum longus (EDL), travaillaient à titre d’exemple, pour effectuer l’immunofluorescence souillant sur leurs SCs. Toutes les étapes de manipulation souris et muscle les dissections de tissu ont été approuvées par l’utilisation Comité (ACUC) du NIAMS/NIH et animalier.
1. disséquer le Muscle TA/PCP de la patte de souris
<ol><li>Euthanasier la souris dans une chambre d’euthanasie rempli2 CO conformément aux lignes directrices de l’ACUC des NIH. Effectuer la dislocation cervicale si nécessaire.</li>
	<li>Mettre la souris face vers le haut sur un socle de dissection (décubitus dorsal). Vaporiser de l’éthanol à 70 % sur sa peau de ventre. Couper un 1 ou 2 cm ouverture horizontalement sur le centre de la peau de ventre de la souris, puis deskin la souris en tirant sur l’ouverture vers les pieds de la souris. Exposer un côté de la patte de la souris.</li>
	<li>Utiliser des pinces à deux tranchants : utiliser une pour maintenir les tendons qui s’attachent le TA/EDL à la cheville et utiliser l’autre se casser et le cisaillement du fascia couvrant la TA/EDL. Une fois que le fascia est décollée, utilisez le bout pointu de la pince pour détacher la TA/PCP de l’os du tibia en exécutant la pointe sous le muscle TA/EDL.</li>
	<li>Couper les tendons de la cheville avec des ciseaux tout en les tenant toujours avec la pince. Coupez le muscle avec des ciseaux le long de la ligne longitudinale d’un TA/PCA de la cheville au genou tout en soulevant la TA/EDL du côté de la cheville avec la pince. Couper les tendons du genou côté pour détacher l’ensemble TA/EDL du tibia.</li>
</ol>2. Cryo-incorporation du Muscle TA/EDL
<ol><li>Préparez un bain d’azote liquide dans un récipient, par exemple., de l’azote liquide flacon Dewar. Versez méthylbutane dans un bécher en plastique petit (environ 20 mL) à moitié plein. Mettre ensuite le bécher dans un bain d’azote liquide pour congeler. Après quelques minutes, vérifier que le méthylbutane est gelé. Remarque : L’azote liquide peut être remplacé par un seau de glace sèche, mais le temps de congélation est plus lent.</li>
	<li>Posez la TA/EDL disséqué sur la surface plane d’un piston de petite seringue en plastique. Couvrir entièrement la TA/EDL avec quelques gouttes de Optimal coupe température (PTOM) composé (le milieu de congélation).</li>
	<li>Prenez le gobelet méthylbutane sortant du bain d’azote liquide et décongeler la surface avec un objet chaud (par exemple., la poignée de ciseaux). Rapidement dip les PTOM couvert TA/EDL sur le piston dans le fondu méthylbutane snap-gel le tissu.</li>
	<li>Détacher le tissu incorporé depuis le piston avec une pince et mettez-la dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Placer le tube dans l’azote liquide à stocker lors de la manipulation des échantillons plus. NOTE : Le tissu embarqué peut être stocké à-80 ° C à long terme (2 ans) ou à-20 ° C à court terme (6 mois).</li>
</ol>3. cryostat sectionnement
<ol><li>Ajouter une goutte de PTOM composé vers le centre d’un porte-spécimen d’un cryostat. Attendez que le composé PTOM est presque solidifié. Coller rapidement la TA/EDL incorporé au composé des PTOM, perpendiculairement à la cheville du côté vers le bas et le côté du genou vers le haut.</li>
	<li>Monter le porte-échantillon dans un cryostat, couper le tissu à 10 µm intervalle et recueillir les cryo-sections sur des lames de gel enduit avec sur 4-8 sections sur une diapositive.</li>
	<li>Sécher les sections à température ambiante pendant au moins 3 h pour la nuit. Remarque : Bien que les sections dans le congélateur pendant au moins une nuit de séchage est acceptable, il augmentera inévitablement l’autofluorescence. Pour de meilleurs résultats, sèche les sections pour 0,5 h, puis procéder à la fixation et coloration des étapes immédiatement.</li>
	<li>Recueillir les lames dans une boîte de diapositive et utilisez-les immédiatement ou stocker les lames à-80 ° C ou -20 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>4. préparation des réactifs pour Immunofluorescence souillant
<ol><li>
Préparez les tampons :
	<ol>
<li>Préparer 2 L de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de PBS 10 x.</li>
		<li>Préparer 40 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS 1 x 16 % PFA.</li>
		<li>Préparer 2 L de PBST : PBS 1 x 0,1 % Triton-100.</li>
		<li>Préparation de 50 mL de PBST PBST-b : avec 2 % d’albumine sérique bovine (BSA).</li>
		<li>Préparer 10 mL de PBST PBST-B-g : avec 2 % BSA et 5 % de sérum de chèvre Normal.</li>
		<li>Préparer 1 mL de solution de saturation. Diluer AffiniPure Fab Fragment Goat anti-mouse IgG (H + L) (01:10) PBST-b.</li>
		<li>Préparez 200 mL de tampon citrate 1 x. Remarque : Les volumes des solutions mentionnées ci-dessus sont suffisants pour au moins 5 toboggans. Des volumes doivent être ajustées selon le nombre de diapositives et la taille des conteneurs diapositive.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer des anticorps taches :
	<ol>
<li>Anticorps primaires (concentration de travail) : préparer 1,2 mL de mélange de l’anticorps primaire en diluant anticorps monoclonal de souris de Pax7 (IgG1) (1 à 5 µg/mL) + anticorps polyclonaux de lapin laminine (0,5 à 2 µg/mL) + anticorps monoclonal de souris de MF20 (IgG2b) (0,5 à 2,5 µg / mL) PBST-B-g. NOTE : Anticorps monoclonal de souris de MF20 (IgG2b) est facultative.</li>
		<li>Anticorps secondaires (concentration de travail) : préparer 1,2 mL de mélange d’anticorps secondaire en diluant chèvre anti-souris Croix-adsorbé secondaires anticorps IgG1, Alexa Fluor 488 (0,5 à 2 µg/mL) + chèvre anti-IgG (H + L) fortement adsorbés à la Croix secondaires anticorps de lapin, Alexa Fluor Plus 555 (0,5 à 2 µg/mL) + chèvre anti-souris IgG2b Croix-adsorbé anticorps secondaire, Alexa Fluor 647 (0,5 à 2 µg/mL) dans le PBST-B-G. NOTE : Alexa Fluor 647 est facultative.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immunofluorescence souillant étapes
<ol><li>
Réhydrater et fixer les cryo-sections avec IFP.
	<ol>
<li>Supprimer quelques-uns des diapositives TA/EDL cryo-section de la zone de diapositive. Réchauffer les diapositives dans un plateau porte-diapositive à température ambiante.</li>
		<li>Utiliser un stylo liquide bloqueur (stylo PAP) pour dessiner une zone qui comprend toutes les sections de cryo de la diapositive. Ce cercle empêchera les solutions de s’écouler hors de la diapositive.</li>
		<li>Prendre le bac pour une hotte de laboratoire. Ajouter 300-500 µL de 4 % PFA sur la diapositive dans la zone encerclée de fixer les sections à température ambiante pendant 10 min. lavent par la PFA avec du PBS 1 x au moins 3 x 5 min dans un conteneur de la diapositive. ATTENTION : PFA est toxique et un déchet dangereux ; il doit être géré avec soin et éliminé dans un conteneur de déchets dangereux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recherche d’antigène
	<ol>
<li>Remplir un autre conteneur de la diapositive avec 200 mL de tampon citrate.</li>
		<li>Transférer les lames dans le conteneur. Transférer le conteneur avec les diapositives dans un autocuiseur, faire cuire les diapositives en mode haute pression pendant 10 min.</li>
		<li>Refroidir le récipient avec drainage de l’eau pendant 10 min. transfert toutes les diapositives vers un nouveau conteneur avec PBST (200 mL), rincer les lames avec PBST pendant au moins 3 x 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blocage
	<ol>
<li>Ajouter kimwipes imbibées d’eau dans le plateau de tenir les diapositives pour créer un milieu humide pour éviter le séchage des lames.</li>
		<li>Déplacer les diapositives vers le plateau et ajouter 200 µL de solution sur chaque diapositive de blocage. Recouvrir le plateau avec un bouchon et laisser le blocage se développer pendant 30 min. NOTE : Pax7 anticorps est un anticorps monoclonal de souris, donc il y a liaison non-spécifique de souris IgG dans les tissus musculaires de souris qui crée de fond élevé. À l’aide de la AffiniPure Fab Fragment Goat anti-mouse IgG (H + L) bloque la liaison non-spécifique sur-souris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Appliquer les anticorps primaires.
	<ol>
<li>Rincer les lames avec PBST une fois dans le conteneur de la diapositive. Puis replacez les diapositives dans le plateau de coloration.</li>
		<li>200 µL du mélange de l’anticorps primaire sur chaque diapositive, recouvrir le plateau avec un couvercle et laissez la réaction développer à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C pour la nuit. Remarque : La réaction pendant la nuit à 4 ° C donne le meilleur résultat, bien que le développement de la réaction à la température ambiante donne des résultats satisfaisants. L’anticorps MF20 de myosine peuvent être ajoutés dans le mélange pour effectuer un marquage de triple (Pax7, laminine, MF20). MF20 taches différencient des fibres musculaires. Cette étape sert également une autre étape de blocage avec PBST-B-G pour réduire le potentiel liaison non-spécifique d’Anticorps secondaires (anticorps de chèvre) dans l’étape suivante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Appliquer des anticorps secondaires.
	<ol>
<li>Laver à l’anticorps primaires avec PBST à température ambiante au moins 3 x 5 min.</li>
		<li>Ajouter 200 µL du mélange de l’anticorps secondaire à chaque diapositive et laisser la réaction de développer à température ambiante pendant au moins 1 h. Remarque : Pour Pax7 + laminine, utilisez Goat anti-Mouse IgG1 Alexa 488 et chèvre anti-lapin Alexa 555. Pour Pax7 + laminine + MF20, ajouter le chèvre anti-souris IgG2b 647 Alexa dans le mélange.</li>
		<li>Laver à l’anticorps secondaires avec PBST au moins 3 x 5min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage et tache contre le DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole)
	<ol>
<li>Diluer PBST dans le conteneur de diapositive, par exemple, 10 µL de DAPI dans 200 mL de PBST DAPI (01:20, 000).</li>
		<li>Tacher les diapositives dans le conteneur DAPI pendant 3 min.</li>
		<li>Lavez le DAPI avec PBST pendant au moins 5 x 5 min.</li>
		<li>Monter les lames avec milieu de montage. Couvrir les lames avec des lamelles couvre-objet. ATTENTION : Le DAPI est toxique et dangereux ; il doit être manipulé avec soin et éliminé dans la bouteille de déchets dangereux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. fluorescence Microscopy
Remarque : Le protocole de coloration par immunofluorescence présenté ci-dessus permettra à SCs visualisation avec un microscope à champ large fluorescent ou confocal. Il peut être initialement difficile d’identifier les SCs. Voici quelques étapes recommandées qui peuvent être utiles.
<ol><li>Utiliser le canal DAPI et objectifs grossissement faible pour visualiser les sections sur les diapositives.</li>
	<li>Changer le grossissement de faible à élevé. Pour observer la SCs, au moins un objectif 20 X est nécessaire).</li>
	<li>Utilisez le cube double filtre pour 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) d’observer les Pax7 et laminine signale en même temps d’identifier les SCs. En vertu de cet arrangement, le signal de coloration Pax7 a un meilleur contraste avec le bruit de fond.</li>
	<li>Rapidement, remplaçant le canal de FITC à DAPI d’identifier correctement les SCs. Tous SCs devraient être Pax7/DAPI-positif.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole ci-dessus était fondé sur une méthode de coloration de Pax7/MF20 le poisson-zèbre muscle squelettique12. Les solutions utilisées et en bloquant les étapes sont identiques ou similaires. Les anticorps utilisés sont identiques. Les mesures rajustés reposaient sur les caractéristiques des tissus musculaires de souris et de SCs. Tout d’abord, laminine anticorps a été ajouté dans le mélange afin de visualiser et de confirmer la position de la SCs. Il a été particulièrement utile compter le...

Le muscle squelettique est composé de cellules musculaires multinucléées, appelé myotubes, organisé dans les fibres musculaires, qui génèrent des forces et mouvements par contraction. Plus les muscles squelettiques, à l’exception de certains muscles cranio-faciales, proviennent d’une structure embryonnaire temporaire appelée un somite1. Cellules précurseurs myogénique se délamineront depuis le somite épithélial pour devenir des myoblastes. Outre les myoblastes se différencient en myocytes qui se fusionnent pour devenir des myotubes pour former les myofibres multi nucléées. Le processus décrit ci-dessus est appelé myogenèse et se caractérise par réglementés dans le temps de contrôle de l’expression génique. Les précurseurs myogènes expriment Pax3 et Pax7, tandis que les myoblastes expriment MyoD et/ou myocytes et Myf5 express myogénine et myosines2,3. La croissance musculaire est un processus dans lequel les myofibres deviennent plus grandes incorpore plusieurs noyaux de fibres existantes (hyperplasie) et par une augmentation des fibres musculaires taille (hypertrophie)4. Au cours de la croissance musculaire, il y a une source durable de cellules myogènes ayant des propriétés de cellules souches qu’ils peuvent faire la différence et se renouveler. Ces cellules sont appelées cellules satellites basés sur leur emplacement physique entre le sarcolemme (membrane cellulaire de la fibre musculaire) et la lame basale5. SCs vigoureusement contribuent à la croissance musculaire dans le stade juvénile (les premières 2-3 semaines de souris après la naissance), mais devient quiescents au repos le muscle adulte6. Fait remarquable, elles peuvent être ré-activés en réponse à muscle blesse et se différencient en cellules de muscle nouveau de réparer le muscle lésé7.
Les propriétés de cellules souches font l’étude de SCs pertinentes pour la biologie de base musculaire et thérapies des maladies de muscle8. En conséquence, il a été un domaine de recherche intense dans les dernières décennies. Un énorme progrès ont été réalisés en disséquant la génétique et épigénétique de SCs9,10. Techniques intervenant dans l’isolement et l’identification SCs in situ ont été développés et optimisés le long de la voie11. Immunofluorescence permet l’identification de SCs grâce à l’utilisation des anticorps spécifiques, y compris celle pour Pax7. Toutefois, la rareté et la petite taille des SCs, combinée à une forte fluorescence-auto du tissu musculaire squelettique adulte rendent la visualisation difficile. Nous décrivons ici un protocole de coloration par immunofluorescence optimisé pour les tissus musculaires de souris pour Pax7 et basé sur une méthode existante pour le poisson-zèbre muscle12. En outre, un anticorps de laminine marqué avec un fluorophore distinct est utilisé pour identifier la couche basale, dans lesquelles se trouvent les SCs. Ce protocole permet toujours la visualisation de SCs Pax7 séropositifs et myogènes précurseurs dans des conditions physiologiques tous testées et stades de développement.

<table><tbody><tr><td>méthylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Température de coupe optimale (O.C.T.) composé</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16 % PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Chèvre Anti-Souris IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Tampon de citrate</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de souris Pax7 (IgG1) (surnageant)</td><td>Étude développementale Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Anticorps polyclonal de lapin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 Anticorps monoclonal de souris (IgG2b) (surnageant)</td><td>Étude développementale Hybridome Banque</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire à absorption croisée IgG1 anti-souris Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr> Anticorps <tr><td>secondaire à absorption croisée IgG2b Anticorps secondaire à absorption croisée Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée IgG (H+L) anti-Souris Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr>Cryostat <td></td><td></td><td></td><td>Leica CM1860</td></tr><tr>Microscope <td></td><td></td><td></td><td>fluorescent à grand champ Leica DM6000</td></tr><tr>Microscope <td></td><td></td><td></td><td>fluorescent à grand champ Leica DMR</td></tr><tr><td>Microscope confocal Zeiss LSM510 Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>confocal Zeiss LSM780</td></tr><tr><td>Autocuiseur</td><td></td> <td>électronique Cuisinart</td><td></td></tr></tbody></table>

identification des cellules satellites musculaires squelettiques par immunofluorescence avec des anticorps de laminine et pax7

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence est une méthode efficace qui aide à identifier les différents types de cellules sur des sections de tissu. Afin d’étudier la population de la cellule souhaitée, anticorps pour les marqueurs de cellules spécifiques sont appliqués sur des sections de tissu. Dans le muscle squelettique adulte, les cellules satellites (SCs) sont des cellules souches qui contribuent à la régénération et la réparation musculaire. Par conséquent, il est important de visualiser et de tracer la population de cellules satellites dans différentes conditions physiologiques. Dans le muscle squelettique au repos, SCs se trouvent entre la lame basale et la membrane plasmique de fibre musculaire. Un marqueur couramment utilisé pour identifier les SCs sur les myofibres ou en culture cellulaire est la protéine jumelé boîte Pax7. Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence Pax7 optimisé sur des coupes de muscle squelettique est présenté qui minimise la coloration non spécifiques et fond. Un autre anticorps qui reconnaît une protéine (laminine) de la lame basale a également été ajouté pour aider à identifier les protocoles SCs. Similar permet également d’effectuer le double ou triple marquage avec des anticorps pour des protéines d’intérêt et de Pax7.

Suivant les étapes ci-dessus, SCs peuvent être visualisées avec succès dans les sections de muscle au repos adultes sous un microscope à fluorescence (Figure 1). Bien que les tissus musculaires adultes a auto-fluorescence forte dans certain type de fibres, les colorants de série Alexa lumineux peuvent surmonter le bruit de fond et le signal se distingue (Figure 1 a, B; têtes de flèche). La microscopie confocale b...

L’identification précise des cellules satellites est essentielle pour l’étude de leurs fonctions dans des conditions physiologiques et pathologiques différents. Cet article présente un protocole pour identifier les cellules satellites sur des coupes de muscle squelettique adulte par axée sur l’immunofluorescence souillant.

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

L’objectif global de ce protocole est d’identifier les cellules satellites des muscles squelettiques adultes par immunofluorescence. Cette méthode peut répondre à des questions clés liées au nombre et à la distribution des cellules souches musculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de la technique est que l’on peut identifier les cellules souches musculaires dans leur environnement physiologique avec seulement une manipulation limitée.Faiza Naz, une postdoc de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez un bain d’azote liquide en versant de l’azote liquide dans une fiole de Dewar. Ensuite, versez 10 millilitres de méthylbutane dans un bécher en plastique de 20 millilitres et transférez le bécher dans le bain d’azote liquide.Posez le muscle tibial antérieur disséqué sur la surface plane d’un petit piston de seringue en plastique. Ensuite, couvrez le muscle disséqué avec quelques gouttes de composé à température de coupe optimale ou O.C.T.Retirez le bécher de méthylbutane du bain d’azote liquide, puis décongelez la surface à l’aide des poignées d’une paire de ciseaux. Trempez rapidement le tissu recouvert d’O.C.T. dans le méthylbutane fondu pour le congeler.Ensuite, à l’aide d’une pince, détachez le tissu incrusté du piston et transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, stockez le tube de microcentrifugation dans l’azote liquide. Pour commencer la coupe du cryostat, ajoutez une goutte de composé O.C.T. au centre du porte-échantillon d’un cryostat et laissez-le se solidifier partiellement.Ensuite, collez le tissu incrusté dans le composé O.C.T. avec la cheville vers le bas et le genou vers le haut. Ensuite, montez le porte-échantillon sur le cryostat et coupez le tissu à des intervalles de 10 micromètres. Prélevez quatre à huit cryosections sur chaque lame recouverte de givre.Séchez les sections à température ambiante pendant trois heures, puis rassemblez les lames dans une boîte à lames et rangez-les à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, retirez une diapositive de la boîte à diapositives et réchauffez-la à température ambiante. Ensuite, utilisez un stylo bloqueur de liquide pour marquer une zone autour des cryosections afin d’empêcher les liquides de s’écouler sur le côté.Dans une hotte, ajoutez 300 à 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % sur la zone marquée. Incuber la lame à température ambiante pendant 10 minutes pour fixer les sections. Ensuite, rincez le paraformaldéhyde de la lame avec du PBS dans un récipient à lames.Pour commencer la récupération de l’antigène, remplissez un récipient de lames avec 200 millilitres de tampon de citrate et transférez la lame dans le récipient. Ensuite, transférez le récipient de diapositives dans un autocuiseur à haute pression pendant 10 minutes. L’étape de récupération de l’antigène est facultative si les sections sont séchées à température ambiante pendant 30 minutes et se déroulent immédiatement.Dans ce cas, l’étape de récupération de l’antigène n’est pas nécessaire. Mais si les sections sont séchées à température ambiante pendant plus de trois heures, puis stockées à moins 80 degrés Celsius, l’étape de récupération de l’antigène est nécessaire. Ensuite, refroidissez le récipient de la diapositive sous l’eau courante pendant 10 minutes.Transférez ensuite la lame dans un nouveau récipient avec 200 millilitres de PBST et rincez avec du PBST. Ajoutez des lingettes de laboratoire imbibées d’eau dans le plateau, puis remarquez la lame rincée avec un stylo PAP et placez-la dans le plateau. Ajoutez 200 microlitres de solution de blocage sur la lame.Couvrez ensuite le plateau et laissez incuber à température ambiante pendant 30 minutes. L’étape de blocage est très importante car l’anticorps Pax7 utilisé est un anticorps monoclonal de souris. L’étape de blocage souris sur souris réduit les liaisons non spécifiques.Ensuite, rincez la lame avec du PBST dans le récipient à lames et remettez-la dans le plateau. Ajoutez 200 microlitres de mélange d’anticorps primaires dans la lame et incubez à température ambiante pendant une heure. Ensuite, rincez la lame avec du PBST, puis ajoutez 200 microlitres de mélange d’anticorps secondaires et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure.Après la période d’incubation, rincez la lame avec du PBST. Diluez le DAPI dans un récipient à lames et incubez la lame dans le récipient pendant trois minutes. Ensuite, rincez le DAPI avec du PBST pendant cinq minutes.Enfin, montez la diapositive avec un support de montage et appliquez une lamelle. Dans cette étude, les cellules satellites sont visualisées avec succès dans des sections de muscles adultes au repos au microscope fluorescent. Le bruit de fond généralement observé avec les tissus musculaires adultes et certains types de fibres est réduit en utilisant le blocage souris sur souris.Les signaux spécifiques de l’immunocoloration sont améliorés par l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à des colorants Alexa brillants. Un microscope confocal à deux photons capture une image plus nette que le microscope fluorescent à grand champ. Le même protocole peut également être appliqué aux tissus musculaires de souris juvéniles, d’embryons de souris et de tissus musculaires adultes blessés.Les tissus musculaires juvéniles et embryonnaires présentent davantage de cellules satellites activées ou de précurseurs myogéniques Pax7 avec des noyaux relativement plus grands. Ainsi, il devient plus facile de visualiser les cellules satellites des souris plus jeunes que des souris adultes. Dans le tissu musculaire lésé, davantage de cellules Pax7-positives activées sont visibles.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le bruit provenant de l’autofluorescence et de l’immunoliaison non spécifique souris sur souris ne peut pas être totalement éliminé, mais avec ce protocole, le bruit peut être considérablement réduit. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les cellules satellites dans les cryosections musculaires.

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