Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.

L’objectif global de cette procédure est de détecter avec précision l’agent pathogène du verdissement des agrumes Candidatus liberibacter spp. dans les tissus des feuilles d’agrumes. Cette méthode permet aux producteurs d’agrumes et aux chercheurs d’identifier rapidement et avec précision la présence d’un agent pathogène responsable du verdissement des agrumes.

La démonstration de la procédure sera assurée par Ian Palmer, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Cette méthode est efficace, rentable et adaptable à l’analyse quantitative. De plus, il peut être effectué avec un niveau minimum d’expérience et d’équipement de laboratoire.

Utilisez d’abord des ciseaux propres pour couper une feuille fraîche entière d’un agrume et placez-la dans un sac à sandwich en plastique propre. Ensuite, refroidissez un mortier et un pilon, en ajoutant une petite quantité d’azote liquide. Ensuite, utilisez les ciseaux pour couper de petits morceaux de tissu foliaire, d’une taille d’environ un pouce carré.

Placez les morceaux de feuilles dans le mortier pour les congeler immédiatement. Commencez rapidement à broyer le tissu foliaire avec le mortier, jusqu’à ce que l’azote liquide s’évapore et qu’il reste une fine poudre verte. Ensuite, refroidissez une spatule métallique dans de l’azote liquide, pendant 10 à 15 secondes.

Ensuite, à l’aide de la spatule froide, prélevez le tissu broyé du mortier dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 ml. À l’aide d’une pipette de 1000 ml, ajoutez 600 ml de solution de lyse des noyaux à l’échantillon. Ensuite, faites tourbillonner l’échantillon pendant une à trois secondes.

Incuber le tube à 65 degrés Celsius, dans un bain-marie pendant 15 minutes. Une fois la période d’incubation terminée, utilisez une pipette de 10 ml pour ajouter 3 ml de solution d’ARN au lycate pour éliminer l’ARN. Mélangez ensuite le contenu du tube en le retournant deux à cinq fois.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans une couveuse d’armoire. Après 15 minutes, ajoutez 200 ml de solution de précipitation de protéines à l’échantillon. Faites tourbillonner le tube à grande vitesse pendant 20 secondes.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000G pendant trois minutes. Au cours de la centrifugation, ajoutez 600 ml d’isopropanol, maintenu à température ambiante, dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml. Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement le surnageant du tube de centrifugation jusqu’au tube contenant l’isopropanol.

Jetez la pastille. Retournez le tube pour que l’ADN soit visible comme un fil. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000G pendant une minute à température ambiante.

Décanter le surnageant après centrifugation. Ajoutez ensuite 600 ml d’éthanol à 70 % au granulé. Retournez le tube plusieurs fois pour laver la pastille.

Centrifugez le tube à 13000G pendant une minute. Une fois la centrifugation terminée, aspirez soigneusement le surnageant. Ensuite, retournez le tube avec le couvercle ouvert sur un papier absorbant pour sécher à l’air libre pendant 15 minutes.

Une fois séché, ajoutez 100 ml de solution de réhydratation de l’ADN à la pastille. Incuber la suspension d’ADN à 65 degrés Celsius dans un bain d’eau pendant une heure. Tapotez périodiquement le tube pendant le mélange.

Ajouter 1ML d’eau purifiée dans une micro-cuvette. Lisez l’eau à blanc sur le spectrophotomètre. Ajoutez ensuite 1ML de l’échantillon dans la micro-cuvette.

Placez la micro-cuvette sur le spectrophotomètre, et obtenez la concentration en ADN. Constituez la réaction PCR en ajoutant tous les réactifs, et 100 nanogrammes d’ADN génomique dans un tube PCR de 50ML. Mélangez les réactifs en agitant doucement le tube, suivi d’une centrifugation rapide.

Placez le tube PCR dans le thermocycleur et lancez le programme. Pour préparer le gel d’agarose, pesez 0,4 gramme de poudre d’agarose. Ajoutez ensuite la poudre d’agarose dans un erlenmeyer de 200 ml, en ajustant le volume à 50 ml avec un tampon 1X TAE.

Cuire le mélange d’agarose au micro-ondes à puissance élevée pendant environ 1,5 minute. Agiter toutes les 30 secondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Ajoutez ensuite 2,5 ml de 10 milligrammes par millilitre de bromure d’éthidium à l’agarose liquide.

Ensuite, secouez le ballon pour mélanger le bromure d’éthidium et versez rapidement le gel d’agarose liquide dans un moule à gel plat. Insérez immédiatement un peigne en gel standard de 12 dents. Laissez refroidir le gel pendant environ 20 minutes à température ambiante, puis retirez le peigne en gel.

Placez maintenant le gel solidifié dans l’unité d’électrophorèse remplie de tampon 1X TAE. Chargez l’échantillon total d’ADN amplifié et 5 ml d’ADN plus tard dans des puits séparés sur le gel. Démarrez l’unité d’électrophorèse, à une tension constante de 90 volts pendant 35 minutes.

Retirez ensuite le gel de l’unité d’électrophorèse. Ensuite, placez le gel sur un transilluminateur UV. Capturez les photographies des motifs de bandes de gel dans le transilluminateur à 302 nanomètres.

Pour identifier la bactérie verdissante, les ADN génomiques amplifiés par PCR obtenus à partir d’échantillons infectés et non infectés sont électrophorés. Dans le gel, ces bandes correspondant à 500 paires de bases indiquent la présence d’une région spécifique de l’ADN ribosomique Las16S chez la bactérie CL asiaticas. Ces bandes correspondant à 700 paires de bases indiquent la présence de LAA2/LAJ5, et s’insèrent présents dans la séquence d’ADN du bêta-opéron ribosomique 16S de la bactérie.

Ces bandes distinctes à 400 paires de bases indiquent l’amplification du gène F-box des agrumes, qui fait référence au contrôle interne de l’amplification. Pour que nos résultats soient considérés comme valides, la présence de cette bande est requise. Au contraire, la présence d’une seule bande à 400 paires de bases, mais l’absence des autres bandes à 500 et 700 paires de bases indiquent un tissu d’agrumes sain.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures environ si elle est exécutée correctement. Cette procédure peut être adaptée pour permettre la mise en œuvre de méthodes plus quantitatives, telles que la RTQPCR, pour détecter la quantité d’agents pathogènes présentes.