Name: Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez une méthode PCR pour détecter précisément Candidatus liberibacter spp. dans les tissus foliaires d'agrumes. Cette technique efficace et économique aide les agriculteurs et chercheurs à identifier rapidement le pathogène responsable du greening des agrumes.

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Conceptualisation, H.C. et Z. Q. F. ; Enquête, H. C., J. C et Z. Q. F ; Ressources, Z. Q. F. ; Ecriture - projet Original, I. A. P. ; Rédaction-révision et édition, I. A. P., j. C., C. H., S. L. T. et Z. Q. F. ; Visualisation, H. C. ; Supervision, Z. Q. F. ; Financement d’Acquisition, Z. F. Q. et F. Q. L.
Projet soutenu par une South Carolina améliorer enseignant qualité enseignement supérieur État subvention intitulée amélioration Middle Grades Science Teachers' connaissance des procédés de l’usine, Structures et fonctions grâce à l’Engagement in Plant Sciences Research (plante Science)
Fonds alloués par la United États Department of Education (CFDA numéro 84.367B)
Les auteurs tiennent à remercier m. Nian Wang de l’Université de la Floride pour fournir des échantillons d’ADN génomiques d’infecté Citrus sinensis Valencia.

1. isoler l’ADN génomique du tissu végétal à l’aide d’un Kit d’Extraction génomique
<ol><li>Obtenir des tissus foliaires agrumes en coupant une toute nouvelle feuille d’un arbre d’agrume à l’aide de ciseaux propres et placer la feuille dans un sac à sandwich en plastique. Remarque : Le sac contenant les tissus foliaires doit être placé dans un réfrigérateur à 4 ° C ou sur la glace dans un contenant isotherme dès que possible après le prélèvement pour éviter la détérioration.</li>
	<li>Ajouter une petite quantité d’azote liquide pour refroidir un mortier et un pilon. Alors qu’ils sont froid, utiliser des ciseaux pour découper un petit morceau de tissus foliaires, environ 1 pouce carré en taille. Placez le tissu coupé dans le mortier de le figer instantanément. Ajouter plus d’azote liquide, si nécessaire. Remarque : Des gants doivent toujours être portées lors de la manipulation de l’azote liquide.</li>
	<li>Rectifier rapidement les tissus végétaux en une fine poudre à l’aide de mortier. Continuer de meulage jusqu'à ce que l’azote liquide s’évapore complètement, et reste une fine poudre verte.</li>
	<li>Brièvement refroidir une spatule métallique dans l’azote liquide pour 10-15 s, puis verser le tissu fondamental dans le mortier dans un tube de microtubes de 1,5 mL, à l’aide de la spatule.</li>
	<li>Ajouter 600 µL de Solution de lyse des noyaux (voir Table des matières) en utilisant un 1000 µL pipette et vortex l’échantillon pour 1-3 s, puis incuber dans un bain-marie à 65 ° C pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 3 µL de Solution de RNase au lysat en utilisant une pipette de 10µL, inverser le tube 2 - 5 fois pour mélanger et laisser incuber à 37 ° C dans une étuve armoire pendant 15 min. Remarque : Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de procéder.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de Solution de précipitation de protéine, vortex à haute vitesse pendant 20 s, puis centrifuger pendant 3 min à 13 000 x g pour former une boulette de la ferme. Alors que l’échantillon est être centrifugé, ajouter 600 µL d’isopropanol de température ambiante à un tube de microcentrifuge frais de 1,5 mL.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 1000 µL, retirer délicatement le surnageant de l’échantillon centrifugé, transférant dans le tube de microcentrifuge de frais 1,5 mL contenant l’isopropanol. Le plomb peut maintenant être jeté. NOTE : Éviter la contamination du surnageant avec protéines en laissant une quantité minuscule de surnageant au-dessus du culot.</li>
	<li>Inverser le tube jusqu'à ce que l’ADN devient visible comme une masse de brins filiformes, puis centrifuger à 13 000 x g pendant 1 min à température ambiante.</li>
	<li>Décanter le liquide surnageant, ajouter 600 µL d’éthanol à 70 % au culot, inverser le tube plusieurs fois pour laver l’ADN et centrifuger à 13 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Aspirer l’éthanol, laissant le granule d’ADN lâche, puis ouvrir et inverser le tube, reposant sur du papier absorbant. Sécher à l’air à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de Solution de réhydratation d’ADN au culot ADN séché, puis incuber l’ADN dans un bain d’eau de 65 ° C pendant 1 h, tout en mélangeant régulièrement, en tapant sur le tube.</li>
	<li>Déposer sur une cuvette 1 µL d’eau purifiée et l’insérer dans un spectrophotomètre à utiliser comme un blanc. Calculer la concentration d’ADN présent en plaçant 1 µL de l’échantillon sur la cuvette et en insérant dans le spectrophotomètre. Concentration d’ADN (ng/µL) peut être calculé comme (un260- un320) × facteur de dilution × 50 ng/µL. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. L’échantillon peut être conservée à 4 ° C.</li>
</ol>2. effectuer la PCR sur des échantillons d’ADN génomique
<ol><li>Combiner les 10 µL 2 x PCR Master Mix (voir Table des matières), 1 µL avant l’apprêt (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorces), 100 ng d’ADN génomique extrait de l’échantillon et purifié l’eau (volume final de jusqu'à 20 µL) dans un 50 µL PCR tube, flick pour mélanger et brièvement centrifugeuse.</li>
	<li>Insérez le tube de la PCR dans le thermocycleur et dirigent en conséquence (voir tableau 1). Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Si nécessaire, stocker l’échantillon à 4 ° C après que la réaction est terminée.</li>
</ol>3. electrophorese de l’amplification de l’ADN dans un Gel d’Agarose
<ol><li>Peser la poudre de 0,4 g d’agarose et ajoutez-le ainsi que 1 x TAE tampon dans un 200 mL fiole d’Erlenmeyer, remplissage à 50 mL.</li>
	<li>Micro-ondes à température élevée pendant 1,5 min, secouant toutes les 30 s, jusqu'à ce que le gel d’agarose est entièrement dissous. NOTE : Des gants doivent être portés pendant la manutention des liquides d’agarose pour éviter les brûlures.</li>
	<li>Ajouter 2,5 µL de bromure d’éthidium 10 mg/mL pour les liquides d’agarose et secouez pour mélanger, puis verser le gel d’agarose liquide dans un moule de gel de niveau. Insérer rapidement des peignes standard 12 dents gel après coulée.</li>
	<li>Laisser le refroidir pendant 20 min à température ambiante, puis enlever le gel de peignes et placer le gel dans une boîte de gel niveau remplie avec 1 tampon x TAE.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, charger les échantillons d’ADN amplifiés totales dans le puits. Ajouter 5 µL de l’ADN d’échelle (voir Table des matières) dans un endroit bien distinct de vos échantillons.</li>
	<li>ELECTROPHORESE des échantillons pour 35 min à une température constante de 90 V, puis retirer le gel et les placer dans un Transilluminateur UV.</li>
	<li>Photographier et d’analyser le gel des bandes modèle tout en utilisant la transillumination UV à 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Chang Ming, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu et Zheng Qing Fu ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Il est essentiel que toutes les étapes sont suivies exactement pour obtenir les meilleures conditions expérimentales. Feuilles entières a été utilisé au cours de cette manifestation ; Toutefois, le protocole peut être modifié pour inclure théoriquement n’importe quel type de tissus végétaux. Auparavant, les chercheurs ont extrait l’ADN génomique de veine les tissus foliaires, plutôt que des tissus de feuilles entières et obtenu des résultats similaires11. Si la bande correspondant au gène FBOX...

Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, a causé une perte importante de citronniers. Un cas représentatif est en Floride, où la maladie est prévue pour causer une réduction de 70 % dans la production de boîtes de Florida orange de 244 millions de boîtes dans la saison 1997-1998 à 70 millions de boîtes à partir de la saison 2016-20171. Plus de 90 % des agrumes en Floride sont infectés2, et on estime que l’industrie des agrume Floride perd environ 1 milliard de dollars chaque année en raison de maladies agrumes, dans lequel les citrus greening joue un rôle de premier plan3. Citrus greening se propage principalement par l’envahissant psylle agrume asiatique Diaphorina citri, mais peut également se propager par la greffe de tissus infectés. La maladie provoque le jaunissement des nervures, feuille jaune asymétrique marbrures, défoliation prématurée, brindille dépérissement, pourriture de la racine et mort de la plante. Ce qui est important, la maladie provoque la plante agrume à produire des fleurs hors saison, qui produisent rarement des fruits. Le fruit qui est produit par les plantes agrumes infectés est immatures, vert et amer dégustation4.
Le but de cette méthode est à avec précision et identifier précisément la bactérie motile Candidatus liberibacter spp., l’agent causal de citrus greening, vivant dans le phloème d’arbres agrumes infectés5. L’ADN génomique est extraite des tissus des feuilles entières, qui contient des bactéries vivantes. Cet extrait d’ADN génomique est utilisé comme modèle pour la PCR classique, où des oligonucléotides complémentaires à la séquence de l’ADNr 16 s de la bactérie sont utilisées pour amplifier cette séquence. Des oligonucléotides complémentaires à un gène FBOX agrume sont utilisés comme un témoin d’amplification interne. Nous avons choisi d’utiliser cette méthode, car il a été prouvé pour réussir dans la recherche précédente6.
Cette méthode a l’avantage d’être simple, relativement peu coûteux et apte à être jouée dans n’importe quel laboratoire de biochimie normalement équipée. En outre, la PCR reste la méthode plus précise et exacte pour la détection de ce pathogène, en raison de la difficulté de cultiver ce pathogène7et la capacité de l’agent pathogène pour survivre et se reproduire pendant des années au sein d’un hôte asymptomatiques8. Nombreux essais PCR de spécialité différents ont été utilisés pour détecter avec succès ce pathogène ; Cependant, PCR classique reste le plus simple test pour la détection précise et spécifique, en particulier dans les hôtes asymptomatiques8.

<table><tbody><tr><td>Wizard Kit de purification d’ADN génomique</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Source de lyse des noyaux, RNase, précipitation des protéines et solutions de réhydratation de l’ADN</td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro avec panneau de commande</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Micro-ondes</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 bain-marie numérique</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Spatule en métal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Mortier et pilon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 10 &mu ; Embouts L</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 200 &mu ; Embouts L</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 1250 &mu ; Embouts L</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pipette à volume variable</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu ; cuvette</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de coulée empilable et peignes</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentation de base</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospectromètre de base</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL Tubes PCR</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Water, PCR grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ Échelle d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

spécifique et une détection précise de using pcr classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes citrus greening pathogène candidatus liberibacter spp.

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, est une maladie agrume destructeur ravage fermes agrumes dans le monde. Cette maladie provoque la feuille jaune asymétrique marbrures, jaunissement de la veine, défoliation, pourriture de la racine et en fin de compte, la mort de la plante agrume. Lorsque infecté, les agrumes ont un retard de croissance et produisent des fleurs hors saison. Ces fleurs donnent rarement des fruits, et ceux qui donneront agrumes petit, amer, de forme irrégulière qui ne sont pas souhaitables. Cette maladie se propage par le psylle agrume asiatique, Diaphorina citri et par la greffe de tissus agrumes infectés. L’agent pathogène a une incubation longue et variable au sein de l’usine agrume — parfois années, avant l’apparaissent des symptômes. Tentatives de culture ce pathogène in vitro n’ont pas réussis, peut-être en raison de la faible et inégale concentration de l’agent pathogène dans les infectés tissu agrume, ou parce qu’il est difficile de reproduire l’environnement conditions propice à la croissance de l’agent pathogène. Il est très difficile d’identifier la maladie avant elle s’est répandue, en raison de sa longue période d’incubation et l’incapacité des chercheurs à la culture de l’agent pathogène. En conséquence, la maladie ne devient apparente après avoir détruit soudainement rendement entier d’agrumes de l’agriculteur. Présenté ici est une méthode pour la détection précise et spécifique de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp., à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique et de la PCR. Cette méthode est simple, efficace, rentable et adaptable pour l’analyse quantitative. Cette méthode peut être adaptée pour une utilisation sur n’importe quel tissu agrume ; Toutefois, il est potentiellement limitée par la quantité d’agents pathogènes présents dans les tissus. Néanmoins, cette méthode permettra d’agrumes aux agriculteurs d’identifier plus tôt les agrumes infectés et freiner la propagation de cette maladie destructrice avant elle peut se propager plus loin.

Un résultat positif donne une bande distincte correspondant à 500 bp pour Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, et/ou une bande distincte correspondant à 700 bp pour Laa2/Laj5, un encart dans le β ribosomique 16 s opéron9. La bande de contrôle de l’amplification interne doit également apparaître à 400 bp. Cette bande correspond à l’amplification du gène FBOX agrumes10</s...

Citrus Greening est une maladie particulièrement destructeur qui affectent les cultures agrumes dans le monde. Présenté ici est une méthode simple à l’aide de PCR et l’extraction d’ADN génomique du tissu foliaire agrumes pour l’identification exacte et précise de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

L’objectif global de cette procédure est de détecter avec précision l’agent pathogène du verdissement des agrumes Candidatus liberibacter spp. dans les tissus des feuilles d’agrumes. Cette méthode permet aux producteurs d’agrumes et aux chercheurs d’identifier rapidement et avec précision la présence d’un agent pathogène responsable du verdissement des agrumes.La démonstration de la procédure sera assurée par Ian Palmer, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Cette méthode est efficace, rentable et adaptable à l’analyse quantitative. De plus, il peut être effectué avec un niveau minimum d’expérience et d’équipement de laboratoire.Utilisez d’abord des ciseaux propres pour couper une feuille fraîche entière d’un agrume et placez-la dans un sac à sandwich en plastique propre. Ensuite, refroidissez un mortier et un pilon, en ajoutant une petite quantité d’azote liquide. Ensuite, utilisez les ciseaux pour couper de petits morceaux de tissu foliaire, d’une taille d’environ un pouce carré.Placez les morceaux de feuilles dans le mortier pour les congeler immédiatement. Commencez rapidement à broyer le tissu foliaire avec le mortier, jusqu’à ce que l’azote liquide s’évapore et qu’il reste une fine poudre verte. Ensuite, refroidissez une spatule métallique dans de l’azote liquide, pendant 10 à 15 secondes.Ensuite, à l’aide de la spatule froide, prélevez le tissu broyé du mortier dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 ml. À l’aide d’une pipette de 1000 ml, ajoutez 600 ml de solution de lyse des noyaux à l’échantillon. Ensuite, faites tourbillonner l’échantillon pendant une à trois secondes.Incuber le tube à 65 degrés Celsius, dans un bain-marie pendant 15 minutes. Une fois la période d’incubation terminée, utilisez une pipette de 10 ml pour ajouter 3 ml de solution d’ARN au lycate pour éliminer l’ARN. Mélangez ensuite le contenu du tube en le retournant deux à cinq fois.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans une couveuse d’armoire. Après 15 minutes, ajoutez 200 ml de solution de précipitation de protéines à l’échantillon. Faites tourbillonner le tube à grande vitesse pendant 20 secondes.Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000G pendant trois minutes. Au cours de la centrifugation, ajoutez 600 ml d’isopropanol, maintenu à température ambiante, dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 ml. Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement le surnageant du tube de centrifugation jusqu’au tube contenant l’isopropanol.Jetez la pastille. Retournez le tube pour que l’ADN soit visible comme un fil. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000G pendant une minute à température ambiante.Décanter le surnageant après centrifugation. Ajoutez ensuite 600 ml d’éthanol à 70 % au granulé. Retournez le tube plusieurs fois pour laver la pastille.Centrifugez le tube à 13000G pendant une minute. Une fois la centrifugation terminée, aspirez soigneusement le surnageant. Ensuite, retournez le tube avec le couvercle ouvert sur un papier absorbant pour sécher à l’air libre pendant 15 minutes.Une fois séché, ajoutez 100 ml de solution de réhydratation de l’ADN à la pastille. Incuber la suspension d’ADN à 65 degrés Celsius dans un bain d’eau pendant une heure. Tapotez périodiquement le tube pendant le mélange.Ajouter 1ML d’eau purifiée dans une micro-cuvette. Lisez l’eau à blanc sur le spectrophotomètre. Ajoutez ensuite 1ML de l’échantillon dans la micro-cuvette.Placez la micro-cuvette sur le spectrophotomètre, et obtenez la concentration en ADN. Constituez la réaction PCR en ajoutant tous les réactifs, et 100 nanogrammes d’ADN génomique dans un tube PCR de 50ML. Mélangez les réactifs en agitant doucement le tube, suivi d’une centrifugation rapide.Placez le tube PCR dans le thermocycleur et lancez le programme. Pour préparer le gel d’agarose, pesez 0,4 gramme de poudre d’agarose. Ajoutez ensuite la poudre d’agarose dans un erlenmeyer de 200 ml, en ajustant le volume à 50 ml avec un tampon 1X TAE.Cuire le mélange d’agarose au micro-ondes à puissance élevée pendant environ 1,5 minute. Agiter toutes les 30 secondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Ajoutez ensuite 2,5 ml de 10 milligrammes par millilitre de bromure d’éthidium à l’agarose liquide.Ensuite, secouez le ballon pour mélanger le bromure d’éthidium et versez rapidement le gel d’agarose liquide dans un moule à gel plat. Insérez immédiatement un peigne en gel standard de 12 dents. Laissez refroidir le gel pendant environ 20 minutes à température ambiante, puis retirez le peigne en gel.Placez maintenant le gel solidifié dans l’unité d’électrophorèse remplie de tampon 1X TAE. Chargez l’échantillon total d’ADN amplifié et 5 ml d’ADN plus tard dans des puits séparés sur le gel. Démarrez l’unité d’électrophorèse, à une tension constante de 90 volts pendant 35 minutes.Retirez ensuite le gel de l’unité d’électrophorèse. Ensuite, placez le gel sur un transilluminateur UV. Capturez les photographies des motifs de bandes de gel dans le transilluminateur à 302 nanomètres.Pour identifier la bactérie verdissante, les ADN génomiques amplifiés par PCR obtenus à partir d’échantillons infectés et non infectés sont électrophorés. Dans le gel, ces bandes correspondant à 500 paires de bases indiquent la présence d’une région spécifique de l’ADN ribosomique Las16S chez la bactérie CL asiaticas. Ces bandes correspondant à 700 paires de bases indiquent la présence de LAA2/LAJ5, et s’insèrent présents dans la séquence d’ADN du bêta-opéron ribosomique 16S de la bactérie.Ces bandes distinctes à 400 paires de bases indiquent l’amplification du gène F-box des agrumes, qui fait référence au contrôle interne de l’amplification. Pour que nos résultats soient considérés comme valides, la présence de cette bande est requise. Au contraire, la présence d’une seule bande à 400 paires de bases, mais l’absence des autres bandes à 500 et 700 paires de bases indiquent un tissu d’agrumes sain.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures environ si elle est exécutée correctement. Cette procédure peut être adaptée pour permettre la mise en œuvre de méthodes plus quantitatives, telles que la RTQPCR, pour détecter la quantité d’agents pathogènes présentes.

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Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

Source : Gulla, S., et al. Analyse en tandem à nombre variable multi-locus de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri par PCR multiplex et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019).Ce protocole extrait l’ADN génomique de Yersinia ruckeri en suspendant les colonies isolées dans de l’eau ultrapure et en appliquant de la chaleur pour lyser les cellules. La centrifugation sépare le surnageant contenant de l’ADN des débris cellulaires, produisant ainsi de l’ADN modèle adapté au...

Extraction d’ADN génomique à partir de tissu foliaire végétal infecté par des bactéries pathogènes

Source : Chen, H., et al. Détection spécifique et précise du pathogène de la verdissement, candidat liberibacter spp., à l’aide de la PCR conventionnelle sur des échantillons de tissu de feuilles d’agrumes. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre l’extraction de l’ADN génomique total à partir de tissu foliaire d’agrumes infecté par une bactérie pathogène. Le protocole permet une récupération fiable de l’ADN pour la détection en aval basée sur PCR du pathogène limité par le phloème.

Extraction de l’ADN total des feuilles pour la détection d’une infection bactérienne

La quantification de la croissance des agents pathogènes est un outil puissant pour caractériser diverses réponses immunitaires d’Arabidopsis thaliana (ci-après : Arabidopsis). La méthode décrite ici présente un test d’infiltration à la seringue optimisé pour quantifier le Pseudomonas syringae pv. maculicola Croissance d’ES4326 dans les feuilles adultes d’Arabidopsis.

Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l&#39;aide du<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystème

PCR nichée est une technique sensible, spécifique et simple qui peut être appliquée aux tiques QU'ADN extraits pour sonder pour Borrelia burgdorferi, l’agent causal de la maladie de Lyme. La première expérience PCR utilise des amorces de gène-spécifique pour générer des amplicons longs, qui deviennent alors des modèles pour une réaction à l’aide d’amorces internes.

Détecter le Spirochete de la maladie de Lyme, Borrelia Burgdorferi, chez les tiques à l’aide de la PCR nichée

Cet article présente le protocole pour une identification rapide pour Bemisia tabaci , basé sur la technologie d’amplification isotherme boucle-négociée (lampe). Le protocole nécessite une formation minimale de laboratoire et peut, par conséquent, être mis en œuvre sur place aux points d’entrée pour les importations de végétaux tels que les ports et aéroports.

Un test d’Amplification isotherme (lampe) médiée par la boucle pour une Identification rapide de Bemisia tabaci

Nous avons développé une méthode pour détecter phytophthora capsici zoospores dans les sources d’eau à l’aide d’une méthode d’extraction d’ADN de papier filtre couplée à un test d’amplification isothermique (LAMP) à médiation en boucle qui peut être analysé sur le terrain ou en laboratoire.

Détection de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide de l’amplification isothermique en loop-Mediated

Dans ce travail, une méthode de détection rapide, sensible et portable pour Candidatus Liberibacter asiaticus basée sur l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a a été développée.

Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a

Nous avons conçu, fabriqué et validé un instrument qui traite rapidement les tissus de bourgeons d’agrumes riches en phloème. Par rapport aux méthodes actuelles, l’extracteur de tissus de bourgeons (BTE) a permis d’augmenter le débit d’échantillons et de réduire les coûts de main-d’œuvre et d’équipement requis.

Automatisation du traitement des bourgeons d’agrumes pour la détection des agents pathogènes en aval grâce à l’ingénierie des instruments

Ce manuscrit décrit un nouveau dispositif d’infusion directe de plantes pour cribler l’efficacité de molécules contre la bactérie (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou son insecte vecteur (Diaphorina citri, Kuwayama) qui, en combinaison, sont associées à la maladie des agrumes de Huanglongbing.

DISPOSITIF DE PERFUSION DIRECTE POUR ADMINISTRATION DE MOLÉCULES DANS LES PLANTES

Dans ce protocole, un test combiné d’amplification de la recombinase polymérase CRISPR/Cas12a est illustré pour la détection de l’agent pathogène envahissant des plantes, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Amplification combinée de la recombinase polymérase Essai CRISPR/Cas12a pour la détection de Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Ici, nous décrivons une procédure simple et rapide pour détecter l’ADN d’agents pathogènes d’abeilles, tels que Lotmaria passim et Nosema ceranae, à l’aide d’une lyse cellulaire prête à l’amplification, d’une amplification par polymérase recombinase et de tests CRISPR/Cas12a.

Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a

Découvrez une méthode PCR pour détecter précisément Candidatus liberibacter spp. dans les tissus foliaires d'agrumes. Cette technique efficace et économique aide les agriculteurs et chercheurs à identifier rapidement le pathogène responsable du greening des agrumes.

Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp. (Vidéo) | JoVE Journal

Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.

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