Un test Flow Cytometry d’identifier des composés qui perturbent la fixation du Ligand de chimiokines CXC fluorescent marqué 12 au récepteur de chimiokines CXC 4
10 mars 2018
Une coulée d’essai de liaison cellulaire axée sur la cytométrie en flux est décrite qui est principalement utilisée comme outil de dépistage pour identifier les composés qui inhibent la fixation d’un ligand de chimiokines CXC fluorescent étiquetée 12 (CXCL12) pour les récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4).
L’objectif global du test cellulaire est d’identifier les molécules qui se lient à un récepteur couplé à la protéine G. Basé sur leur capacité à rivaliser avec un ligand marqué par fluorescence pour se lier au récepteur. Le test de liaison à la compétition peut soutenir la découverte de médicaments à récepteurs couplés aux protéines G.
Comme nous allons le démontrer avec ce protocole pour le récepteur des chimiokines, CXC4. Le principal avantage de cette méthode est que les cellules vivantes sont utilisées pour analyser la liaison réceptive au lieu des préparations de mémoire. Et que l’utilisation de sondes de marquage de radioactivité est évitée.
Bien que cette méthode ait été initialement mise en place pour étudier la liaison au récepteur de chimiokine CXCR4, elle peut également être développée pour d’autres RCPG pour lesquels il existe des ligands marqués par fluorescence. Pour commencer, distribuez 100 microlitres de solution composée dans une plaque inférieure transparente de 96 bien arrondie, selon un plan expérimental prédéfini. Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire d’un réservoir de réactif dans la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
Incuber la plaque pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de 100 nanogrammes par millilitre de CXCL12 marqués par fluorescence à partir d’un réservoir de réactifs similaire dans les puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Ensuite, centrifugez la plaque de 96 puits à 400 fois la gravité pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez le surnageant des cellules granulées en retournant la plaque. Séchez l’assiette sur un mouchoir en papier.
Ajoutez 200 microlitres de tampon SA frais à partir d’un réservoir de réactifs dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Procédez immédiatement à la centrifugation de la plaque pendant cinq minutes à 400 fois la gravité à température ambiante. Retirez à nouveau le surnageant, en retournant la plaque puis en la séchant sur un mouchoir.
Enfin, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de 1 % de paraformaldéhyde dissous dans du PBS. Cette étape permettra de réparer les cellules. Pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, démarrez l’appareil et ouvrez le logiciel correspondant.
Sélectionnez les paramètres cellulaires à visualiser dans un format de bloc de points, comme la zone de diffusion directe, la zone de diffusion latérale et, dans une vue histogramme, le canal de détection fluoro quatre. Choisissez un échantillon. Par exemple, un échantillon de contrôle négatif, pour effectuer le contrôle d’une population cellulaire homogène définie en fonction des paramètres de diffusion directe et de diffusion latérale.
Adaptez les paramètres de chargement des cellules dans l’appareil de cytométrie en flux. Sélectionnez trois mélanges avant l’injection. Sélectionnez l’injection automatique de 100 microlitres de cellules fixées et utilisez un débit d’échantillon de 1,5 microlitre par seconde.
Exécutez l’exemple en sélectionnant Acquérir des données. Les paramètres de diffusion directe et de diffusion latérale pour cet échantillon, ainsi que la détection fluoro quatre, apparaîtront désormais à l’écran. Maintenant, sélectionnez l’outil de contrôle logiciel.
Sur la base de la visualisation du diagramme de points de diffusion directe et de dispersion latérale, prédéfinissez une population cellulaire homogène et viable par porte. Sélectionnez cette option pour analyser 20 000 événements par échantillon. Cela signifie que pour chaque échantillon, 20 000 cellules qui se trouvent dans des portes prédéfinies seront finalement analysées.
L’acquisition des données se poursuivra jusqu’à ce que ce nombre d’événements soit atteint. Commencez la course en sélectionnant d’abord, les puits à analyser. Sélectionne ensuite les puits d’exécution.
L’appareil de cytométrie en flux analysera maintenant ces échantillons un par un, en enregistrant l’intensité moyenne de fluorescence de chaque échantillon. Ce qui correspond au signal fluorescent moyen des 20 000 cellules qui se trouvent à l’intérieur de la porte prédéfinie. Enfin, effectuez l’analyse des données comme décrit dans le protocole.
Après pré-incubation de cellules jurkat avec des concentrations élevées d’antagonistes AMD3100, non établis et spécifiques de CXCR4. L’intensité moyenne de fluorescence qui reflète la liaison de CXCL12 marqué est presque entièrement réduite aux niveaux de fond. Cela démontre la liaison hautement spécifique de CXCL12 à CXCR4 exprimée sur les cellules jurkat.
Les composés qui ne peuvent pas rivaliser avec CXCL12 marqué pour la liaison au récepteur CXCR4, comme l’antagoniste de CCR5 Maraviroc, n’affecteront pas l’intensité moyenne de la fluorescence. En revanche, les composés hautement actifs le feront de manière dose-dépendante. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de liaison réceptive de compétition à l’aide de cellules vivantes et de cytométrie en flux.
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Aperçu
Cet article décrit un test d'interaction cellulaire basé sur la cytométrie en flux, conçu pour identifier des composés capables d'inhiber la liaison de CXCL12 à CXCR4. La méthode utilise des cellules vivantes pour analyser la liaison au récepteur, évitant ainsi le recours à des marquages radioactifs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Essais de liaison cellulaire
- Récepteurs couplés aux protéines G
- Découverte de médicaments
Contexte
- La CXCL12 est une chimioattractine qui se lie au CXCR4, un récepteur couplé aux protéines G.
- La mise en évidence d'inhibiteurs de cette liaison peut faciliter le développement de médicaments.
- Les méthodes traditionnelles impliquent souvent l'utilisation de radioactivité, ce que ce test cherche à éviter.
- L'utilisation de cellules vivantes fournit une représentation plus précise des interactions biologiques.
Objectif de l'étude
- Développer un outil de criblage pour identifier les composés qui inhibent la liaison de CXCL12 à CXCR4.
- Mettre en évidence les avantages de l'utilisation de cellules vivantes dans les tests de liaison.
- Appuyer les efforts de découverte de médicaments ciblant les récepteurs couplés aux protéines G.
Méthodes utilisées
- Cytométrie en flux pour analyser la liaison cellulaire.
- Utilisation de ligands marqués avec un fluorochrome pour évaluer la compétition de liaison.
- Essais sur cellules vivantes pour évaluer les interactions réceptrices.
- Éviter le marquage radioactif dans le montage expérimental.
Résultats principaux
- Le test identifie avec succès les composés qui inhibent la liaison de CXCL12.
- L'analyse de cellules vivantes fournit des données plus pertinentes par rapport aux méthodes traditionnelles.
- La méthode est efficace pour le criblage de candidats médicaments potentiels.
- Les résultats soutiennent la faisabilité d'utiliser ce test dans la découverte de médicaments.
Conclusions
- Le test basé sur la cytométrie en flux est un outil précieux pour identifier les inhibiteurs de CXCR4.
- L'utilisation de cellules vivantes améliore la précision des études de liaison.
- Éviter la radioactivité simplifie le processus expérimental.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce test de liaison compétitive basé sur la cytométrie en flux permet aux équipes de biopharmacie d'identifier des petites molécules qui perturbent les interactions entre CXCL12 et CXCR4, une cible clé dans les programmes de recherche en oncologie et dans les maladies inflammatoires. En utilisant des cellules vivantes et des ligands fluorescents, cette méthode évite l'utilisation de radioactivité tout en fournissant des données de liaison physiologiquement pertinentes. Elle facilite la validation précoce de cibles thérapeutiques et l'identification de composés candidats en produisant des résultats quantitatifs et reproductibles pour le classement des composés.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en mesurant les effets directs d'un composé sur la liaison récepteur-ligand dans un contexte cellulaire natif.
- Valeur opérationnelle : Fournit un indicateur fonctionnel qui réduit les risques associés à CXCR4 comme cible, grâce à la confirmation mécanistique de l'activité du composé.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en identifiant les composés présentant des profils d'inhibition dépendants de la dose, indicatifs d'une interaction avec la cible.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives d'inhibition de la liaison par intensité de fluorescence moyenne, permettant une analyse des relations structure-activité.
- Valeur opérationnelle : Adaptable au format de plaque 96 puits, augmentant le débit pour les campagnes de criblage tout en maintenant la reproductibilité du test.
- Reproductibilité : Établit une plateforme standardisée applicable à d'autres récepteurs couplés aux protéines G lorsque des ligands fluorescents sont disponibles, réduisant les efforts de redéveloppement.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Utilise des cellules Jurkat vivantes pour refléter l'expression physiologique des récepteurs et les dynamiques de liaison, améliorant ainsi la pertinence translationnelle.
- Valeur opérationnelle : Génère des données compatibles avec l'évaluation préclinique en aval en confirmant les effets spécifiques des composés sur la cible.
- Atténuation des risques : Réduit les faux positifs en distinguant les inhibiteurs spécifiques de CXCR4 des composés non spécifiques (par exemple, le maraviroc n'exerce aucun effet).
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, en fournissant des données de liaison qui éclairent la progression du « hit » au composé précurseur. Il complète le criblage phénotypique en ajoutant une profondeur mécanistique à la caractérisation des composés.
- Découverte biologique : Permet la vérification d'hypothèses en quantifiant la perturbation induite par un composé du lien entre la CXCL12 et le CXCR4 dans des cellules vivantes.
- Criblage : Assure la préparation de tests grâce à des étapes normalisées d'incubation, de lavage et de fixation, compatibles avec des lectures par cytométrie en flux.
- Analyse : Fournit l'intensité moyenne de fluorescence comme paramètre quantitatif permettant de comparer la puissance et l'efficacité des composés à différentes concentrations.
- Recherche translationnelle : Utilise une lignée cellulaire pertinente pour la maladie (Jurkat) exprimant le CXCR4, reliant ainsi les données de liaison à un impact thérapeutique potentiel dans le cancer et l'inflammation.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme modulaire de liaison transférable à d'autres cibles GPCR, maximisant le retour sur investissement dans le développement d'analyses.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive de l'interaction avec la cible en démontrant une liaison spécifique et déplaçable du CXCL12 au CXCR4.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de manipulation des cellules, de durées d'incubation et de seuils d'analyse en cytométrie de flux.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en éliminant précocement dans le processus de découverte les composés dépourvus d'activité spécifique à la cible.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression ajustée au risque en identifiant les composés présentant des profils d'inhibition clairement dépendants de la dose.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux, notamment en matière de compensation et de stratégies de sélection des populations cellulaires viables.
- Dépend de l'accès à des cytomètres en flux capables de détecter des signaux fluorescents dans le canal approprié (par exemple, FITC ou équivalent).
- Exige une standardisation de la préparation des cellules, de la dilution des composés et des conditions d'incubation entre les différents lots d'analyse.
- L'adaptation à d'autres récepteurs couplés aux protéines G nécessite la conception ou l'acquisition de ligands marqués par fluorescence spécifiques au récepteur cible.
- Les limites pratiques incluent la durée du test (~90 minutes, plus le temps d'analyse) et la nécessité d'optimiser la concentration du ligand afin d'assurer des rapports signal sur bruit robustes.
