Name: 蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーを用いたCXCL12とCXCR4の結合阻害化合物のスクリーニング法。生細胞を使用し放射性標識を避け、Gタンパク質共役受容体の創薬研究を支援する競合結合アッセイの手法です。

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著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーンを感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。

1. 培養細胞のメンテナンス
注: 1 と 2 で説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。
<ol><li>加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコのセルを育てます。 注: このアッセイで Jurkat 細胞 (すなわち、内生表現 CXCR417ひと白血病細胞の T リンパ球細胞) が使用されます。CXCR4 の細胞表面での発現をフローサイトメトリーによる細胞培養中で評価されるべき。流れ cytometry プロシージャおよび細胞表面の受容体の発現レベル、ただし、このプロトコルの範囲内ではされているを決定する試薬の説明上記17の。</li>
	<li>Jurkat 細胞の成長停止の 80-85% に到達するまで合流しましょう。新規フラスコにセルを通過する前に部屋の温度 (RT) に到達するすべての試薬を許可します。</li>
	<li>新しいコート t75 フラスコ培養用フラスコに完全な新鮮な成長媒体 (RPMI 1640 中, 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 mM グルタミン) の 20 mL を追加します。</li>
	<li>小説コート t75 フラスコ培養用フラスコに (細胞懸濁液 25 mL を含んでいる) 元の T75 フラスコから Jurkat 細胞懸濁液 5 mL を追加します。37 ° C、5% CO2加湿インキュベーターで孵化させなさい。</li>
</ol>2. cxcl 12、アッセイのバッファー、および Jurkat 細胞の競争の結合の試金のための準備。
<ol><li>ポリソルベート 20 の 0.01% (ボリューム) を添加した純水 (暗闇の中、-80 ° C で保存) 凍結乾燥試薬を溶解することにより cxcl 12AF647 (20 μ G/ml; 参照テーブルの材料および試薬) の原液を準備します。単一のストアは、-80 ° c、光から保護されてこの原液から因数を使用します。</li>
	<li>40 mL HEPES (1 M、20 mM 最終濃度) を追加することにより 200 mL ハンクのバランスのとれた食塩 (HBSS、10 x、フェノールレッドと重炭酸ナトリウム、最終濃度 x 1 なし) にアッセイバッファーを準備します。追加純水 2 l. 追加 4 g (0.2% 重量/容積) ・ ウシ ・血清アルブミン (BSA) の最終的なボリュームを取得して磁気を介して BSA を溶解攪拌。最後に、7.4 (これに水酸化ナトリウムを使用) に pH を調整し、(テーブルの材料および試薬を参照) 0.2 μ m の気孔を通してソリューションをフィルター真空多岐管を使用しています。 注: このアッセイバッファーはプロトコルのすべての以降の手順で使用されます。</li>
	<li>細胞の生存率と数をカウントします。このため、細胞の懸濁液のサンプルを取るし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈します。 注: 我々 は日常的に自動化された細胞生存率アナライザーを使用 (テーブルの材料および試薬を参照) さまざまな濃度で細胞を懸濁液を数えることができます。セルがカウントの 1.5 mL の PBS (例えば、 1.9 mL の PBS に 0.1 mL その他の希釈も可能です) に細胞懸濁液 0.5 mL を希釈します。トリパン ブルー色素排除法に基づいて、このメソッドの使用されている前述した26。携帯番号と同様に動作する必要があります可能性を数えるため市販されているいくつかの他のデバイス。</li>
	<li>400 の x g で 5 分間遠心分離 (遠心分離機のタイプの材料および試薬の使用を参照) によって滅菌 50 mL のチューブで細胞 (すなわち、 ~ 24 x の 1 つの完全な 96 ウェル プレートでアッセイを実行する 10 の6セル) の必要な数を収集します。RT。</li>
	<li>細胞ペレットを乱すことがなく上澄みをそっと注ぐ。新鮮なアッセイバッファーを追加 (例えば、 20 mL) と上下に軽くピペッティングにより細胞を再懸濁します。</li>
	<li>室温 5 分 400 x g で再び細胞を遠心分離します。</li>
	<li>もう一度、上澄みを離れて注ぎ、5 x 106セル/ml の密度を得るため新鮮なアッセイバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3 競争の結合の試金
注: 実際の競争の結合の試金は RT では実行され、非無菌条件の下で実行することができます。
<ol><li>アッセイバッファーで調査中で化合物を希釈 (2.2 参照) 望ましい集中を取得します。いずれか準備初期スクリーニング (例えば10 μ M 最終濃度) の化合物濃度が固定または濃度の連続希釈系列化合物のキャラクタリゼーションの詳細 (例えば1/3、1/4、1/5 希釈系列最終濃度 1 μ M から始まる)。複合ソリューションの 2 倍希釈で試金; 最終的になる覚えておいてください。したがって、濃縮された溶液 x 2 を準備します。</li>
	<li>底板ラウンド クリア 96 ウェルに 100 μ L の混合の解決 (濃縮 2 倍) を分配 (テーブルの材料および試薬を参照) (例えば図 1) を事前に定義された実験的レイアウトによると。 注: この段階では、正と負のコントロールのサンプルは分析に含まれます。否定的な制御サンプル96-well 版の井戸に化合物の代わりにアッセイバッファーの 100 μ L が追加されます。肯定的な制御サンプルアッセイバッファーがこのステップの間にも追加されます。いくつかの化合物の希釈系列をテストの典型的な実験的レイアウトには、図 1を参照してください。</li>
	<li>細胞懸濁液を 50 μ l 添加 (2.7; を参照してください 106セル × 0.25) マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートに試薬リザーバーから。暗闇の中で常温 15 分間プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>50 μ L の蛍光に分類された cxcl 12 を追加 (すなわち、 100 ng/mL 25 ng/mL の最終的な集中、集中 4 x アッセイバッファー cxcl 12AF647の) 96 ウェル プレートの井戸に類似した試薬槽から。暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。 注:否定的なコントロールのサンプルは、アッセイバッファーを代わりに追加します。したがって、マイナス コントロールのサンプルで検出された蛍光シグナルは蛍光バック グラウンド信号 (図 1 a) に対応します。肯定的な制御サンプルcxcl 12AF647の 50 μ L/ウェルを追加します。肯定的な制御サンプル最大蛍光信号を検出、含まれている化合物と前の孵化によって潜在的な阻害がなかったので (図 1 a) が得られます。</li>
	<li>板の上を反転して削除した小球形にされた細胞から培養上清で 5 分間 400 x g で 96 ウェル プレートを遠心します。組織にプレートを乾燥させます。</li>
	<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に試薬リザーバーから新鮮なアッセイバッファー 200 μ L を追加します。すぐに進みます。</li>
	<li>板の上を反転して削除した上清で 400 × g で 5 分間再びプレートを遠心し、再び組織上で乾燥させます。</li>
	<li>軽く 200 μ L の PBS に溶解し 1% パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁します。この手順では、セルを修正します。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる蛍光性の定量化とすぐにプロトコルを続行します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーによる試料の分析
Cxcl 12AF647ステンドし、執着の細胞をフローサイトメトリーを使用して分析する準備が整いました。流れの cytometers のいくつかの種類を使用できますが、彼らは励起および蛍光検出のための適切なフィルター (すなわち、赤いレーザー、励起 〜 630 nm)、適切なレーザーを装備する必要がある (発光フィルター 〜 660 nm)。彼らは 96-well 版のフォーマットのサンプルを処理できる必要があります。適切な流量フローサイトメトリー デバイスの例としてテーブルの材料および試薬で与えられます。
<ol><li>デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます (テーブルの材料および試薬を参照)。</li>
	<li>ドットのしみ形式で可視化すること次の細胞パラメーターを選択: 散布 (FSC)、側方散乱 (SSC) および蛍光 (cxcl 12AF647) 検出チャンネルを転送します。 注: FSC パラメーターを持つ細胞が差別されるのサイズに基づいて検出された光吸収セルの直径に比例しているので。90 ° の角度で光の散乱を測定、SSC パラメーターは、セルの粒度に関する情報を提供します。</li>
	<li>FSC と SSC のパラメーターに基づいて定義された均一な細胞集団のゲートを実行する (例えば、否定的な制御サンプル) 1 つのサンプルを選択します。<ol>
<li>この否定的な制御サンプルから流れの cytometer に執着細胞の ~ 100 μ L の自動注入を選択します。オプション「混合」投与前に、を選択し、1.5 μ L/s のサンプル フロー レートを使用します。</li>
		<li>「取得データ」を選択することでこのサンプルを実行このサンプルの FSC と SSC のパラメーターが画面に表示されます。</li>
		<li>ソフトウェアのゲーティング ツールを選択します。FSC と SSC ドットのしみの可視化に基づく、事前ゲートで均質かつ実行可能な細胞集団を定義します。これを行うには、これらの 2 つのディメンションに基づくゆく分散単一セル (「イベント」) が含まれる (ソフトウェアのゲーティング ツールを使用して) 多角形を作成します。 注: ゲーティングの手順は、さらに分析に使用する同種および実行可能なセル人口を定義を目指しています。ゲートは、生菌の大半が FSC と SSC のパラメーターに基づいて均一な細胞集団を形成する仮定に依存します。この手順を実行すると、主細胞の残骸、死んだ細胞、細胞凝集塊をさらに分析から除外することができます。ゲーティング プロセスの図は、図 1 bで与えられます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20,000「イベント」(すなわち、単一セル) サンプルあたりを分析するを選択します。 注: これは、各サンプルでは、定義済みのゲート内にある 20,000 の細胞が最終的に分析することを意味します。各サンプルのデータ集録は、このイベントの数の分析まで続行されます。</li>
	<li>実行 (選択「記録データ」) を開始。流れの cytometry デバイスは各サンプルの平均蛍光強度 (MFI) を記録することによって 1 つのすべてのサンプルを分析します。この MFI は、定義済みのゲート内にある 20,000 のセルに対応する平均蛍光信号に対応します。</li>
</ol>5. データの解析
さらに計算を実行するのに各サンプルの得られた MFI を使用します。流れの cytometry データの解析は、(表の材料および試薬を参照)、いくつかの市販のソフトウェア パッケージによって実行できます。
<ol><li>割合を決定する化合物の前培養の結果、蛍光バインディング信号の抑制は次の数式を適用します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq1.jpg"> どこ： MFIExp (= 化合物処理) 実験の MFI を = サンプル MFIPC肯定的な制御の MFI を = MFINC = 陰性対照の MFI</li>
	<li>化合物 (すなわち50% によって蛍光結合信号を減らすことができる化合物の濃度) の IC50値を調べるには、次の数式を適用します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq2.jpg"> どこ： ログconc.2 = 50% 未満になる化合物の濃度のログ PC と NC の MFI の値の差の抑制 ログconc.1 = 50% 以上の化合物の濃度のログ PC と NC の MFI の値の差の抑制 注: また、高活性化合物の場合大きさのいくつかのログをカバー用量-反応曲線生成できます各テスト化合物濃度に対応する MFI に基づきます。適切なソフトウェアを使用して非線形回帰曲線のあてはめを適用することによって (テーブルの材料および試薬を参照)、IC50値を生成された曲線から推定しことができます。この分析手法の例は、図 3に示します。</li>
</ol>

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結合の試金 (すなわち、飽和結合と動的バインディング実験) の他のタイプと比較して、競争の結合の試金は、スクリーニング目的に最も適しています。確かに、彼らは定額ラベル付き受容体リガンドの結合を妨害する能力の得点でラベルのない化合物、例えば小さい分子の大規模なバッチの評価ができます。標識リガンドよりも他の受容体部位に結合する化合物は、アッセイの検出されないかもしれません。競争の結合実験記載焦点を当ててケモカイン受容体 CXCR4 の特にが、同様に他の Gpcr の可能性が高い競争の結合の試金の設計のための青写真として使用できます。例えば、CXC ケモカイン受容体 7 (CXCR7) は cxcl 12、親和性が高い29,とバインディング cxcl 1230対応の代替の受容体として記述されていた。したがって、競争の結合の試金は CXCR7 結合実験を設定する使用ことができます説明 CXCR4 のとして同じラベル ケモカイン (cxcl 12AF647) が使用されます。CXCR4 と ...

G タンパク質共役受容体 (Gpcr) はセル表面蛋白質 (例えばペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン) 細胞外リガンドによって活性化することができます、1を処理により多くの生理学的発達を調節します。受容体蛋白質の誘起構造変化が細胞内受容体関連ヘテロ三量体 G タンパク質の Gαから成る結合を促進するアゴニストは、GPCR 結合ポケットを占めていると、GDP と Gβγサブユニット。解離、下流を開始するさらに G 蛋白質サブユニット (GαGTP と Gβγ) の Gαサブユニット結果に GDP を GTP のそれ以降の exchange はシグナリング経路2,3です。GαGTP が加水分解したとき再会 Gαの GDP と Gβγサブユニット G タンパク質戻るに変換その静止の状態3,4。G タンパク質の異なる種類が存在 (GsG のi/oGq、G12/13) を Gαサブユニット5配列の類似性に基づいて分類されます。すべてのこれらの G タンパク質は受容体活性化する生物学的反応の根底にある定義済みの細胞内シグナル伝達経路を誘発します。受容体活性化後は、GPCR キナーゼ (GRKs) は、β arrestins との相互作用の促進を図る、Gpcr の細胞内の尾をリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達、受容体の脱感作と内面の6の終了に します。Β arrestins、トリガー信号をカスケード G 蛋白質シグナリング7の独立した多分子複合体の一部です。
Gpcr は、治療的介入のほとんどの検証分子標的の中で多くの病因学に貢献する規制を解かれた GPCR を介したシグナル伝達、例えば機能獲得変異受容体遺伝子の受容体の過剰発現が原因人間の病気の8。したがって、Gpcr は製薬業界8,9,10を用いて創薬ターゲットの最も重要なクラスの 1 つを表します。臨床的に関連する GPCR の顕著な例は CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4)、唯一の天然リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)11によって活性化することができます。(HIV-1) ひと免疫不全ウイルス 1 の主要な共受容体として確立された役割のためのエントリ、クラスターの分化 4 (CD4) 抗ウイルス薬ターゲットとして肯定的な T リンパ球12, CXCR4 を調べた最初の感染。さらに骨髄に cxcl 12 CXCR4 相互作用調節保持し幹・前駆細胞のホーミング細胞13。また、がん生物学 (例えば、腫瘍細胞の生存、転移、腫瘍関連血管新生)14の多くの側面でいくつかその他疾患 (例えば、炎症性疾患)15, CXCR4 の関与を考える創薬のための有望なターゲットとして大きな関心を発生します。AMD3100, CXCR4 を標的とする低分子抗 HIV 薬候補16として発見された当初はまだ日付17に記載されている最も強力な CXCR4 アンタゴニストの一つ.その開発と抗ウイルス薬は、しかし、18は中止。現在この分子は、多発性骨髄腫とリンパ腫の患者のための18の治療中に幹細胞動員エージェントとして使用されます。いくつかの他の化学的に無関係な小さな分子や CXCR4 関数をさまざまな効力を抑制する生物学的製剤は、記述されている19をされています。
受容体結合メソッドは、関心の GPCR と直接対話する化合物 (例えば、小分子) を識別できるように薬理学の貴重なツールです。結合試験を実行するために、細胞内シグナル伝達のプロパティまたは特定の GPCR の機能に関する知識の必要はありません。これは利点であるためと考えられることができます、それは化合物が受容体の結合を示すことができますがさらに彼らの潜在的な敵対または敵対的活動を評価することによって特徴付けられる必要があることを意味します。この活動は、GPCR 研究の下に関連する薬理学的または生物学的アッセイを使用して評価できます。彼らの活動のプロファイルに依存して、受容体の結合の分子、潜在的になる進化可能性前臨床試験と臨床研究の調査のための新規リード化合物。高親和性受容体に特異結合する分子が腫瘍細胞20の生体内非侵襲イメージングのカイネティックスそれらによって例えば治療または診断ツールを生成するための足場として、または可能性としても利用できます。治療21のターゲットを絞った配信のための車。CXCR4 の場合腫瘍細胞の生体内イメージングが既に実証されているラベル CXCR4 ターゲット分子がひと癌異種移植片20,22,23 の視覚化を許可する前記マウスモデルを使用して.
本報告では、小分子と CXCR4 を拘束アゴニスト (cxcl 12) に直接干渉する生物学的製剤の照合することにより競争の結合の試金のための詳しいプロトコルについて述べる。アッセイの原理は蛍光リガンドの固定量間の競争 (cxcl 12AF647テーブルの材料および試薬を参照してください) と受容体タンパク質17,にバインドするための化合物をラベル24. CXCR4 を表現する 1 つのセルにバインドされている標識リガンドから特定の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーで分析しました。ラベルのない小さな分子 cxcl 12AF647と CXCR4 相互作用を混乱させるとき、この蛍光信号を差し引かれます。アッセイは、内生 CXCR4 を表現する非操作の細胞を使用して (すなわち、 Jurkat 細胞)。したがって、細胞膜の準備する必要がない便利な高速、スループットの向上と互換性のある試金になります。蛍光リガンドを利用していますので、放射能を避けます。
Cxcl 12 は CXCR4 の自然のアゴニスト、cxcl 12AF647バインディング アッセイに干渉する低分子化合物は orthosteric 受容体結合部位 (すなわち、結合部位が占め、自然と対話するにはアゴニスト)。Orthosteric 結合部位とは異なる地形的受容体結合部位と通信できる分子が気づかれ場合 cxcl 12 のバインディングには影響しません。例えば、このアッセイでの正と負のアロステリック変調、GPCR アロステリック結合サイト25に作用する分子をターゲットの重要な新たなカテゴリをピックアップされている可能性。さらに、受容体アンタゴニストやアゴニストとして化合物がこのバインディング アッセイ機能を識別されるかどうかは派生できません。その他、薬理学的または機能的受容体関連アッセイで同定された化合物の調査は従って必要となります。これらの試金は (の組み合わせ) を含めることが第二使徒 (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (cAMP))、表現型の検出細胞蛍光または発光ベース法または生物学的アッセイと β アレスチン募集の試金、どちらを調査の下で GPCR の特定信号プロパティによって異なります。したがって、主に本明細書に記載されている競争の結合の試金は、受容体結合能を持つ化合物の詳細な特性評価を有効にする他の細胞に基づく試金で補完する必要がある最初のスクリーニング法として機能します。

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton Dickinson 該当</td><td>なし</td><td>フローサイトメトリー装置</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSArray</td><td>Becton Dickinson</td><td>該当なし</td><td>フローサイトメトリーデバイス</td></tr><tr><td>BD FACSArray System Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>図2と図3の非線形回帰分析に使用されているソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>FlowJo</td>は<td>、BDの完全子会社となりました。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL</td><td>Beckman Coulter</td><td>該当なし</td><td>細胞生存率分析装置</td></tr><tr><td>Sigma 3-18 KS</td><td>Sigma</td><td>該当なし</td><td>遠心分離</td></tr><tr><td>機 AMD3100</td><td>Sigma</td><td>A5602-5mg</td><td>特異的 CXCR4 拮抗薬</td></tr><tr><td>マラビロック</td><td>ファイザー</td><td></td><td>抗レトロウイルス薬、CCR5 拮抗薬、Selleckchem (cat#S2003) で研究可能、Sigma (cat#PZ0002)</td></tr><tr><td>h-SDF1a (AF647)</td><td>ALMAC</td><td>CAF-11-B-01</td><td>蛍光標識CXCL12, CXCL12AF647</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), カルシウム, マグネシウム, フェノールレッド無</td>し <td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14065-049</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco (Life Technologies)Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー PP</td><td>Sigma</td><td>BR703411</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Flow Filter: 0.2 & micro;m aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin マイクロタイタープレート、96 ウェル、U 底、透明</td><td>Thermo Scientific</td><td>611U96</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ、50ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ (T75)</td><td>Corning</td><td>353024</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光標識した cxc ケモカイン ligand 12 cxc ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

G タンパク質共役受容体 (Gpcr) の薬理学的対象は、人間の健康に非常に重要な多くの病気の進行に貢献する機能不全 GPCR を介したシグナル伝達します。リガンド ・受容体ペア CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)/CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) がんや炎症性疾患の治療のための潜在的なターゲットとして、例えば重要な臨床的関心を調達しています。特に CXCR4 をターゲットし、受容体の機能を阻害する抗体と同様、小分子と見なされる薬理学的に貴重なツールをします。ここでは、フロー フローサイトメトリーを用いた細胞試金 CXCR4 に cxcl 12 バインディングを破棄する化合物 (例えば、小分子) の同定を可能にするを説明します。基本的には、アッセイは、受容体 CXCR4 の自然ケモカイン アゴニスト蛍光に分類された cxcl 12 の固定量とラベルのない化合物の結合のための競争に依存します。したがって、このアッセイで放射能によって分類されたプローブの望ましくない使用は避けます。さらに、生きている細胞は、細胞膜の準備ではなく受容体 (CXCR4) のソースとして使用されます。これによりスループットが向上版のフォーマットにアッセイの容易に適応できます。この試金は CXCR4 ターゲット化合物を識別するために貴重なジェネリック医薬品検出アッセイする示されています。プロトコル可能性がありますに対応できる他の Gpcr 少なくとも蛍光リガンドは利用または生成することができるかどうか。これらの Gpcr の活性化により誘導される細胞内シグナル伝達経路に関する事前の知識は必要ありません。

結合の試金の一般的なワークフローは、図 1 aに提示されます。図 1 bと可能なプレート レイアウトを実行する (すなわち、否定的な制御、肯定的な制御と実験的サンプル) 標準的な実験の別のサンプル タイプの得られた流れ cytometry データの種類のイラストが描かれています。96 ウェル プレート形式のアッセイは、図 1で与えられます。ケモカイン受容体 CXCR4 を内生表現 Jurkat 細胞の培養 (すなわち、このアッセイの関心の GPCR)、蛍光に分類された cxcl 12 の増加額でに起因した (すなわち、 cxcl 12AF647) 増加蛍光 (図 2)、CXCR4 をリガンド結合の増加されたレベルを反映してのレベル。Cxcl 12AF6...

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12) の結合を阻害する化合物を同定するスクリーニング用具として主に使用される種類の流れ。

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

セルベースアッセイの全体的な目標は、Gタンパク質共役型受容体に結合する分子を同定することです。蛍光標識されたリガンドと競合して受容体に結合する能力に基づいています。競合結合アッセイは、Gタンパク質共役受容体創薬をサポートします。このプロトコルで示すように、ケモカイン受容体、CXC4。この方法の主な利点は、記憶の準備の代わりに生細胞を使用して受容的結合を解析できることです。また、放射能標識プローブの使用が避けられること。この方法は当初、ケモカイン受容体CXCR4への結合を研究するために設定されましたが、蛍光標識リガンドが存在する他のGPCRに対しても開発できます。まず、100マイクロリットルの化合物溶液を、事前に定義された実験レイアウトに従って、透明な96のよく丸みを帯びた底板に分注します。試薬リザーバーから50マイクロリットルの細胞懸濁液をマルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートに加えます。プレートを室温で15分間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、蛍光標識された100ナノグラム/ミリリットルのCXCL12を、同様の試薬リザーバーから50マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに加えます。暗所で室温で30分間インキュベートします。次に、96ウェルプレートを室温で400倍の重力で5分間遠心分離します。プレートを裏返して、ペレット化された細胞から上清を取り除きます。プレートをティッシュで乾かします。試薬リザーバーから200マイクロリットルの新鮮なSAバッファーをマルチチャンネルピペットを使用してウェルに加えます。直ちにプレートを再び遠心分離し、室温で重力400倍で5分間遠心分離します。プレートを裏返し、ティッシュで乾燥させて、再び上清を取り除きます。最後に、PBSに溶解した200マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドに細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。この手順では、セルを修正します。フローサイトメトリーでサンプルを解析するには、デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます。ドットブロック形式で視覚化するセルラーパラメータを、前方散乱領域、側方散乱領域、ヒストグラムビューでフルオロ4検出チャネルとして選択します。サンプルを 1 つ選択します。例えば、ネガティブコントロールサンプルは、前方散乱および側方散乱パラメータに基づいて定義された均質な細胞集団のゲーティングを実行する。細胞をフローサイトメトリーデバイスにロードするための設定を適応させます。注入前に3つのミックスを選択します。100マイクロリットルの固定細胞の自動注入を選択し、毎秒1.5マイクロリットルのサンプル流量を使用します。[データの取得] を選択してサンプルを実行します。このサンプルの前方散乱光と側方散乱光のパラメータ、およびフルオロ4の検出が画面に表示されます。次に、ソフトウェアゲーティングツールを選択します。前方散乱光と側方散乱光ドットプロットの可視化に基づいて、ゲーティングによって均質で生存可能な細胞集団を事前に定義します。サンプルあたり 20 、 000 のイベントを分析する場合に選択します。これは、各サンプルについて、事前定義されたゲート内にある20,000個の細胞が最終的に分析されることを意味します。データ取得は、このイベント数に達するまで続行されます。最初に、分析するウェルを選択して実行を開始します。次に、ランウェルを選択します。フローサイトメトリーデバイスは、各サンプルの平均蛍光強度を記録することにより、これらのサンプルを1つずつ分析します。これは、事前定義されたゲート内にある20, 000個の細胞からの平均蛍光シグナルに対応します。最後に、プロトコルに記載されているようにデータ分析を実行します。高濃度のAMD3100、未確立および特異的なCXCR4アンタゴニストを含むジャーカット細胞のプレインキュベーション後。標識されたCXCL12の結合を反映する平均蛍光強度は、ほぼ完全にバックグラウンドレベルまで低下します。これは、jurkat細胞上に発現するCXCR4へのCXCL12の高度に特異的な結合を示しています。CCR5アンタゴニストのマラビロックのように、CXCR4受容体での結合について標識CXCL12と競合できない化合物は、平均蛍光強度に影響を与えません。対照的に、高活性化合物は用量依存的にこれを行います。ビデオを見た後、生細胞とフローサイトメトリーを使用した競合的受容結合アッセイの実施方法を十分に理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 -...

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

このビデオでは、CXCR4を標的とする低分子の存在下で、CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) とその蛍光標識天然リガンドCXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12)...

受容体-リガンド相互作用を破壊する化合物を同定するための競合的結合アッセイ

このビデオは、CXCR4ケモカイン受容体を発現する膠芽腫細胞を含む細胞アッセイを示しています。このアッセイでは、カルシウム感受性色素を使用して、薬剤の相互作用による蛍光変化を測定し、細胞シグナル伝達ダイナミクスに関する洞察を提供します。...

CXCR4相互作用因子の同定のための細胞アッセイ

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

説明アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) を識別するために設計されています-エージェントを阻害するまたは競争または、アロステリックに CXCR4 活性化による細胞内 Ca2...

キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

フローサイトメトリーをイメージング細胞個々...

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

抗がんアプタマー開発に必要なステップは、標的への結合をテストすることです。この結合を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを実証し、ネガティブコントロールのアプタマーとその特定のタンパク質に対して陽性または陰性の癌細胞を含めることの重要性を強調しています。...

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。...

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

学ぶフローサイトメトリーを用いたCXCL12とCXCR4の結合阻害化合物のスクリーニング法。生細胞を使用し放射性標識を避け、Gタンパク質共役受容体の創薬研究を支援する競合結合アッセイの手法です。

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