La Formation de Biofilm induite sur les sels biliaires chez les agents pathogènes entériques : Techniques d’Identification et de Quantification

L’objectif général de ce protocole de formation et d’évaluation du biofilm est de déterminer la capacité des bactéries pathogènes entériques à former un biofilm, en particulier dans des conditions qui imitent le transit gastro-intestinal et l’exposition aux sels biliaires. Les méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse bactérienne, telles que la capacité des agents pathogènes entériques à survivre aux conditions difficiles des sels biliaires du tractus gastro-intestinal. Le principal avantage de ces techniques est que les résultats combinés des trois essais permettent une caractérisation approfondie de la formation du biofilm en réponse à l’exposition aux sels biliaires pour chaque agent pathogène.

Nous avons d’abord eu l’idée des méthodes combinées, étant donné la nécessité de quantifier pleinement la formation de biofilm induite par les sels biliaires chez Shigella flexneri. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car certains aspects du test peuvent limiter la reproductibilité. Veuillez donc faire attention aux étapes critiques, pour assurer la reproductibilité.

Des membres de mon laboratoire, Kourtney Nicherson, boursière postdoctorale, et Alejandro Llanos, boursier de recherche clinique, feront la démonstration des procédures. Tout d’abord, étiquetez deux tubes de 1,5 millilitre comme TSB et TSB plus BS. Ajoutez ensuite un millilitre de TSB ou TSB plus BS dans les tubes respectifs. Ensuite, inoculez les tubes avec 20 microlitres de culture pendant la nuit à une dilution de un à 50.

Ajoutez ensuite 130 microlitres de milieux témoins non inoculés dans chacun des trois puits dans une plaque stérile, transparente, à fond plat, traitée pour culture tissulaire, à 96 puits. Il s’agit du contrôle à vide. Ajoutez 130 microlitres de culture inoculée dans chacun des trois puits.

Après avoir ajouté le témoin et la culture inoculée dans les puits respectifs, incubez la plaque de 96 puits pendant quatre à 24 heures à 37 degrés Celsius, de manière statique. Une fois l’incubation terminée, réglez la commande bien sur blanc sur le lecteur de plaques. Ensuite, aspirez le milieu de culture de chaque puits.

Ensuite, lavez doucement les puits une fois avec 200 microlitres de PBS stérile. Après le lavage, aspirez le PBS, puis retournez la plaque pour qu’elle sèche pendant environ 20 minutes. Il est très important d’assurer un retrait en douceur du support et un lavage en douceur, afin de s’assurer que la matrice EPS n’est pas perturbée.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de violet cristallin à 0,5 % dans chacun des puits expérimentaux et de contrôle. Ensuite, incubez la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, lavez une fois les puits avec 400 microlitres d’eau distillée.

Ajoutez 200 microlitres d’eau distillée pour laver les puits cinq fois. Après les cinq lavages, retournez la plaque et laissez-la sécher complètement, à l’abri de la lumière. Afin d’obtenir des résultats cohérents, il est important que les échantillons soient soigneusement séchés avant de procéder.

Une fois la plaque complètement sèche, utilisez 200 microlitres d’éthanol à 95 % pour détacher les puits. Laissez ensuite la plaque sur le shaker pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, afin d’éviter l’évaporation. Après 30 minutes, enregistrez l’OD 540 sur le lecteur de plaques.

Pour la détection semi-quantitative de l’EPS, utilisez une pipette multicanaux pour transférer le milieu de culture sur une plaque transparente à 96 puits. Utilisez ensuite 200 microlitres de réactif de fixation pour fixer la plaque noire pendant 15 minutes à température ambiante. Enregistrez maintenant la lecture OD 600 en réglant la commande ainsi que l’ébauche pour la normalisation.

Enregistrez ensuite la lecture du milieu de culture pendant que la population adhérente se fixe. Une fois la fixation terminée, retirez le réactif et jetez-le dans les déchets dangereux. Utilisez ensuite 200 microlitres de PBS stérile pour laver doucement les puits deux fois.

Après le lavage, aspirez le PBS. Ajoutez ensuite 150 microlitres de 25 microgrammes par millilitre de ConA-FITC. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 minutes.

Après l’incubation, laver délicatement les puits avec 200 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite 150 microlitres de PBS dans chaque puits et enregistrez la fluorescence à 488 nanomètres. Après avoir préparé des réactifs frais, réchauffez le PBS, le PBS avec du glucose, le PBS avec des sels biliaires et le PBS avec du glucose et des sels biliaires à 27 degrés Celsius.

Enregistrez ensuite les valeurs OD 600 de la plaque de biofilm de nuit sur le lecteur de plaques en réglant la commande bien sur blanc. Ensuite, aspirez le milieu de culture à l’aide d’une ligne de vide, sans déranger la population adhérente sur la surface en plastique. Lavez doucement les puits deux fois avec 200 microlitres de PBS stérile.

Après le lavage avec du PBS, ajoutez 130 microlitres de PBS préchauffé, de PBS avec du glucose, du PBS avec des sels biliaires et du PBS avec des sels biliaires et du glucose dans chacun des trois puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirez la plaque de l’incubateur. Pipeter le surnageant vers une plaque fraîche et stérile à 96 puits.

Enfin, préparez une à 10 dilutions en série du surnageant avec du PBS dans la plaque à 96 puits ou dans un bloc de dilution. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférez cinq microlitres de chaque dilution sur des plaques de gélose LB. Incuber les assiettes à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, comptez le nombre de colonies. Le diagramme à barres est obtenu pour quantifier la formation de biofilms dépendants des sels biliaires chez les agents pathogènes entériques. Pour ce faire, on trace les valeurs OD 540 des souches individuelles en présence et en absence de sels biliaires dans le milieu.

Le graphique montre une augmentation significative de la formation de biofilm pour la plupart des souches pathogènes, à l’exception d’E. coli entéroaggratif. Ensuite, l’EPS produit lors de la formation du biofilm est détecté en déterminant la quantité de ConA-FITC retenue par l’EPS. Le graphique à barres montre une augmentation significative de la lecture de la fluorescence en présence de sels biliaires.

Cela confirme la production d’EPS pour l’agent pathogène Shigella flexneri. Ici, la coloration dépendante de ConA-FITC de la matrice EPS est significativement élevée lorsqu’elle est exposée aux sels biliaires. Cela indique la formation d’un biofilm bactérien, caractérisé par la matrice EPS riche en polysaccharides.

Un PBS X et un DAPI sont utilisés pour montrer la spécificité dépendante de la FITC et la présence de l’ADN bactérien, respectivement. Enfin, le nombre d’unités formant des colonies est compté pour analyser la dispersion dépendante des sels biliaires des bactéries du biofilm. Le graphique montre que les bactéries se dispersent facilement à partir des biofilms dans le PBS et le PBS avec le glucose.

Cependant, l’exposition de la bactérie aux sels biliaires inhibe considérablement sa dispersion à partir des biofilms. Ces tests ont été mis au point pour capturer et quantifier les biofilms virulents transitoires formés par les agents pathogènes entériques, en particulier Shigella flexneri, en réponse à l’exposition aux sels biliaires dans l’intestin grêle avant l’infection du côlon. Il peut être nécessaire d’ajuster les modifications apportées aux essais, telles que les types de milieux de base, la composition des sels biliaires utilisés et les conditions de croissance bactérienne pour différents agents pathogènes, en fonction du site de l’infection dans le tractus gastro-intestinal.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer chacun des tests pour évaluer en profondeur la formation de biofilm dans votre souche bactérienne ou mutante d’intérêt. N’oubliez pas que travailler avec les agents pathogènes et certaines des solutions peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que des méthodes de manipulation et d’élimination appropriées doivent toujours être prises en compte lors de la réalisation de ces essais.

De plus, la préparation de milieux de sels biliaires frais, des contrôles appropriés et la garantie de la reproductibilité expérimentale sont essentiels à l’analyse des données et à la confirmation du phénotype du biofilm induit par les sels biliaires. Les techniques, qui sont des applications uniques et créatives à haut débit des méthodes traditionnelles, permettront une quantification appropriée du processus multidimensionnel et dynamique de formation du biofilm induit par les sels biliaires chez les agents pathogènes entériques.