Le protocole MPLEx pour Multi-omic Analyses d’échantillons de sol

Cette méthode est utilisée dans les domaines de la protéomique, de la métabolomique et de la lipidomique en permettant d’obtenir des informations complètes sur les changements moléculaires qui se produisent dans les communautés microbiennes associées au sol en raison des perturbations environnementales. Le principal avantage de cette technique est que l’obtention de plusieurs analytes à partir d’un seul échantillon de sol augmente la précision et l’exactitude tout en réduisant le temps et les efforts de préparation de l’échantillon. Pour commencer, pour chaque échantillon de sol de 20 grammes, pesez 10 grammes dans deux tubes séparés de 50 millilitres compatibles avec le méthanol et le chloroforme.

Utilisez des tubes en plastique fabriqués à partir de PTFE, car le chloroforme lessivera la plupart des plastiques, contaminant les échantillons. Ajoutez environ 10 millilitres d’acier inoxydable lavé au chloroforme et de billes de grenat dans chaque tube. Ensuite, pendant que vous êtes sur de la glace, ajoutez quatre millilitres d’eau froide ultrapure dans chaque tube et transférez les échantillons dans un seau à glace dans une hotte.

À l’aide d’une pipette sérologique en verre de 25 millilitres, ajoutez rapidement 20 millilitres de chloroforme glacé à un volume/volume de chloroforme glacé à un méthanol dans les tubes. Serrez les couvercles et faites tourbillonner le mélange de sol dans la solution. Le chloroforme-méthanol aide à décomposer la paroi cellulaire des procaryotes et inactive également les activités enzymatiques.

Ensuite, fixez les tubes à des accessoires de vortex de tube de 50 millilitres et faites un vortex horizontal pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius à l’intérieur d’un réfrigérateur si possible. Ensuite, placez les échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant environ 15 minutes afin de les refroidir complètement. Ensuite, à l’aide d’un sonificateur à l’intérieur d’une hotte, sonifiez chaque échantillon avec une sonde de six millimètres de 1/4 de pouce à 60 % d’amplitude pendant 30 secondes sur de la glace.

Après la sonication, placez les échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius, car la sonication peut générer beaucoup de chaleur. Après avoir répété les étapes horizontales de vortex, de sonication et de congélation, centrifugez les échantillons à 4 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À ce stade, l’échantillon sera séparé en la couche supérieure de métabolites, la couche intermédiaire protéique et la couche lipidique inférieure.

Placez les échantillons sur de la glace. Ensuite, à l’intérieur d’une hotte, utilisez une pipette sérologique en verre de 10 millilitres pour transférer les couches supérieures de métabolites des deux tubes de 50 millilitres dans un grand flacon en verre. Maintenant, inclinez légèrement le tube de 50 millilitres pour libérer l’intercouche protéique afin qu’elle flotte librement sur la couche lipidique inférieure.

Ensuite, à l’aide d’une spatule de laboratoire à tête plate en acier inoxydable propre, prélevez soigneusement les deux couches intermédiaires de protéines et placez-les ensemble dans un nouveau tube de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette sérologique en verre de 25 millilitres, transférez les couches lipidiques inférieures dans un grand flacon en verre. Ajoutez 20 millilitres de méthanol glacé dans les deux tubes contenant des débris et dans le tube contenant l’intercalaire protéique.

Faites un bref vortex dans les tubes et centrifugez les granules de débris et l’intercalaire protéique à 4 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, décantez le méthanol dans un contenant de déchets dangereux à l’intérieur d’une hotte. Congelez les granulés de protéines et de débris dans de l’azote liquide et séchez-les dans un lyophilisateur pendant environ deux heures.

Ajouter 20 millilitres de tampon de solubilisation des protéines dans un tampon tris de 50 millimolaires, pH 8,0, à chacune des pastilles de débris et 10 millilitres dans le tube intercalaire protéique. Dans la hotte, sonorisez les échantillons à 20 % d’amplitude pendant 30 secondes pour les mettre en solution. Vortex les échantillons pendant deux minutes.

Ensuite, placez l’échantillon de protéine intercouche dans un rotateur de tube de laboratoire à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes pour solubiliser la protéine. Vortex horizontalement les échantillons de débris pendant 10 minutes supplémentaires pour lyser les cellules intactes restantes. Ensuite, tournez avec les échantillons de protéines intercalaires pendant les 20 minutes restantes.

Centrifugez tous les échantillons à 4 500 fois la gravité à température ambiante pendant 10 minutes et collectez le surnageant de chaque tube par échantillon dans deux tubes de 50 millilitres. Ajouter 10 millilitres de tampon de solubilisation à la pastille de couche intermédiaire protéique. Ensuite, sonicate et remettez la pastille en solution par vortex.

Après la centrifugation, combinez également les surnageants dans les deux tubes de 50 millilitres avec les surnageants de granulés de débris, et centrifugez les tubes dans un rotor à godets à angle fixe à 8 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes afin de granuler tous les débris restants. Répartissez les surnageants dans deux tubes de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique en verre de 10 millilitres, ajoutez 7,5 millilitres de TCA dans chaque tube.

Vortex les échantillons dans la solution. Ensuite, placez les échantillons dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures à toute la nuit. Pour granuler la protéine précipitée, centrifugez l’échantillon à 4 500 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis décantez le surnageant en déchets.

Ajoutez 10 millilitres d’acétone glacée à 100 % à chaque pastille de protéine. Vortex les tubes et combinez-les comme des granulés en un seul tube. Centrifugez puis décantez l’acétone.

À l’aide d’un plus petit volume d’acétone, lavez la pastille deux fois et transférez la suspension dans un tube de 1,5 ou deux millilitres pour l’essorage final. Décantez le surnageant en déchets et laissez sécher la pastille à l’envers sur une lingette en papier dans une hotte pendant environ 20 minutes. Selon la taille de la pastille, ajoutez 100 à 200 microlitres de tampon de solubilisation des protéines.

Sonicate et vortex la pastille dans la solution. Notez que l’échantillon peut être visqueux en raison des substances humiques qui précipitent avec la protéine, qui sera éliminée lors d’une centrifugation ultérieure. Enfin, agitez l’échantillon dans un incubateur ou un agitateur à 300 tr/min et 40 degrés Celsius pendant 30 minutes, pour solubiliser la protéine en solution avant de procéder à la digestion des protéines ou à la congélation instantanée pour un traitement ultérieur.

À l’aide du protocole MPLEx démontré dans cette vidéo, 3 376 peptides, 105 lipides et 102 métabolites polaires ont été extraits du sol des prairies indigènes du Kansas, et l’extraction des protéines du protocole est comparée aux kits d’extraction de protéines et aux extractions SDS à l’aide de LC-MS/MS en phase inverse. Lorsque l’on compare initialement trois répétitions du kit d’extraction de protéines commercial et des méthodes SDS, seuls 12 % des peptides se chevauchent entre les deux techniques, ce qui montre la complexité de la communauté microbienne et les différents effets d’extraction. En comparant le MPLEx avec un kit d’extraction de protéines commercial et des extraits SDS, environ 38 % des peptides observés à l’aide de la méthode MPLEx ont également été détectés lors de l’utilisation de la SDS et/ou d’extractions par kit commercial.

Compte tenu du nombre d’espèces dans la communauté bactérienne du sol du Kansas et de son métagénome, le chevauchement des identifications peptidiques est raisonnable. Comme le montre ici, la large applicabilité de l’approche MPLEx a déjà été évaluée à l’aide de l’archéon S. acidocaldarius, d’un consortium unicyanobactérien, de tissus du cortex cérébral de souris, d’urine humaine et de feuilles d’A. thaliana. Dans tous les cas, le nombre de protéines observées à partir de la méthode MPLEx était similaire à celui des témoins, ce qui indique son utilité pour de nombreux types d’échantillons différents.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des protéines, des métabolites et des lipides à partir d’un seul échantillon de sol. Lors de cette procédure, il est important d’être flexible, car tous les types de sol sont différents. Par exemple, la taille de l’intercouche protéique variera en fonction de la biomasse du sol et des substances humiques présentes dans le sol.

N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte doivent toujours être prises lors de cette procédure.