À l’aide de Terminal Transferase-mediated dUTP Nick fin-étiquetage (TUNEL) et la Caspase 3/7 Assays à mesure la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose
16 mai 2018
Nous quantifions la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose en utilisant deux méthodes. Tout d’abord, nous utilisons terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) in situ histologie pour déterminer les différences entre animaux infectés et cliniquement. En second lieu, nous effectuons une analyse des séries chronologiques de l’apoptose au cours de l’infection en utilisant une analyse de protéine caspase 3/7.
L’objectif global de cette expérience est d’observer l’effet de l’agent pathogène fongique amphibien Batrachochytrium dendrobatidis sur l’apoptose et la mort cellulaire dans le tissu épidermique des grenouilles. Cette méthode peut nous aider à comprendre les maladies de la faune sauvage, par exemple si l’infection provoque la mort cellulaire ou, à l’inverse, s’il existe des mécanismes immunitaires contre l’infection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée sur de petits échantillons de biopsie tissulaire, de sorte que de petits individus peuvent être échantillonnés à plusieurs reprises tout au long de l’infection.
Pour commencer cette procédure, préparez des lames de verre hydrophile avec l’échantillon de tissu, comme indiqué dans le protocole textuel. Pour déparaffiniser les sections de tissus, lavez les lames trois fois avec du xylène pendant cinq minutes chacune dans un bocal coplin. Ensuite, lavez les lames avec de l’éthanol à 100 % deux fois pendant cinq minutes chacune.
Après cela, lavez les lames avec de l’éthanol à 95 % et à 70 % d’éthanol pendant trois minutes chacune. Ensuite, lavez les lames une fois avec du PBS pendant cinq minutes. Pour préparer des lames expérimentales et de contrôle négatif, prétraitez le tissu en ajoutant de la protéinase K fraîchement diluée directement sur les lames.
Incuber les lames pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames dans PBS deux fois pendant deux minutes chacune. Pour préparer des lames de contrôle positif, prétraitez le tissu avec un tampon DN, puis incubez les lames à température ambiante pendant cinq minutes.
Après cela, dissoudre la DNase 1 dans le tampon DN jusqu’à une concentration finale de 0,1 microgramme par millilitre. Ajouter la solution de DNase préparée aux lames. Incuber les lames pendant 15 minutes à température ambiante.
Ensuite, lavez les lames avec de l’eau distillée dans un bocal coplin cinq fois pendant trois minutes chacune. Trempez la réaction dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames dans PBS deux fois pendant deux minutes chacune.
Ensuite, ajoutez un tampon d’équilibre au tissu sur les lames. Incuber pendant 10 secondes à température ambiante. Ensuite, tapotez l’excès de liquide autour de la section du tissu.
Enzyme déoxynucléotidyltransférase terminale diluée dans un tampon de réaction. Ensuite, ajoutez-le au tissu sur les lames expérimentales et de contrôle positif. Incuber dans une chambre humidifiée pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Après cela, placez les lames dans un bocal coplin contenant la concentration de travail du tampon d’arrêt. Agitez pendant 15 secondes, puis incubez les lames à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames avec du PBS trois fois pendant une minute chacune et tapotez l’excès de liquide.
Ensuite, ajoutez le conjugué anti-digoxigénine, préchauffé à température ambiante, directement sur le tissu. Incuber les lames pendant 30 minutes à température ambiante dans une chambre sombre humidifiée. Une fois l’incubation terminée, lavez les lames avec du PBS quatre fois pendant deux minutes chacune.
Tapotez tout excès de liquide. Ensuite, ajoutez du support de montage aux diapositives. Ajouter 15 microlitres de solution DAPI au support de montage sur les lames.
Couvrez chaque diapositive avec une lamelle et scellez-la avec du vernis à ongles. Laissez les lames sécher dans l’obscurité. À l’aide d’un microscope fluorescent, observez les lames dès la fin du processus debout.
Prenez des photos 400 fois à intervalles aléatoires le long de chaque section de peau. Comptez les cellules bleues colorées au DAPI pour vous assurer qu’au moins 100 cellules par section de peau et par animal sont visibles. Ensuite, comptez le nombre de cellules positives à TUNEL, qui apparaissent sous forme de cellules simples rouges avec des bords de cellule clairs.
Pour commencer, utilisez un microscope à lumière inversée à 40 reprises pour prendre une photo de chacun des orteils de la grenouille. Tracez des lignes autour du bord de la pince-orteil et utilisez un logiciel d’imagerie pour estimer la surface à l’intérieur de la forme. Pour évaluer la surface de l’échantillon de peau tridimensionnel, multipliez l’aire estimée par pi.
Pour extraire les protéines d’un échantillon d’orteil de grenouille congelé, placez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation à bouchon à vis de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de tampon d’échantillon et deux billes d’acier inoxydable. Utilisez un batteur à perles à vitesse maximale pour lyser les cellules. Après cela, placez le tube sur de la glace pendant trois minutes.
Ensuite, centrifugez le tube pour recueillir le surnageant. Pour effectuer le dosage de la caspase 3/7 dans une plaque de 384 puits, ajoutez 10 microlitres de tampon d’échantillon à blanc et 10 microlitres d’extrait de protéine en trois exemplaires. Ensuite, pipetez 10 microlitres de réactif de caspase 3/7 disponible dans le commerce jusqu’à l’extrait de protéine et les puits vierges.
Ensuite, secouez doucement la plaque pendant 15 secondes pour mélanger les deux réactifs. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Enfin, utilisez un lecteur de plaque luminescente pour mesurer la luminescence de l’échantillon.
Dans cette étude, les animaux infectés présentent un nombre significativement plus élevé de cellules positives à TUN par rapport aux animaux témoins, comme l’illustrent les cellules rouges ou roses. Chez les animaux témoins, il y a peu de cellules TUNEL-positives, et elles ne sont pas concentrées dans l’épiderme. Chez les animaux infectés, les cellules positives à TUNEL sont plus fréquentes dans l’épiderme.
Les cellules positives à TUNEL sont plus concentrées et directement adjacentes aux cellules infectées. De plus, il y a plus de cellules positives à TUNEL-TUNEL plus répandues sur l’épiderme et dans les couches épidermiques qui sont plus profondes que l’endroit où résidait l’agent pathogène fongique. Chez les animaux infectés, il y a plus de cellules positives à TUN dans les trois types de peau, avec un niveau particulièrement élevé dans la peau des cuisses et du ventre.
Dans le dosage de la caspase, l’intensité de l’infection est positivement corrélée à l’activité de la caspase 3/7. De plus, l’activité de la caspase 3/7 chez les animaux infectés et non infectés a varié au fil du temps. L’activité de la caspase 3/7 a diminué au cours des premières semaines suivant l’inoculation, puis a augmenté vers la fin de la septième semaine chez les animaux infectés.
L’activité de la caspase 3/7 est demeurée constante chez les individus non infectés. Lors de la tentative de la procédure pour le test TUNEL, il est important de lire les lames le même jour que le test pour éviter la perte de sensibilité et de conserver les lames dans un endroit sombre et frais pour protéger les colorants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter l’apoptose et la mort cellulaire à l’aide de deux méthodes de détection différentes dans de petits échantillons de tissus comme la peau d’amphibien.
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Aperçu
Cette étude examine l'impact de l'agent pathogène fongique amphibien Batrachochytrium dendrobatidis sur l'apoptose et la mort cellulaire dans le tissu épidermique des grenouilles. En utilisant l'histologie in situ TUNEL et l'analyse des protéines caspase 3/7, la recherche vise à élucider la relation entre l'infection et la mort cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Maladies de la faune
- Biologie cellulaire
Contexte
- La chytridiomycose constitue une menace importante pour les populations d'amphibiens.
- La compréhension des mécanismes de mort cellulaire peut éclairer les efforts de conservation.
- L'apoptose pourrait jouer un rôle dans la réponse aux infections fongiques.
- De petits échantillons de tissu permettent des analyses répétées tout au long de l'infection.
Objectif de l'étude
- Quantifier la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles infectées par la chytridiomycose.
- Déterminer les différences d'apoptose entre les grenouilles infectées et non infectées.
- Analyser l'évolution temporelle de l'apoptose au cours de l'infection.
Méthodes utilisées
- Marquage terminal des cassures de l'ADN par la transférase dUTP (TUNEL) pour l'analyse histologique.
- Analyse protéique de la caspase 3/7 pour l'évaluation en série temporelle.
- Préparation de lames de verre hydrophiles avec des échantillons de tissus.
- Déparaffinisation des coupes de tissus à l'aide de lavages au xylène et à l'éthanol.
Résultats principaux
- Des différences dans les taux d'apoptose ont été observées entre les grenouilles infectées et non infectées.
- L'analyse de séries chronologiques a révélé des tendances dans la mort cellulaire au cours de l'infection.
- Les méthodes ont démontré leur efficacité pour analyser de petits échantillons de tissus.
- Les connaissances acquises pourraient contribuer à la compréhension des réponses immunitaires face à l'infection.
Conclusions
- L'étude fournit des données précieuses sur les effets de la chytridiomycose sur les cellules épidermiques des grenouilles.
- Comprendre l'apoptose dans ce contexte pourrait contribuer aux stratégies de conservation de la faune.
- De futures recherches pourraient explorer les mécanismes immunitaires contre les infections fongiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette étude montre comment les tests d'apoptose peuvent être utilisés pour évaluer les lésions tissulaires induites par des agents pathogènes dans des modèles de maladies chez la faune sauvage, en fournissant un cadre pour l'atténuation mécanistique des risques lors de la validation précoce des cibles. En quantifiant la mort cellulaire épidermique chez des grenouilles infectées par Batrachochytrium dendrobatidis, cette approche renforce la fiabilité prédictive dans l'évaluation des interactions hôte-pathogène et oriente la découverte de biomarqueurs transposables. L'utilisation de petites biopsies tissulaires permet un échantillonnage longitudinal, essentiel pour suivre l'évolution de la maladie et l'efficacité des interventions thérapeutiques dans les systèmes précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en distinguant l'apoptose induite par le pathogène des mécanismes de défense de l'hôte dans le tissu épidermique.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données spatialement résolues sur la mort cellulaire grâce à la coloration TUNEL, clarifiant ainsi les mécanismes de perturbation tissulaire dans les modèles de maladies infectieuses.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en corrélant l'activité des caspases 3/7 à la charge infectieuse au fil du temps, permettant des profils dose-réponse et temporels.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Établit des protocoles normalisés pour la détection de l'apoptose dans de petits échantillons de tissus, permettant un criblage reproductible de composés dans des contextes où les matériaux sont limités.
- Valeur opérationnelle : Le dosage de la caspase 3/7 offre une compatibilité élevée pour les expériences en mode haut débit, tandis que la technique TUNEL permet de valider les profils spatiaux de l'apoptose.
- Préparation du test : La microscopie fluorescente et les détections luminescentes produisent des résultats quantitatifs adaptés à l'optimisation des tests et à la reproductibilité entre laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre l'apoptose épidermique et la gravité de la maladie, soutenant une concordance des biomarqueurs entre les données moléculaires et l'évolution clinique de l'infection.
- Valeur opérationnelle : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque en suivant la dynamique des caspases 3/7 au cours des différentes phases de l'infection dans des études longitudinales.
- Continuité translationnelle : Montre comment les dosages histologiques et biochimiques de l'apoptose peuvent être combinés pour renforcer la validité préclinique dans les modèles de maladies infectieuses.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase précoce de découverte en fournissant des mesures de l'apoptose qui éclairent la validation de la cible et l'identification de composés candidats, en particulier dans les études où l'accès au tissu limite l'histologie conventionnelle.
- Découverte en biologie : Permet de tester l'hypothèse selon laquelle l'exposition à un agent pathogène induit ou supprime l'apoptose dans les tissus hôtes, clarifiant ainsi les mécanismes de dommages tissulaires.
- Écrantage : Le dosage des caspases 3/7 permet un écrantage quantitatif et évolutif de modulateurs affectant l'apoptose à partir de petits échantillons de biopsie.
- Analytique : Les signaux luminescents et fluorescents fournissent des mesures quantifiables et normalisées pour comparer l'apoptose entre différentes conditions et points temporels.
- Recherche translationnelle : Corrèle l'activité moléculaire de l'apoptose avec les modifications histopathologiques, soutenant la qualification de biomarqueurs dans les modèles précliniques.
- Réutilisation en milieu professionnel : L'approche combinée TUNEL et caspase 3/7 établit une plateforme reutilisable de profilage de l'apoptose pour des études sur les maladies infectieuses et la toxicologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en distinguant la localisation et la cinétique de l'apoptose dans les tissus infectés par rapport aux tissus témoins.
- Valeur opérationnelle : Des protocoles normalisés de préparation des lames et d'imagerie garantissent la reproductibilité entre laboratoires et lots d'échantillons.
- Valeur stratégique : Permet des décisions précoces de type « aller/ne pas aller » en fournissant des biomarqueurs précoces du stress tissulaire et de l'impact du pathogène.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des cibles selon le risque en quantifiant l'apoptose comme indicateur fonctionnel du mécanisme de la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie, en microscopie de fluorescence et en extraction de protéines à partir d'échantillons tissulaires limités.
- Dépend de l'accès à un cryostat, à un microscope fluorescent et à un lecteur de plaques luminescent pour les tests TUNEL et caspase 3/7.
- Exige une standardisation entre utilisateurs pour la coupe des tissus, la durée de coloration et les paramètres d'imagerie afin de maintenir la sensibilité du test.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles nécessite une validation de la pénétration des anticorps et de l'accessibilité des enzymes dans différents types de tissus.
- Limite pratique : les petites biopsies de bout de doigt limitent le rendement en protéines, ce qui impose le recours à des méthodes alternatives de normalisation, comme l'estimation de la surface cutanée par imagerie, afin d'éviter la consommation excessive d'extrait.
