Name: Construction du bactériophage synthétique affiche Fab bibliothèque avec diversité sur mesure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Apprenez à construire une bibliothèque d'anticorps synthétiques humains affichés sur phage avec diversité sur mesure. Cette méthode permet de remplacer les techniques traditionnelles par immunisation animale.

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Les auteurs apprécient Dr Frederic Fellouse du labo pour des commentaires critiques sur la construction de bibliothèque de phage Fab synthétique de Kunkel méthode basée Sidhu. Les auteurs apprécient Mme Alevtina Pavlenco et autres membres du laboratoire pour l’aide précieuse de préparation haute efficacité electro-compétente Sidhu cellules d’Escherichia coli et haute qualité dU-ADN simple brin. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant No. : 81572698, 31771006) à DW et par l’Université de ShanghaiTech (Grant No. : F-0301-13-005) au laboratoire de génie d’anticorps.

<ol><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28799485">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li>
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<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
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<li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-Friendly+Affinity+Reagents%3A+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li>
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<li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li>
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<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody%3A+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li>
<li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li>
<li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li>
<li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+antibody+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
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<li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492(2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour construire la grande diversité, phage-affiche les bibliothèques Fab, contrôle qualité check-points sont nécessaires pour surveiller les différentes étapes de la construction, y compris la compétence des cellules capables d’electro, de qualité du modèle dU-ADN simple brin, efficacité de CCC-dsDNA synthèse, titre après électroporation, pliage Fab et la diversité des acides aminés des CDRs par séquençage de clones de Fab-phage.
Rendement élevé et la pureté dU-ssDNA est essentiel pour taux él...

mAbs ont des applications larges, allant de la recherche fondamentale à la thérapeutique et le diagnostic de la maladie. À partir de 2016, plus de 60 mAbs ont été approuvés par les United States Food Drug Administration (FDA) pour le traitement clinique des maladies auto-immunes, le cancer et les maladies infectieuses1,2.
En 1975, Kohler et Milstein a signalé une technique pour la production continue d’anticorps d’une spécificité unique clonale provenant d’une source cellulaire dénommée « hybridomes » et cette technique est par la suite devenu la pierre angulaire de la médecine et l’industrie3 ,4. Génération du mAbs par cette méthode nécessite différentes étapes, y compris la production de l’antigène, immunisation de souris, extraction des lymphocytes B, fusion de cellules de B avec cellules myélomateuses pour former des hybridomes immortel, sélection de clone et pour des applications thérapeutiques, humanisation est nécessaire pour éviter les humains d’anticorps anti-souris (HAMA)4,5. Toutefois, pour cette technologie, y compris les toxines, agents pathogènes et des protéines hautement conservées des antigènes sont relativement inefficaces pour déclencher une réponse immunitaire in vivo pour mAb production5.
En 1978, Hutchison et coll. ont signalé l’utilisation d’un oligonucléotide de mutagenèse directe d’un résidu dans un simple brin bactériophage virus6. En 1985, Smith a indiqué que les fragments de gènes étrangers peuvent être fusionnés dans le cadre avec le gène codant pour la protéine de capside phage III et donc peuvent être affichées sur l’aire de phage sans compromettre son infectiosité7. Ces travaux de pionniers jeté les bases pour la construction ultérieure des bibliothèques phage-affiche anticorps immunitaire, naïf et synthétique forme avec les formats de chaîne unique variable fragment (scFv) et fragment de liaison de l’antigène (Fab) pour thérapeutique mAb development8,9. Du point de vue technique, développement axée sur l’affichage des anticorps phage propose une approche complémentaire au développement axée sur les hybridomes mAb qui peut aider à contourner les limitations que peuvent poser certains antigènes et l’humanisation du processus qui anticorps hybridome nécessitent souvent5. À partir de 2016, 6 phage affichage dérivé mAbs ont été approuvés dans le marché, y compris Humira, l’un des plus réussis mAbs utilisé pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, et de nombreux candidats d’anticorps dérivés affichage phage sont actuellement à différents stades de la clinique enquête10.
Immunitaire et naïve bibliothèques anticorps phage, la diversité des déterminant la complémentarité régions (CDRs) de chaîne légère et lourde est dérivé du répertoire immunitaire naturel (c'est-à-diredes cellules B). En revanche, la diversité des CDRs dans les bibliothèques d’anticorps bactériophage synthétique est entièrement artificielle. Des approches synthétiques pour la construction de la bibliothèque offrent un contrôle précis sur la conception de la diversité des séquences et offrent des possibilités d’études mécanistes de la structure des anticorps et fonctionnent11,12. En outre, le cadre pour les bibliothèques synthétiques peut être optimisé avant la construction de la bibliothèque pour faciliter en aval, le développement industriel à grande échelle11,12.
En 1985, Kunkel a signalé une approche de mutagenèse basés sur un modèle simple brin ADN (ADN simple brin) à introduire des mutations dirigée dans bactériophage M13 efficacement13. Cette approche a été par la suite largement utilisée pour la construction de bibliothèques phage-affiché. Chimiquement synthétisés oligonucléotides d’ADN visant à introduire la diversité dans les CDRs Fab sont incorporés dans un phagemid avec un modèle de colonne vertébrale d’anticorps. Dans ce processus, le phagemid s’exprime comme un ADN simple brin contenant de l’uracile (dU-ADN simple brin) et les oligonucléotides sont recuites sur les CDRs et étendus pour synthétiser l’ADN à double brin (dsDNA) en présence de T7 ADN polymérase et T4 DNA ligase. Enfin, ds-ADN généré peut être introduit dans Escherichia coli par électroporation.
Pour forte diversité, construction de la bibliothèque de phage-affiché, électroporation haute tension d’un mélange de deux composants de cellules capables d’electro et de façon covalente dsDNA circulaire fermé (CCC-ADNdb) doit être préparé soigneusement. Sidhu et coll. modifié la préparation de cellules capables d’electro et d’ADN de méthodes traditionnelles et grandement amélioré bibliothèque diversité14.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de construction des synthétiques bibliothèques Fab phage-affichée avec les diversités de de9-10 1010 obtenue avec une seule électroporation. La figure 1 représente une vue générale de construction de la bibliothèque, y compris : 1) préparation de haut rendement cellule electro-compétente ; 2) extraction dU-ADN simple brin ; 3) méthode de Kunkel base mutagénèse oligonucléotide-dirigée ; 4) électroporation et calcul de la taille de la bibliothèque ; 5) protéine A/L-base ELISA pour le pliage et l’évaluation de la diversité fonctionnelle ; et 6) analyse des séquences ADN de diversité. Tous les réactifs, les souches et les équipements sont répertoriées dans le tableau du matériau. Le tableau 1 illustre la configuration du réactif.

<table><tbody><tr><td><Réactifs > forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Tris, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP mélanger</td><td>la solution GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>contenant 25 mM chacun de dATP, dCTP, dGTP et dTTP.</td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB)</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X</td><td>TAE Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline, carb</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL dans l’eau,&nbsp ; 0,22 &mu ; M Filtre-Stérilisation, concentration de travail : 100 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Chloramphénicol, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL dans de l’éthanol, 0,22 &mu ; m Filtrer-stériliser, concentration de travail : 10 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>Gélose granulée</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 substrat peroxydase</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine, kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL dans l’eau,&nbsp ; 0,22 &mu ; m Filtre-stérilisation, concentration de travail : 50 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td> ! ATTENTION Le NaOH provoque des brûlures.</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A-HRP conjuguée</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kit</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Protéine recombinante L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucléotide kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tétracycline, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/mL dans l’eau, 0. 22 &mu ; m Filtrer-stériliser, concentration de travail : 10 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol ultrapur</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL dans de l’éthanol, concentration de travail : 0,25 &mu ; g/mL.</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Génotype : dut-&nbsp ; ung-&nbsp ; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Utilisé pour la préparation de dU-ssDNA.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Génotype : [F’proAB+lacIq lacZ&Delta ; M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta ; (araABC-leu)7679 et Delta ; lacX74 galUgalK rpsL thi. Optimisé pour l’électroporation à haut rendement et la production de bactériophages filamenteux.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation à espace de 0,2 cm</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 puits 2mL Plaques à puits profonds</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>Immunoplaques Maxisorp à 96 puits</td><td>Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>Fioles à chicanes</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles à centrifuger</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 Électroporateur</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnétique barres d’agitation</td><td>Centrifugeuse Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à grande vitesse</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de microplaques</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur de liquides pour 96 et 384 puits</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette mutilienne</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrateur</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

construction du bactériophage synthétique affiche fab bibliothèque avec diversité sur mesure

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Demande d’anticorps monoclonaux (ACM) dans la recherche fondamentale et de la médecine est en augmentation chaque année. Hybridome a été la méthode dominante pour mAb développement depuis son premier rapport en 1975. Comme une technologie alternative, méthodes d’affichage bactériophage mAb développement sont plus en plus attrayantes car Humira, du premier anticorps dérivés de phage et l’un du mAbs Best-seller, a été approuvé pour le traitement clinique de la polyarthrite rhumatoïde en 2002. Comme un animal non fondée mAb développement de la technologie, affichage de phage contourne immunogénicité des antigènes, humanisation et maintenance animale qui sont exigés d’hybridome traditionnel technicisées anticorps développement. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de construction des synthétiques bibliothèques Fab phage-affichée avec les diversités de de9-10 1010 obtenue avec une seule électroporation. Ce protocole se compose de : 1) préparation de haut rendement cellule electro-compétente ; 2) extraction de l’uracile-contenant de l’ADN simple brin (dU-ssDNA) ; 3) méthode de Kunkel base mutagénèse oligonucléotide-dirigée ; 4) électroporation et calcul de la taille de la bibliothèque ; 5) protéine A/L-base-immuno enzymatique (ELISA) pour le pliage et l’évaluation de la diversité fonctionnelle ; et 6) analyse des séquences ADN de diversité.

Suivant l’organigramme de la construction de la bibliothèque Fab (voir Figure 1), nous avons établi M13KO7 helper phage préalablement infectées par e. coli SS320 cellules capables d’electro. L’efficacité de ces cellules capables d’electro est estimée à 2 X 109 UFC/µg lorsqu’il est l’épine dorsale de Fab phagemid pour la construction de la bibliothèque a été utilisé (Figure 4).
<p class="jove_content" fo:ke...

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour la construction d’une bibliothèque d’anticorps synthétiques phage-affiché avec diversité sur mesure. Anticorps synthétiques ont des applications larges depuis la recherche fondamentale pour le diagnostic de la maladie et la thérapeutique.

Construction du bactériophage synthétique affiche Fab bibliothèque avec diversité sur mesure

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir aux lecteurs une expérience pratique détaillée dans la construction d’une bibliothèque d’anticorps humains synthétiques affichés par phage avec une diversité adaptée. Les banques d’anticorps synthétiques exposées par phage ont un grand potentiel pour remplacer les techniques traditionnellement basées sur l’hybridome pour le développement d’anticorps monoclonaux thérapeutiques en contournant la nécessité de l’immunisation animale et de l’humanisation ultérieure des anticorps. L’avantage de la bibliothèque d’anticorps synthétiques est qu’une diversité adaptée est introduite dans un cadre d’anticorps en utilisant des informations sur la diversité positionnelle qui soutient une interaction de haute affinité et des propriétés protéiques souhaitables.Au-delà de l’utilité pratique, les banques d’anticorps synthétiques peuvent également être utilisées pour sonder expérimentalement le rôle d’acides aminés spécifiques dans les interactions biomoléculaires, soutenant ainsi leur propre amélioration continue. Cette procédure sera démontrée par un étudiant diplômé nommé Zhenwei Zhong et le docteur Shin-chen Hou de notre laboratoire. Être

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique d’affichage des phages pour isoler des phages pré-modifiés exprimant des protéines ayant une grande affinité pour la protéine cible.

Utilisation de l’affichage des phages pour sélectionner des protéines ayant une forte affinité pour une protéine cible

La présentation de phage est une technique puissante pour capturer des protéines ou des fragments protéiques qui interagissent avec une molécule d'intérêt immobilisé. Une fois la décision du type de banque d'ADNc de phage pour créer et écran a été fait, le protocole décrit ici permet la sélection d'affinité efficace menant à l'identification des interacteurs.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Une méthode est décrite avec accompagnement visuel pour mener évolutives, des sélections à haut débit à partir de banques d'anticorps combinatoires synthétiques de phages contre des centaines d'antigènes simultanément. En utilisant cette approche parallèle, nous avons isolé des fragments d'anticorps qui présentent une affinité et une spécificité pour divers antigènes qui sont fonctionnelles dans des dosages immunologiques standard.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

Une nouvelle génération de plates-formes de transcription-traduction acellulaire a été conçue pour construire des systèmes biochimiques in vitro par le biais de l’exécution des circuits de gène. Dans cet article, nous décrivons comment bactériophages MS2, ΦΧ174 et T7, sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système tous les e. coli acellulaire TXTL.

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

Les protocoles décrits permettent la construction, la caractérisation et la sélection (contre une cible de choix) d’une bibliothèque « domainome » fabriquée à partir de n’importe quelle source d’ADN. Ceci est réalisé par un pipeline de recherche qui combine différentes technologies : affichage de phage, reporter pliant et séquençage de génération suivant avec un outil web pour l’analyse des données.

Interactome-Seq : Un protocole pour la Construction de la bibliothèque de Domainome, de Validation et de sélection par Phage Display et de prochaine génération séquençage

La création de systèmes de dimerisation des protéines induits chimiquement avec l'affinité et la spécificité souhaitées pour n'importe quelle petite molécule donnée ligand aurait beaucoup d'applications biologiques de détection et d'actionnement. Ici, nous décrivons une méthode efficace et généralisable pour l'ingénierie de novo des systèmes de dimerization induits chimiquement par l'intermédiaire de la sélection progressive d'une bibliothèque d'anticorps combinatorial de phage-affiché.

Création de systèmes de dimerisation des protéines hautement spécifiques induits par des produits chimiques par stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Un-Domain Un-Domain Un-Domain Body Library

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle critique de la protéine, dont le dérèglement a été impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Ce protocole détaille comment l’affichage des phages peut être utilisé pour isoler de nouvelles variantes d’ubiquitine qui peuvent lier et moduler l’activité des ligas E3 qui contrôlent la spécificité, l’efficacité et les modèles d’ubiquitination.

Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

Une méthode simple pour l'identification de pathogènes bactériens priorité est d'utiliser le phage journaliste génétiquement modifiés. Ces phages journaliste, qui sont spécifiques à leur espèce hôte particulier, sont capables de transduire rapidement une réponse de signal bioluminescent aux cellules hôtes. Nous décrivons ici l'utilisation de phages journaliste pour la détection...

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour surveiller le comportement seule cellule de bactéries différentes dans le temps en utilisant la fluorescence automatisée de microscopie time-lapse. En outre, nous fournir des lignes directrices comment analyser les images de microscopie.

Imagerie de cellules vivantes de la<emBacillus subtilis> Et Streptococcus pneumoniae À l&#39;aide automatisée de microscopie time-lapse

Nous décrivons une méthode efficace pour séparer l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et des molécules d'ARN à partir de l'environnement communautés virales. Les acides nucléiques sont fractionnés par chromatographie d'hydroxyapatite avec des concentrations croissantes de phosphate contenant du tampon. Cette méthode permet l'isolement de tous les types d'acides nucléiques viraux dans des échantillons environnementaux.

Séparation de l&#39;ADN simple brin, double brin de l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir d&#39;un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d&#39;hydroxyapatite

Apprenez à construire une bibliothèque d'anticorps synthétiques humains affichés sur phage avec diversité sur mesure. Cette méthode permet de remplacer les techniques traditionnelles par immunisation animale.

Construction du bactériophage synthétique affiche Fab bibliothèque avec diversité sur mesure

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