Construction du bactériophage synthétique affiche Fab bibliothèque avec diversité sur mesure
1 mai 2018
Ce protocole décrit une procédure détaillée pour la construction d’une bibliothèque d’anticorps synthétiques phage-affiché avec diversité sur mesure. Anticorps synthétiques ont des applications larges depuis la recherche fondamentale pour le diagnostic de la maladie et la thérapeutique.
L’objectif global de cette procédure est de fournir aux lecteurs une expérience pratique détaillée dans la construction d’une bibliothèque d’anticorps humains synthétiques affichés par phage avec une diversité adaptée. Les banques d’anticorps synthétiques exposées par phage ont un grand potentiel pour remplacer les techniques traditionnellement basées sur l’hybridome pour le développement d’anticorps monoclonaux thérapeutiques en contournant la nécessité de l’immunisation animale et de l’humanisation ultérieure des anticorps. L’avantage de la bibliothèque d’anticorps synthétiques est qu’une diversité adaptée est introduite dans un cadre d’anticorps en utilisant des informations sur la diversité positionnelle qui soutient une interaction de haute affinité et des propriétés protéiques souhaitables.
Au-delà de l’utilité pratique, les banques d’anticorps synthétiques peuvent également être utilisées pour sonder expérimentalement le rôle d’acides aminés spécifiques dans les interactions biomoléculaires, soutenant ainsi leur propre amélioration continue. Cette procédure sera démontrée par un étudiant diplômé nommé Zhenwei Zhong et le docteur Shin-chen Hou de notre laboratoire. Être
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Aperçu
Ce protocole décrit une procédure détaillée pour la construction d'une bibliothèque d'anticorps synthétiques exposés sur phage, présentant une diversité ajustée. De telles bibliothèques pourraient remplacer les techniques traditionnelles basées sur les hybridomes pour le développement thérapeutique d'anticorps monoclonaux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biotechnologie
- Immunologie
Contexte
- Les anticorps synthétiques peuvent être conçus pour présenter des propriétés spécifiques.
- La technologie d'affichage sur phage permet la sélection d'anticorps à forte affinité.
- Les méthodes traditionnelles impliquent l'immunisation animale, que ce protocole vise à contourner.
- Une diversité sur mesure augmente le potentiel d'applications thérapeutiques efficaces.
Objectif de l'étude
- Offrir une expérience pratique dans la construction de bibliothèques d'anticorps.
- Démontrer les avantages des bibliothèques synthétiques par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Explorer le rôle d'acides aminés spécifiques dans les interactions biomoléculaires.
Méthodes utilisées
- Construction d'une bibliothèque synthétique d'anticorps humains.
- Techniques d'affichage sur phage pour la sélection d'anticorps.
- Analyse des interactions et des propriétés des anticorps.
- Démonstration par des étudiants diplômés et des membres du corps professoral.
Résultats principaux
- Construction réussie d'une bibliothèque d'anticorps synthétiques.
- Démonstration d'interactions à haute affinité grâce à une diversité ajustée.
- Compréhension du rôle des acides aminés dans la fonctionnalité des anticorps.
- Applications potentielles en diagnostic et en thérapeutique.
Conclusions
- Les bibliothèques d'anticorps synthétiques offrent une alternative prometteuse aux méthodes traditionnelles.
- Une diversité conçue sur mesure peut conduire à une amélioration des propriétés des anticorps.
- Des recherches supplémentaires peuvent accroître l'utilité des bibliothèques synthétiques dans diverses applications.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les bibliothèques synthétiques d'anticorps Fab exposés sur phage permettent la découverte d'anticorps indépendante de la cible en introduisant une diversité ciblée dans des cadres d'anticorps humains, réduisant ainsi la dépendance à l'égard de l'immunisation animale et accélérant l'identification de candidats thérapeutiques. Cette approche soutient la validation précoce des cibles en fournissant des bibliothèques à haute diversité pour le criblage contre des antigènes pertinents pour la maladie, améliorant les taux de succès et réduisant les risques lors de la sélection des candidats principaux. La méthode renforce la confiance prédictive quant à la fonctionnalité des anticorps grâce à une diversification contrôlée des régions déterminant la complémentarité.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'exploration d'hypothèses thérapeutiques en criblant diverses variantes de Fab contre des cibles d'intérêt.
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme de génération d'anticorps sans recourir aux animaux, éliminant ainsi les délais liés à l'immunisation et les goulots d'étranglement de l'humanisation.
- Valeur prédictive : Une diversité adaptée fondée sur des connaissances positionnelles augmente la probabilité d'isoler des candidats à haute affinité et facilement développables.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des bibliothèques d'anticorps Fab exposés sur phage avec une diversité quantifiée (10^9–10^10) pour des campagnes de panning robustes.
- Valeur opérationnelle : La construction standardisée de bibliothèques par électroporation et mutagenèse de Kunkel assure une reproductibilité d'un lot à l'autre.
- Préparation aux tests : Un ELISA basé sur la protéine A/L permet l'évaluation fonctionnelle des fragments Fab repliés après sélection.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la progression de l'identification des hits à l'optimisation des candidats à l'aide de clones Fab vérifiés par séquençage.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Facilite l'analyse des contributions des acides aminés à la liaison et à la stabilité, fournissant des éléments pour l'évaluation de la développabilité.
- Pertinence préclinique : Permet la production de fragments Fab d'origine humaine, adaptés à une ingénierie ultérieure du domaine Fc et à une conversion de format.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la génération de bibliothèques pour un criblage contre des antigènes purifiés ou des cibles cellulaires, suivi d'un criblage par ELISA et d'un séquençage pour l'identification des candidats prometteurs.
- Biologie de la découverte : Permet l'exploration fondée sur des hypothèses des interactions anticorps-cible grâce à une mutagenèse contrôlée des boucles CDR.
- Tri : Produit des bibliothèques exposées sur phage, compatibles avec des protocoles standards de panning dirigés contre des antigènes immobilisés ou solubles.
- Analyse : L'analyse de la séquence d'ADN de la diversité de la bibliothèque permet de suivre l'enrichissement et l'évolution clonale au cours des cycles de sélection.
- Recherche translationnelle : Fournit des fragments Fab dont la séquence est confirmée et qui conviennent à l'expression, à la purification et à la caractérisation biophysique.
- Réutilisation en milieu industriel : La construction de bibliothèques par électroporation est évolutive et adaptable à plusieurs cadres d'anticorps et classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les interactions anticorps-cible en permettant une exploration systématique de la diversité.
- Valeur opérationnelle : Des cellules électro-compétentes à haute efficacité et une mutagenèse standardisée garantissent la qualité et la reproductibilité de la bibliothèque.
- Valeur stratégique : Accélère l'identification des candidats prometteurs en augmentant la probabilité d'isoler dès les premières étapes de la découverte des fixateurs fonctionnels à forte affinité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque grâce à des bibliothèques diversifiées et validées par séquençage, améliorant ainsi les profils de taux d'échec.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en biologie moléculaire, en manipulation de phages et en criblage fonctionnel fondé sur ELISA.
- Dépend de l'efficacité de l'électroporation et de l'extraction d'ADN simple brin contenant de l'uracile pour l'efficacité de la mutagenèse.
- Nécessite une standardisation des conditions d'ELISA basées sur la protéine A/L entre les équipes afin d'assurer une évaluation cohérente du repliement.
- Adaptable à diverses structures d'anticorps humains, mais exige une optimisation spécifique à chaque structure des sites de mutagenèse.
- L'évaluation de la diversité de la bibliothèque par séquençage de l'ADN est essentielle pour confirmer que la diversité théorique est atteinte après électroporation.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
1:18
Electroporation and Calculation of the Library Size
6:02
Quality Assessment by Protein A/L Direct Binding ELISA Assay and Sequencing
9:43
Results: Conversion of dU-ssDNA to CCC-DNA and Phage Titration for Calculation of Library Size
11:07
Conclusion
