Microdissection de tissu rénal primaire Segments et intégration avec la technologie de nouvelle construction exempte d’échafaudage

Tissulaire rénales constructions offrent une solution pour la pénurie d’organes et les effets délétères de la dialyse. Nous décrivons ici un protocole se rapportant au micro disséquer les reins murins pour l’isolement des segments cortico-médullaire. Ces segments sont implantés dans des constructions cellulaires exempte d’échafaudage, formant organoïdes rénale.

L’objectif global de cette procédure de dissection microscopique est d’isoler des segments discrets de tissu rénal vivant avec une architecture rénale intacte pour des applications d’ingénierie tissulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, telles que : des segments entiers de tissus d’organes primaires isolés peuvent-ils être récoltés stérilement et maintenus en vie en culture ? Le principal avantage de cette technique est que les segments contiennent une architecture rénale intacte, par opposition à l’utilisation de lignées cellulaires pour recréer un organe complexe avec plus de 26 types de cellules différents.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’insuffisance rénale terminale, car ces constructions amélioreront la filtration et pourraient aider les patients à éviter la dialyse. Pendant la chirurgie, portez un équipement chirurgical approprié, y compris un masque et une casquette, afin de minimiser le risque de contamination. De même, faites tout votre possible pour maintenir la stérilité tout au long du processus.

Commencez les préparatifs en drapant la table d’opération. Ensuite, ouvrez l’emballage des instruments autoclavés sur les champs stériles. Ils doivent comprendre trois petits hémostatiques, des pinces fines avec dents, des pinces fines sans dents et des ciseaux à iris droits.

Couvrez le centre de la table d’opération avec un deuxième champ chirurgical non fenestré. Avant de mettre en place la salle d’opération, préparez 50 millilitres de DBPS supplémenté en antibiotiques et aliquotez cinq millilitres dans un tube de 15 millilitres. Maintenant, anesthésie une souris C57 black six âgée de huit à 12 semaines et surveillez périodiquement le niveau d’anesthésie en évaluant son réflexe de pédale avec un pincement ferme de l’orteil.

Ensuite, utilisez une crème dépilatoire pour enlever tous les poils de la région ventrale du torse et rincez la crème et les poils à l’eau distillée. Transférez ensuite la souris sur la table d’opération et placez-la en décubitus dorsal sous le champ non fenestré. Maintenant, découpez une fenestration carrée de deux centimètres dans le drapé sur l’abdomen de la souris.

Ensuite, frottez la peau exposée avec de la povidone iodée suivie de 70 % d’éthanol trois fois pour stériliser la peau et terminer les préparatifs pour la chirurgie. Commencez la chirurgie à l’aide d’une pince fine avec des dents et des ciseaux à iris. Faites une incision cutanée de trois à quatre centimètres parallèlement à la ligne médiane, un demi-centimètre à gauche de la ligne médiane.

Ensuite, saisissez le péritoine à l’aide d’une pince fine sans dents et incisez avec des ciseaux à iris pour pénétrer dans la cavité abdominale. Appliquez ensuite des hémostatiques sur les bords latéraux supérieurs et inférieurs de la peau et du péritoine pour placer la tension latéralement et améliorer l’exposition. Maintenant, déplacez délicatement le contenu intestinal vers la droite de l’abdomen pour exposer le rein gauche.

Ensuite, placez doucement une traction sur le rein pour l’élever hors de l’abdomen. Placez maintenant un hémostat sur le hile du rein et utilisez des ciseaux à iris pour transecter l’uretère et les vaisseaux rénaux. Transférez ensuite le rein dans le tube de 1 % de pen-streptocoque DBPS sur de la glace.

Apportez ce tube à une hotte de culture stérile pour le traitement. Là, transférez le rein dans une boîte de Pétri de 60 millimètres et rincez-le deux fois avec cinq millilitres de DPBS frais contenant du calcium et du magnésium. Après le deuxième lavage, suspendez le rein dans cinq millilitres de DBPS frais dans une nouvelle boîte de 60 millimètres.

Préparez ensuite une boîte de Pétri supplémentaire contenant seulement cinq millilitres de DBPS pour une utilisation ultérieure. Continuez à utiliser des techniques stériles, y compris des gants stériles, un masque chirurgical et un bouffant pour minimiser les risques de contamination. Drapez ensuite la zone de la scène et la zone entourant le stéréomicroscope.

Ensuite, placez des feuilles adhésives en plastique sur les boutons de mise au point du microscope et vaporisez-les avec de l’éthanol à 70 %. Allumez ensuite l’illuminateur à col de cygne double pour éclairer la scène. Maintenant, sur les champs stériles, ouvrez un paquet d’instruments stérilisés contenant des pinces fines sans dents, un manche de scalpel, une lame de scalpel numéro 15, deux hémostats droits et deux aiguilles à alésage creux de calibre 30,5.

Placez la lame numéro 15 sur le manche du scalpel et fixez un hémostat à chaque embout d’adaptateur d’aiguille pour créer des instruments de dissection d’aiguille. Transférez maintenant les deux boîtes, l’une avec le rein dans le DPBS et l’autre uniquement le DPBS, dans la zone du microscope. Retirez le couvercle de la parabole et focalisez le microscope sur la surface antérieure ou postérieure du rein à un grossissement de 3,2 à 4X.

Ensuite, avec la main non dominante, utilisez des pinces fines sans dents pour percer et épingler le rein contre le plat aux pôles inférieur et supérieur du rein. Ensuite, avec la main dominante, utilisez la lame numéro 15 pour retirer la couche capsulaire fibreuse translucide de la surface exposée. Rasez le 0,5 millimètre le plus superficiel de la surface exposée de la surface du rein pour retirer le reste de la capsule.

Continuez en utilisant la lame numéro 15 pour disséquer une pyramide inversée de tissu de la zone décapsulée qui est d’environ deux millimètres carrés. Transférez ensuite le tissu dans le plat propre de DBPS et jetez le reste du rein. Concentrez-vous maintenant sur le tissu disséqué et diminuez le grossissement à 1,5 à 2,0X.

À l’aide des deux instruments à aiguille d’hémostat comme outils de coupe, coupez le fragment de tissu en morceaux de plus en plus petits jusqu’à ce que les segments de tissu aient la taille des pointes d’aiguille ou moins. Environ 50 segments devraient être produits. Il s’agit d’une partie essentielle de la procédure.

Chaque segment doit se rapprocher du diamètre de la pointe de l’aiguille de calibre 30-1/2 pour éviter les gros segments qui pourraient entraver la diffusion. Remettez le tissu dans le capot de culture tissulaire et retirez le DPBS à l’aide d’une micropipette P1000. Ensuite, ajoutez cinq millimètres de DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pen-streptocoque.

Ensuite, cultivez le tissu ou implantez-le immédiatement dans des constructions cellulaires. La viabilité des segments rénaux intacts produits par la procédure décrite a été examinée pendant trois jours en culture à l’aide d’un test de viabilité. L’AM calcique fluorescent vert est présent avec une activité d’estérase intracellulaire indicative de cellules vivantes.

L’homodimère-1 d’éthidium fluorescent rouge est observé avec une perte d’intégrité de la membrane plasmique. Lorsque les segments rénaux ont été intégrés dans des constructions de fibroblastes endothéliales sans échafaudage, le troisième jour, ils ont été incorporés aux constructions cellulaires pour former des structures intactes. Les constructions ont conservé leur réseau endothélial prévasculaire démontré par le marquage avec le facteur de von Willebrand.

Les cellules épithéliales rénales peuvent être observées en vert marquées par la cytokétaïne-18. Pour tester la fonctionnalité rénale in vitro, les constructions ont été incubées avec de l’albumine marquée au FITC. Bien que l’albumine résiduelle ait été trouvée loin des segments de tissu rénal intégrés, il y avait également des points chauds dans les cellules épithéliales tubulaires rénales.

Ces points chauds sont l’albumine qui traverse l’intraluminine, ce qui est censé représenter la recapture de l’albumine dans la construction cellulaire du segment rénal. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des segments rénaux à partir de reins murins pour des applications d’ingénierie tissulaire. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en une à 1 heure et demie.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, y compris l’ensemencement de constructions cellulaires, peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions concernant la fabrication et la caractérisation des constructions rénales. N’oubliez pas que travailler avec des instruments chirurgicaux et des bouteilles d’oxygène sous pression peut être extrêmement dangereux. Soyez prudent lorsque vous travaillez avec des objets pointus et n’oubliez pas d’ancrer les bouteilles d’oxygène à une paillasse de laboratoire.