Méthodes de prestation orale ARN double-brin d’induire l’interférence d’ARN dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation

L’objectif global de ces procédures est de démontrer une méthode d’administration orale naturelle. Pour les ARNdb spécifiques aux gènes, pour induire une interférence ARN in vivo et les insectes ravageurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon de délivrer des biomolécules à l’intérieur des insectes, à élucider l’effet des biopesticides moléculaires à base d’ARNi et à contrôler les insectes dans l’environnement.

Le principal avantage de cette technique est que cette administration par le biais d’un silençage génique médié par les acides nucléiques peut être appliquée à l’alimentation de la sève des plantes ainsi qu’aux insectes broyeurs. Bien que les méthodes ici démontrent l’administration d’ARN double brin aux hémiptères, comme la punaise marbrée, la punaise arlequin et le psylle asiatique des agrumes. Ils peuvent être appliqués à d’autres insectes.

Pour commencer le protocole, sélectionnez des punaises marbrées du 4e stade précoce, ou nymphes de la punaise marbrée, écloses de la masse d’œufs, et affamez-les pendant 24 heures avant de les nourrir à l’ARNdb. Ensuite, sélectionnez des haricots verts minces et certifiés biologiques et lavez-les avec une solution d’hypochlorite de sodium à 0,2 % pendant cinq minutes. Poursuivez avec trois lavages H2O à double distillation et laissez les grains sécher à l’air.

Une fois secs, coupez les haricots verts de l’extrémité du calice sur une longueur totale de 7,5 centimètres à l’aide d’une lame de rasoir propre. Plongez les haricots verts lavés et parés dans un micro-tube à centrifuger de deux millilitres sans capuchon contenant 300 microlitres de solution de contrôle. Faites des dilutions des ARNlc Z, JHAMT ou VGDSRNA synthétisés in vitro, en diluant 5 microgrammes, ou 20 microgrammes, et 300 microlitres d’ARN, de l’eau exempte d’ADN pour obtenir des concentrations finales de 0,017 microgramme par microlitre, ou 0,067 microgramme par microlitre respectivement.

Plongez les haricots verts lavés et parés dans un micro-tube à centrifuger sans capuchon de deux millilitres, contenant 300 microlitres de solution d’ARNdb. Enveloppez et scellez les bords des tubes de micro-centrifugeuse, en enfermant les grains immergés pour empêcher l’évaporation de la solution d’ARNdb et pour empêcher les animaux de pénétrer dans le tube de micro-centrifugeuse. Placez les tubes à la verticale à température ambiante pendant trois heures, pour permettre à la solution d’ARNdb de se charger dans tout le haricot vert par capillarité.

Placez les tubes dans des récipients de culture propres en polypropylène et placez 3 nymphes de punaise marbrée du 4e stade affamées dans les récipients de culture. Traitez trois insectes par récipient de culture. Chacun contenant trois haricots verts avec une solution de colorant alimentaire vert ou d’ARNdb.

Maintenez les insectes à 25 degrés Celsius et 72 % d’humidité relative, sous une température de 16L, 8D photopériode dans un incubateur. Laissez les insectes se nourrir des haricots verts immergés et absorbés dans l’ARNdb pendant cinq jours, et reconstituez-les avec des rations fraîches de haricots verts traités à l’ARNdb après trois jours. Sélectionnez des plantes ou des semis, et ne les arrosez pas pendant deux à trois jours avant de les utiliser, pour laisser le sol sécher à l’humidité, mais pas complètement sec.

À l’aide d’un flacon pulvérisateur pompé à la main, appliquez 200 millilitres de solution d’ARNdb sur la canopée inférieure. Échantillonnez la nouvelle croissance des arbres précédemment étêtés après 25 à 40 jours, en prélevant environ 10 feuilles à l’extrémité de quatre branches. Extrayez l’ARN total et analysez-le par RT-PCR et qPCR pour détecter la présence du déclencheur d’ARNdb appliqué.

De même, vaporisez localement 10 millilitres d’ARNdb dans la région inférieure d’un semis ou d’un petit feuillage d’arbre en pot. Sélectionnez des plantes ou des semis, et ne les arrosez pas pendant deux à trois jours avant de les utiliser, pour laisser le sol sécher, humide, mais pas complètement sec. Ensuite, ajoutez un litre de solution d’ARNdb au sol des grandes plantes en pot.

Ajoutez un litre d’eau au bout d’une heure. Appliquez 100 millilitres de solution d’ARNdb sur le sol d’arbres en pot d’un mètre de haut dans des sols partiellement secs. Laissez tremper les plantes qui reçoivent la solution d’ARNdb sous forme de trempage du sol, pendant 30 minutes.

Appliquez ensuite un traitement à base d’eau pour faciliter l’absorption par les racines. Sélectionnez des plants d’agrumes, des plantes nouvelles ou d’environ 3,5 ans pour injecter de l’ARNdb à l’aide du robinet de tige, également connu sous le nom de méthode d’injection du tronc. Enroulez l’embout en cuivre de chaque injecteur quatre à six fois avec une bande de film de plafond de 0,6 centimètre de large pour éviter les fuites près de l’embout.

Ensuite, remplissez les injecteurs de tronc d’arbre avec six millilitres de solution d’ARNdb diluée avec de l’ADN, de l’eau sans ARN. Percez des trous dans les agrumes à l’aide d’un foret de 10 millilitres et veillez à ne pas dépasser deux centimètres, soit environ la moitié du diamètre de la tige. Ensuite, injectez la solution dans le tronc de l’arbre et laissez l’injecteur dans le tronc pendant six à 10 heures pour permettre l’absorption de la solution d’ARNdb.

Laissez les insectes se nourrir des boutures des arbres traités 3, 10 et 30 jours après le traitement. Versez 30 grammes de l’absorbant d’argile dans un tube conique de 50 millilitres jusqu’à la marque de 35 millilitres. Versez 20 millilitres de solution d’ARNdb diluée dans de l’eau sans ADN et ARN dans le tube pour mouiller tout l’absorbant.

Fermez le tube conique, inclinez le tube pour aider à évacuer l’air, placez le tube à la verticale et laissez-le reposer pendant une à deux minutes pendant que les particules d’argile absorbent la solution. Ajoutez suffisamment d’argile imbibée d’ARNdb dans le mélange de sol pour remplir un pot d’un gallon. Mélangez et retournez le sol à la main pour bien mélanger l’argile imbibée de dsRNA dans le sol.

Utilisez le sol pour rempoter les semis sélectionnés pour le traitement à l’ARNdb. Arrosez le sol avec 200 millilitres d’eau plate, sans ARNdb, après 30 minutes à une heure. Poursuivez avec 100 millilitres d’eau plate.

Après 24 heures, mettez la plante sur un calendrier d’arrosage normal. Testez quatre à six feuilles des plantes en pot traitées avec des absorbants d’argile et de l’ARNdb chaque mois, après le traitement de l’ARNdb, en prélevant les feuilles les plus apicales de la nouvelle croissance de la plante. La QPCR de segments de haricots verts immergés dans de l’ARNdb synthétisé in vitro, spécifique de la punaise marbrée, ou ARNm de la punaise marbrée, a indiqué que l’induction réussie de l’ARNi était réussie car l’expression des cibles JHAMT et Vg était significativement réduite in vivo.

Ce mode d’administration est également efficace sur un autre ravageur hémiptère, la punaise arlequin. Comme l’indiquent leurs excréments de couleur verte. Après avoir regardé ces démonstrations visuelles, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de délivrer de l’ARN double brin aux insectes par ingestion orale pour induire des insectes ARNi in vivo.

Les progrès réalisés dans la technologie des nucléotides de l’ARNi continuent d’accroître les capacités des chercheurs à moduler l’ARN, l’expression des gènes et les niveaux de protéines dans un large éventail d’organismes vivants. Cela va des plantes aux insectes, en passant par les micro-organismes les plus difficiles. Ainsi, alors que le coût de production de l’ARN double brin continue de diminuer et que les méthodes d’administration et de stabilité continuent de s’améliorer, l’avenir des technologies ARNi continuera d’être utilisé pour résoudre des problèmes émergents et complexes.