Name: Méthodes de prestation orale ARN double-brin d’induire l’interférence d’ARN dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Découvrez une méthode de livraison orale d'ARN double-brin pour induire l'interférence d'ARN chez les insectes hémiptères phytophages. Cette technique permet de contrôler efficacement les ravageurs agricoles par des biopesticides moléculaires ciblés.

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Les auteurs tiennent à remercier Donald Weber et Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) pour offrir des BMSB et HB pour l’expérimentation et à maintenir les colonies ; et Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) et Jackie L. Metz (Université de la Floride, Fort Pierce, FL) pour l’entretien de la colonie, préparation des échantillons et des analyses.

1. BMSB élevage
<ol><li>Arrière BMSB insectes selon les directives de pratique de laboratoire standard et décrites précédemment63.</li>
	<li>Élever des insectes ACP (d. citri) sur Citrus macrophylla dans une serre (22 ° C) et de la lumière naturelle. Utiliser l’ACP adulte, environ 5-7 jours après l’éclosion.</li>
</ol>2. sélection des régions des gènes et la synthèse In Vitro d’ARNdb
<ol><li>Sélectionner des gènes spécifiques pour BMSB de transcriptome publiées antérieurement profils32.</li>
	<li>S’assurer que les régions d’intérêt sélectionné varient entre 200 et 500 paires de bases.</li>
	<li>Effectuer l’amplification génique (PCR) en utilisant les conditions décrites ci-dessous pour générer des fragments liés avec le gène sélectionné d’intérêt de l’ADN génomique. Voir le tableau 1 pour les oligonucléotides de gène-spécifique.<ol>
<li>Réaction de PCR : dans un tube de PCR de 0,25 mL, mélanger 5 µL de 10 X PCR tampon, 4 µL de dNTP mélange (2,5 mM), 2 µL de matrice d’ADN (50 ng/µL), 2,5 µL de chaque des amorces 1 et 2 (10 µM), 0,25 µL de l’ADN polymérase (5 U/µL) , et jusqu'à 50 µL d’eau DNase/RNase librement.</li>
		<li>Condition PCR : Cycle de la réaction PCR pour amplifier la région d’intérêt à 95 ° C pendant 3 min, suivi de 30 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s, 72° C pendant 1 min. Incuber la réaction à 72 ° C pendant une 10 mn supplémentaires purifier la réaction PCR en utilisant un kit de purification.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplifier les fragments PCR obtenus plus loin avec des amorces spécifiques de gènes flanqués de la séquence du promoteur T7 RNA polymérase (5'-GAA TTA ATA CGA CCT acte ATA GGG AGA-3') tel que mentionné plus tôt62.</li>
	<li>Utiliser le gène LacZ comme témoin négatif (mock) pour RNAi. NOTE : LacZ est un gène qui code pour la β-galactosidase amplifié à partir de l’ADN génomique Escherichiacoli (les amorces utilisées sont répertoriés dans le tableau 1).</li>
	<li>Effectuer en vitro transcription pour produire des ARNdb comme décrit plus tôt62.</li>
	<li>Dissoudre et remettre en suspension l’ARNdb résultant dans 150 µL DNase/RNase d’eau libre, mesurer la concentration et stocker à-80 ° C pour une utilisation future.</li>
</ol>3. livraison de dsRNA haricots verts à l’aide
<ol><li>Select tôt 4ème stade BMSB nymphes éclore de la même masse d’oeufs et les affamer pour 24 h avant l’ARNdb alimentation.</li>
	<li>Sélectionnez minces certifiés biologiques vert haricots (Phaseolus vulgaris L.) et laver avec une solution d’hypochlorite de sodium 0,2 % pendant 5 min. Remarque : Des haricots verts minces ont été choisis afin que les haricots peuvent facilement être logés dans les tubes de microcentrifuge de 2 mL.</li>
	<li>Laver 3 fois avec les ddH2O et laisser sécher à l’air.</li>
	<li>Couper les haricots verts de l’extrémité du calice d’une longueur totale de 7,5 cm à l’aide d’une lame de rasoir propre.</li>
	<li>Plonger les haricots verts lavés et taillés dans un tube de microcentrifuge de cap-moins 2 mL contenant 300 µL de solution de contrôle (un 01:10 dilution du colorant alimentaire vert (ingrédients : eau, Propylène Glycol, Fd & C jaune 5, Fd & C bleu 1 et Propylparaben comme agent de conservation)).</li>
	<li>Faire des dilutions de l' in vitro synthétisé LacZ, JHAMT ou Vg ARN doubles brins par dilution 5 µg ou 20 µg dans 300 µL d’eau libre de RNase ni DNase pour donner une concentration finale de 0,017 µg/µL ou 0,067 µg/µL, respectivement.</li>
	<li>Plonger les haricots verts lavés et taillés dans un tube de microcentrifuge de cap-moins 2 mL contenant 300 µL de solution de dsRNA (à l’étape 3.6).</li>
	<li>Emballer et sceller les bords des tubes de microcentrifuge enfermant les grains immergés pour éviter l’évaporation de la solution de l’ARNdb et à empêcher les animaux de pénétrer dans le tube de microcentrifuge.</li>
	<li>Placez ces tubes de manière verticale à température ambiante pendant 3 h permettre à la solution de dsRNA de charger tout au long de l’haricot vert par capillarité.</li>
	<li>Placer les tubes dans les récipients de culture propre (polypropylène). Place trois affaméth 4 larves de stade BMSB dans les récipients de culture.</li>
	<li>Traiter les trois animaux par récipient de culture chacune contenant trois haricots verts avec la solution de coloration ou de dsRNA nourriture verte. Maintenir les insectes à 25 ° C et 72 % d’humidité relative, sous une photopériode de 16 L : 8 dans un incubateur.</li>
	<li>Laisser les insectes pour se nourrir sur les haricots verts (immergés et absorbé avec dsRNA) pendant 5 jours mais reconstituer avec des régimes frais de dsRNA perles de traitement vert après 3 jours.</li>
</ol>4. en temps réel Quantitative (qPCR) analyse d’Expression suivants Arni Mediated silençage génique dans BMSB
<ol><li>Mesurer l’effet de l’ARNi sur les niveaux d’expression de transcription de qPCR.</li>
	<li>Isoler l’ARN total des animaux traité de dsRNA et synthétiser l' ADNc62.</li>
	<li>Configurer les réactions de qPCR utilisant un système PCR en temps réel et les amorces énumérés au tableau 1. Utilisez la condition suivante de cyclisme qPCR : 95 ° C pendant 10 min suivi de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min, ainsi que de l’étape de dissociation dont 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min, 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 15 s.</li>
	<li>Déterminer les normes de qPCR : utiliser la dilution en série de l’ADNc préparé à partir d’ARN total isolé provenant d’un animal normal comme un étalon de référence pour la quantification.</li>
	<li>Utiliser l’ARN 18 s BMSB comme étalon interne pour corriger les différences dans la récupération de RNA de tissus32.</li>
</ol>5. foliaire Application dans les grands arbres d’agrumes en pot et semis
Remarque : Les plantes du cultivar «Carrizo» citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), agrume ont été maintenus en serre sous la lumière naturelle et de la température, cultivés en contenants de 1,2 L. Les plantes ont été constamment taillés pour favoriser la croissance des nouvelles pousses foliaires, appelée « fleur ». ACP préfère l’alimentation et la ponte sur les nouvelles pousses des agrumes64.
<ol><li>Sélectionner des plantes ou des semis et ne pas les arroser pendant 2-3 jours avant de les utiliser pour laisser le sol sécher à l’humidité, mais pas complètement secs.</li>
	<li>À l’aide d’un vaporisateur à pompe de main s’appliquent un 200 mL de solution de dsRNA (0,5 mg/mL) à l’aile inférieure (Figure 4 a). NOTE : Préparez le ci-dessus mentionné dsRNA solutions dans l’eau libre de DNase/RNase.</li>
	<li>Après application de pulvérisation, laissez agir la solution appliquée dsRNA à être complètement absorbé par les feuilles. NOTE : Citronniers absorbé l’ARNdb appliquée, et puis les feuilles de deux nouvelles pousses ou de branches qui relevaient avant application, ont été extraits ; dsRNA était détectable à l’aide de qPCR et circulation systémique dans les feuilles arbre de la canopée supérieure dans 3-4 h44,45,46.</li>
	<li>Déguster les nouvelles pousses des arbres précédemment surmontées après que 25-40 jours en recueillant environ 10 feuilles de l’extrémité des quatre branches. Extraire l’ARN total et de les analyser par transcription inverse PCR (RT-PCR) et qPCR pour la présence de la gâchette de dsRNA appliquée en utilisant les amorces énumérés au tableau 1 et précédemment décrit des méthodes46. Remarque : Le prélèvement de l’échantillon total isolement d’ARN, RT-PCR et qPCR ont été réalisées comme décrit précédemment46.</li>
	<li>De même, par voie topique pulvériser dsRNA de 10 mL pour la région du bas d’un semis ou le feuillage des petits arbres en pot. NOTE : Insectes Hémiptères (ACP et GWSS) ont eu un accès alimentation normalement après 24 h, poste de traitements sur les nouvelles pousses (feuilles) qui n’avait pas été aspergé directement, ou qui a eu pour semaines plus tard, ou de plantes entières. Ce produit des insectes qui ont été testés positifs pour l’ARNdb à 3, 6 et 10 jours, après l’alimentation.</li>
</ol>6. sol/racines bassinage demande en gros ou petit en pot semis et agrumes
<ol><li>Sélectionner des plantes ou des semis et ne pas les arroser pendant 2-3 jours avant de les utiliser pour laisser le sol sécher à humide mais ne pas complètement secs (cela crée un espace d’air pour contenir la solution liquide à appliquer).</li>
	<li>Ajouter 1 L de solution de dsRNA (0,2 mg/mL) au sol de grandes plantes en pot (environ 2,5 m) et ajouter 1 L d’eau (chaser) après 1 h.</li>
	<li>Appliquer des arbres de 100 mL de solution de dsRNA (1,33 mg/mL) au sol de 1 m de hauteur en pot dans les sols partiellement secs.</li>
	<li>Pour les petites plantules, appliquer 10 mL de solution de dsRNA (1 mg/mL) au sol dans les cônes ou à racines nues (Figure 4 b, C).</li>
	<li>Laissez les plantes qui reçoivent la solution de dsRNA appliquée comme un bassinage sol tremper pendant 30 min. Puis appliquez seul traitement de l’eau plate pour faciliter l’absorption par les racines (20 mL pour les plantes en contenants jaunes) ou 100 mL si grandes plantes en pots sont > 1 gallon. NOTE : Appliqué topiquement dsRNA à feuillage entraîné détection extrémité distale dans la plupart des branches au sein des traitements post 3 à 6 h, montrant la circulation systémique à travers les arbres. Nouvelles branches de croissance étaient positifs dsRNA à 60-90 jours post traitements. Boutures sont fournis aux insectes (ACP et GWSS) dans un ARNdb alimentation biologique44.</li>
</ol>7. tige robinet (Injection de tronc d’arbre) demande, dans les grands arbres d’agrumes en pot et semis
<ol><li>Sélectionnez les semis d’agrumes, nouveau ou environ 3,5 ans vieilles centrales d’injection d’ARNdb en utilisant la tige robinet méthode (injections de tronc).</li>
	<li>Percer des trous dans les agrumes à l’aide d’une perceuse et un foret de 10 mm, prenant soin de ne pas pour dépasser 2 cm, ou environ la moitié du diamètre de la tige.</li>
	<li>Enroulez le bout de cuivre de chaque injecteur 4 - 6 fois avec une bande large de 0,6 cm (¼ po) de cachetage de film pour éviter les fuites, près de la pointe.</li>
	<li>Verser les injecteurs de tronc d’arbre 6 mL (1,7 mg/mL) de solution de dsRNA diluée dans l’eau libre de DNase/RNase (notée ici en tant que solution colorée).</li>
	<li>Injecter la solution dans le tronc de l’arbre et laissez l’injecteur dans le coffre pour 6 à 10 h permettre l’absorption de la solution de dsRNA. Laisser les insectes pour se nourrir sur les boutures d’arbres traités à 3, 10 et 30 jours qui suivent le traitement. Remarque : L’ARNdb injecté à l’aide de la méthode d’injection de tronc a persisté dans les arbres pour une période de 30 à 60 jours41,42,44. Validation d’Arni a été effectuée par qPCR utilisant les amorces énumérés au tableau 1.</li>
</ol>8. dsRNA Granules argile traitée pour la livraison aux insectes par sol
<ol><li>Versez l’argile absorbante dans un tube conique de 50 mL de la marque de 35 mL (environ 30 g d’argile absorbante) sur le tube.</li>
	<li>Verser 20 mL de solution de dsRNA diluée dans l’eau libre de DNase/RNase (100 µg/mL) dans le tube pour mouiller toutes les absorbants. Boucher le tube à fond conique, incliner le tube afin d’enlever l’air et bouchon du tube.</li>
	<li>Placer le tube droit et laissez reposer pendant 1-2 min pour les particules d’argile absorber la solution.</li>
	<li>Ajouter assez d’argile imbibée d’ARNdb dans le mélange de sol pour remplir un pot de 1 gallon.</li>
	<li>Mélanger et mettre le sol à la main pour bien mélanger l’argile imbibée d’ARNdb dans le sol.</li>
	<li>Utilisez ce sol pour rempoter les semis choisis pour le traitement de l’ARNdb.</li>
	<li>Eau du sol avec 200 mL d’eau plate sans ARNdb. Après 30 min à 1 h, suivre avec 100 mL d’eau plate. Après 24h, mettre la plante sur un calendrier d’arrosage normal.</li>
	<li>Test 4-6 feuilles de plantes en pot traitées avec absorbants d’argile et de dsRNA chaque mois de post traitement de dsRNA en recueillant les feuilles plus apicales de la croissance des plantes nouvelles. NOTE : Plants ou boutures de ces végétaux traités sont nourris aux insectes n’importe quel moment après 24h post traitement et ont été capable de livraison Arni pour jusqu'à un an pour les insectes (données non publiées).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Arni s’est avéré pour être un outil important pour explorer la fonction biologique du gène et la réglementation, avec un grand potentiel d’être utilisé pour la gestion des ravageurs19,68,69,70, 71. la conception et la sélection d’un ou plusieurs gènes appropriés pour faire taire dans une espèce donnée d’insectes et la méthode de livraison de le dsRNA(s) corre...

Insectes hémiptères comprennent certains des ravageurs plus économiquement significatifs d’agriculturebecause de leur capacité à atteindre la croissance démographique élevée et la propagation des maladies des plantes. Le BMSB, H. halys Stål, est un parasite envahissant introduite accidentellement dans l’hémisphère occidental à Allentown, en Pennsylvanie, d’Asie (Chine, Taiwan, Corée et Japon) avec la première observation en 19961. Depuis son introduction, BMSB a été détectée dans 43 États, avec des populations plus élevées dans le milieu de l’Atlantique (DE, MD, PA, New Jersey, Virginie et WV), ainsi qu’au Canada et en Europe et représente une menace potentielle pour l’agriculture2. Comme un parasite polyphage, BMSB peut susciter des dommages à environ 300 identifiés de plantes hôtes, y compris les cultures de grande valeur tels que des pommes, raisins, plantes ornementales, cultures de semences, le soja et maïs. Dommage est causé principalement due au mode d’alimentation dite de lacérer et chasse où l’animal perce la plante hôte avec son stylet aciculaires d’avoir accès aux nutriments entre les tissus vasculaires2,3. BMSB est aussi un parasite intérieur qu’ils peuvent trouver de résidence dans les bassins de vie tels que les écoles et les maisons en automne et hiver2. Produits chimiques et des aéroallergènes sortis BMSB auraient illicite réaction allergique chez les travailleurs de récolte de fruits. BMSB peuvent aussi contribuer à la maladie allergique conduisant à une dermatite de contact, conjonctivite et rhinite chez les personnes sensibles4,5. Un autre insecte hémiptère, l’ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera : Liviidae), est un ravageur important des agrumes et transmet les bactéries limitée dans le phloème (Candidatus Liberibacter asiaticus) provoquant le Huanglongbing (HLB), mieux connu comme citrus greening maladie6,7. HLB a été pour la première fois de la Chine du Sud et s’est propagé aux 40 différents asiatique, africain, océanien, du Sud et nord-américains pays7. Citrus greening est un problème dans le monde entier avec la menace des pertes économiques et financières en raison de la perte d’agrumes ; par conséquent, gestion des ACP est considéré comme primordial pour prévenir et contrôler la HLB.
Mesures pour un contrôle efficace de ces insectes nuisibles requiert habituellement l’application de pesticides chimiques qui sont relativement courtes a vécu. Stratégies de lutte insecticide chimique souvent manquent de stratégies de gestion de l’environnement sécuritaire ou ont diminué la sensibilité en raison de la résistance aux pesticides dans les populations de ravageurs8,9. Donc, le contrôle biologique des ravageurs avec biopesticides moléculaire est une alternative possible, mais son utilisation restera globalement modeste, et diverses espèces de parasitoïdes (p. ex., Trisolcus japonicus) peuvent également être efficaces comme biologiques naturels contrôles. Arni est un potentiel de nouvelles technologies pour la gestion des ravageurs envahissants avec biopesticides moléculaire10. Arni est un mécanisme de régulation génique bien décrite qui facilite le silence efficace génique post-transcriptionnel d’endogène ainsi que d’envahir les ARN doubles brins de façon séquence-spécifique, qui mène finalement à la régulation de l’expression génique à l’ARNm niveau11,12. En bref, lorsque dsRNA exogène est internalisé dans une cellule, qu'il est transformé en siARN par un membre de la superfamille de RNase III nucléase bidentates, appelée Dicer, évolutivement conservée en vers, mouches, plantes, champignons et mammifères13, 14 , 15. ces duplex siARN de 21 à 25 nucléotides est ensuite déroulé et intégré dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC) comme guide RNAs. Ce complexe RISC-RNA permet l’appariement Watson-Crick base à complémentaires cibles ARNm ; Cela conduit finalement au clivage de la protéine Argonaute, une protéine de domaine multi contenant un domaine RNase H-like, qui dégrade l’ARNm correspondants et réduit la traduction des protéines, ce qui conduirait à post-transcriptionnel gene silencing16 , 17 , 18.
Arni pour la lutte antiparasitaire nécessite l’instauration d’ARNdb en vivo pour réduire au silence le gène d’intérêt, activant ainsi la voie de siARN. Diverses méthodes qui ont été utilisés pour la livraison de dsRNA aux insectes et aux cellules d’insecte pour induire RNAi systémique incluent nourrir10,19, tremper20,21,22de la microinjection, transporteurs comme les liposomes 23et autres techniques24. Arni a démontré chez Caenorhabditis elegans pour faire taire l’expression des gènes unc-22 par le feu et Mello25, suivi par précipitation dans l’expression des gènes crépus chez Drosophila melanogaster,26. Les premières études fonctionnelles utilisées microinjection pour livrer des dsRNA chez les insectes, tels que Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum,28,29de Blattella germanica, Halys H.30et lépidoptères (évaluées par Terenius et al. 31). microinjection est avantageuse pour livrer une dose précise et exacte sur le site d’intérêt chez l’insecte. Quoique ces piqûres septiques peuvent déclencher l’expression de gènes liés immunitaires due à un traumatisme32, par conséquent, écartant de sa pratique dans le développement agricole de biopesticides.
Une autre méthode de prestation des ARNdb en vivo est par trempage, qui implique ingestion ou absorption de dsRNA par suspension des animaux ou des cellules généralement dans le milieu extracellulaire contenant des ARNdb. Trempage a été utilisé pour induire efficacement Arni dans les cellules de culture de tissus Drosophila S2 pour inhiber en aval-de-Raf1 (DSOR1) mitogène-protéine kinase kinases (MAPKK)20, ainsi que chez c. elegans pour réduire au silence les POS-1 gène33. Cependant, dsRNA envoyée à l’aide de trempage est moins efficace pour induire l’ARNi contre microinjection20. Arni médiée silencieux chez un insecte à chiquer fut montrée à la chrysomèle des racines du maïs (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) en perfusant l’ARNdb dans une gélose artificiel alimentation10. De précédentes études ont résumé des méthodes permettant de livrer des ARNdb infusé dans les régimes naturels spécifiques aux arthropodes34. Ces méthodes de livraison ont été déterminées plus efficace comparativement à des moyens artificiels de livraison ; comme dans le cas de la mouche tsé-tsé (Glossina morsitans morsitans), où égale précipitation d’un gène du système immunitaire a été observée quand les ARNdb a été livré par la farine de sang ou micro-injection35. De même, la livraison de dsRNA par les gouttelettes dans apple brun léger moth (Epiphyas postvittana)36, larves de teigne des crucifères (Plutella xylostella)37, ainsi que miel abeilles38,39 induite par ARNi efficace. Des expériences d’Arni plus efficaces dans hémiptère ont utilisé des injection d’ARNdb40 parce que l’administration orale d’ARNdb en insectes hémiptères est ardue car il doit être livré à travers les tissus vasculaires de la plante hôte. RNAi efficace s’observe également dans les pays ACP et vitreux ailes sharpshooter cicadelle (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA a été livré à travers agrumes et de vignes qui avaient absorbé des ARNdb dans les tissus vasculaires par bassinage racine, foliaire vaporisateurs, des injections de tronc ou absorption par boutures41,42,43,44,45,46. Cela a également entraîné le premier brevet pour dsRNA contre les pays ACP (2016, nous 20170211082 A1). Livraison des siARN et dsRNA à l’aide de supports tels que des nanoparticules et liposomes confère une stabilité et augmentation inhabituelle de l’ARNdb livré émergent rapidement23,47,48,49 ,,50. Une nouvelle classe de vecteurs à base de nanoparticules d’acides nucléiques pour in vitro et in vivo qui ont été résumées spécifiquement pour des applications thérapeutiques peuvent transmettre un potentiel immense comme vecteurs de livraison adapté51. Nanoparticules comme un véhicule de livraison pour l’ARNdb peuvent avoir des inconvénients dont la solubilité, hydrophobie ou bioaccumulation limitée52, mais une livraison aider ã polymère adapté peut compenser ces inconvénients. Développement et l’utilisation de la prestation des nucléotides émergent aussi appelés « antisens », qui sont simple brin ARN/ADN duplex46.
La vitellogenèse chez les arthropodes est une clé processus contrôlant la reproduction et régulée par l’hormone juvénile (JH) ou l’ecdysone, qui sont les inducteurs principaux de synthèse de la Vg de la masse grasse ; le Vg est finalement repris par l’ovocyte en développement par l’intermédiaire de l’endocytose médiée par le récepteur Vg53. VG est un groupe de polypeptides synthétisés extraovarially, qui est essentiel pour le développement de la protéine grands oeufs jaune vitellin54,55, et par conséquent, il est important dans la reproduction et vieillissement56. VG a été réduit au silence avec succès dans les nématodes57 ainsi que dans l’abeille à miel (Apis mellifera) où par l’appauvrissement de la couche de Vg ARN a été observée chez les adultes et œufs22. Arni silençage de médiation génique post-transcriptionnel de Vg a été testé car on pensait que son appauvrissement conduirait à un effet phénotypique observable telles que réduit la fertilité et la fécondité, pour éventuellement aider à contrôle BMSB. Le gène JHAMT qui code pour la S-adénosyl-L-méthionine (SAM)-dépendante JH acide O-méthyltransférase, catalyse l’étape finale de la JH biosynthèse voie58. Dans cette voie farnésyl pyrophosphate (FPP) est séquentiellement transformé farnésol, acide farnesoic, suivie de la conversion de méthyle farnesoate JH par JHAMT. Cette voie est conservée chez les insectes et arthropodes spécifiquement pour la métamorphose, un processus développemental réglementé par hormones59,60,,61. Chez b. mori, expression des gènes JHAMT et l’activité biosynthétique JH dans les corps allates suggèrent que la répression transcriptionnelle du gène JHAMT est cruciale pour la terminaison de JH biosynthèse58. Par conséquent, les gènes JHAMT et Vg ont été sélectionnés pour épuisement ciblée utilisant l’ARNi. Arni a également été testé dans les arbres d’agrumes pour le contrôle de l’ACP et GWSS. Arbres d’agrumes ont été traités avec dsRNA par bassinage racine, la tige de robinet (injections de tronc), ainsi que les pulvérisations foliaires avec ARN doubles brins contre insectes spécifiques arginine kinase (AK) transcriptions42,44. L’application topique de dsRNA a été détectée dans la canopée des arbres d’agrumes, ce qui indique une livraison efficace à travers les tissus de plantes vasculaires et a entraîné une mortalité accrue dans les pays ACP et GWSS41,42, 45.
Dans la présente étude, nous avons identifié une méthode de livraison d’alimentation naturelle pour les traitements tels que l’ARNdb. Cette nouvelle technique a ensuite été utilisée pour faire taire le JHAMT et le Vg mRNA à l’aide de gènes spécifiques ARN doubles brins en nymphes BMSB comme démontré plus tôt62. Ces nouveaux protocoles de livraison démontrés ici remplacent des systèmes de livraison RNA conventionnels qui utilisent des sprays topiques ou des microinjections. Légumes et fruits, tige robinet, sol Drenchage et absorbants d’argile en peuvent servir pour la livraison de dsRNA, ce qui est essentiel à la poursuite du développement de la gestion des ravageurs et pathogènes des biopesticides.

<table><tbody><tr><td>Insectes marbrée (H. halys)&nbsp ;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insectes&nbsp ;</td>Haricots verts biologiques <td>USDA</td> N/A Plantes d’agrumes <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Solution d’hypochlorite de sodium USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> colorant alimentaire vert&nbsp ;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambres Thermo Forma&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Récipient Magenta (Culture)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp ;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon pulvérisateur</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes de prestation orale arn double-brin d’induire l’interférence d’arn dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloème et plantes sève alimentation insectes envahissent l’intégrité des cultures et des fruits pour récupérer des éléments nutritifs, dans le processus d’endommager les cultures vivrières. Insectes hémiptères représentent un certain nombre de ravageurs économiquement importantes des plantes qui causent des dégâts aux cultures en se nourrissant de la sève. La punaise brune marmorated (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera : Pentatomidae) et le psylle asiatique agrume (ACP), Kuwayama Diaphorina citri (Hemiptera : Liviidae) sont des insectes hémiptères introduits en Amérique du Nord, où ils sont un ravageur envahissant de spécialité de haute valeur, rangée et cultures vivrières de base et d’agrumes, ainsi qu’un ravageur de nuisance quand ils regroupent à l’intérieur. Résistance aux insecticides chez de nombreuses espèces a conduit au développement de méthodes alternatives de stratégies de lutte antiparasitaire. Double-stranded RNA (dsRNA)-médiée par l’interférence ARN (ARNi) est un gène silencieux mécanisme pour des études de génomique fonctionnelles qui a des applications potentielles comme un outil pour la gestion des ravageurs. DsRNA exogène synthétisée ou petits ARN interférents (siARN) peut déclencher silençage de génétique très efficace par le biais de la dégradation de l’ARN endogène, qui est homologue à celui présenté. Utilisation efficace et environnementale de l’ARNi comme biopesticides moléculaire pour le contrôle biologique d’insectes hémiptères exige la livraison in vivo de l’ARNdb en se nourrissant. Nous démontrons ici les méthodes pour la livraison de dsRNA aux insectes : chargement d’ARNdb en haricots verts par immersion et d’absorber de dsRNA de gène-spécifiques avec la livraison par ingestion orale. Nous avons également défini les méthodes de prestation des plantes non transgéniques à l’aide de pulvérisations foliaires, bassinage racine, injections de tronc ainsi que des granules d’argile, qui peuvent être essentielles pour la LIBERATION PROLONGEE d’ARNdb. La prestation efficace de dsRNA ingéré par voie orale a été confirmée comme un dosage efficace pour induire une diminution significative de l’expression des gènes ciblés, tels que l’hormone juvénile l’acide O-méthyltransférase (JHAMT) et de la vitellogénine (Vg). Ces méthodes novatrices représentent des stratégies pour la délivrance de dsRNA à utiliser en protection des végétaux et de surmonter les défis environnementaux pour les ravageurs.

Livraison de légumes dsRNA de médiation en se nourrissant de larves de stade BMSB 4ème a été testé pour le développement des biopesticides moléculaires à l’aide de RNAi de ravageurs envahissants. BMSBs flux à l’aide de leurs stylets aciculaires par un mécanisme appelé lacerate, puis rincez, qui provoque des dégâts considérables aux cultures. Mince de haricots verts biologiques, P. vulgaris L., ont servi à vérifier si les éléments nutritifs ou dsRNA pouvait être livré <...

Cet article explique les nouvelles techniques mises au point pour l’administration orale de l’ARN double brin (dsRNA) à travers les tissus vasculaires des plantes pour l’interférence ARN (ARNi) en sève nourrir les insectes.

Méthodes de prestation orale ARN double-brin d’induire l’interférence d’ARN dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

L’objectif global de ces procédures est de démontrer une méthode d’administration orale naturelle. Pour les ARNdb spécifiques aux gènes, pour induire une interférence ARN in vivo et les insectes ravageurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon de délivrer des biomolécules à l’intérieur des insectes, à élucider l’effet des biopesticides moléculaires à base d’ARNi et à contrôler les insectes dans l’environnement.Le principal avantage de cette technique est que cette administration par le biais d’un silençage génique médié par les acides nucléiques peut être appliquée à l’alimentation de la sève des plantes ainsi qu’aux insectes broyeurs. Bien que les méthodes ici démontrent l’administration d’ARN double brin aux hémiptères, comme la punaise marbrée, la punaise arlequin et le psylle asiatique des agrumes. Ils peuvent être appliqués à d’autres insectes.Pour commencer le protocole, sélectionnez des punaises marbrées du 4e stade précoce, ou nymphes de la punaise marbrée, écloses de la masse d’œufs, et affamez-les pendant 24 heures avant de les nourrir à l’ARNdb. Ensuite, sélectionnez des haricots verts minces et certifiés biologiques et lavez-les avec une solution d’hypochlorite de sodium à 0,2 % pendant cinq minutes. Poursuivez avec trois lavages H2O à double distillation et laissez les grains sécher à l’air.Une fois secs, coupez les haricots verts de l’extrémité du calice sur une longueur totale de 7,5 centimètres à l’aide d’une lame de rasoir propre. Plongez les haricots verts lavés et parés dans un micro-tube à centrifuger de deux millilitres sans capuchon contenant 300 microlitres de solution de contrôle. Faites des dilutions des ARNlc Z, JHAMT ou VGDSRNA synthétisés in vitro, en diluant 5 microgrammes, ou 20 microgrammes, et 300 microlitres d’ARN, de l’eau exempte d’ADN pour obtenir des concentrations finales de 0,017 microgramme par microlitre, ou 0,067 microgramme par microlitre respectivement.Plongez les haricots verts lavés et parés dans un micro-tube à centrifuger sans capuchon de deux millilitres, contenant 300 microlitres de solution d’ARNdb. Enveloppez et scellez les bords des tubes de micro-centrifugeuse, en enfermant les grains immergés pour empêcher l’évaporation de la solution d’ARNdb et pour empêcher les animaux de pénétrer dans le tube de micro-centrifugeuse. Placez les tubes à la verticale à température ambiante pendant trois heures, pour permettre à la solution d’ARNdb de se charger dans tout le haricot vert par capillarité.Placez les tubes dans des récipients de culture propres en polypropylène et placez 3 nymphes de punaise marbrée du 4e stade affamées dans les récipients de culture. Traitez trois insectes par récipient de culture. Chacun contenant trois haricots verts avec une solution de colorant alimentaire vert ou d’ARNdb.Maintenez les insectes à 25 degrés Celsius et 72 % d’humidité relative, sous une température de 16L, 8D photopériode dans un incubateur. Laissez les insectes se nourrir des haricots verts immergés et absorbés dans l’ARNdb pendant cinq jours, et reconstituez-les avec des rations fraîches de haricots verts traités à l’ARNdb après trois jours. Sélectionnez des plantes ou des semis, et ne les arrosez pas pendant deux à trois jours avant de les utiliser, pour laisser le sol sécher à l’humidité, mais pas complètement sec.À l’aide d’un flacon pulvérisateur pompé à la main, appliquez 200 millilitres de solution d’ARNdb sur la canopée inférieure. Échantillonnez la nouvelle croissance des arbres précédemment étêtés après 25 à 40 jours, en prélevant environ 10 feuilles à l’extrémité de quatre branches. Extrayez l’ARN total et analysez-le par RT-PCR et qPCR pour détecter la présence du déclencheur d’ARNdb appliqué.De même, vaporisez localement 10 millilitres d’ARNdb dans la région inférieure d’un semis ou d’un petit feuillage d’arbre en pot. Sélectionnez des plantes ou des semis, et ne les arrosez pas pendant deux à trois jours avant de les utiliser, pour laisser le sol sécher, humide, mais pas complètement sec. Ensuite, ajoutez un litre de solution d’ARNdb au sol des grandes plantes en pot.Ajoutez un litre d’eau au bout d’une heure. Appliquez 100 millilitres de solution d’ARNdb sur le sol d’arbres en pot d’un mètre de haut dans des sols partiellement secs. Laissez tremper les plantes qui reçoivent la solution d’ARNdb sous forme de trempage du sol, pendant 30 minutes.Appliquez ensuite un traitement à base d’eau pour faciliter l’absorption par les racines. Sélectionnez des plants d’agrumes, des plantes nouvelles ou d’environ 3,5 ans pour injecter de l’ARNdb à l’aide du robinet de tige, également connu sous le nom de méthode d’injection du tronc. Enroulez l’embout en cuivre de chaque injecteur quatre à six fois avec une bande de film de plafond de 0,6 centimètre de large pour éviter les fuites près de l’embout.Ensuite, remplissez les injecteurs de tronc d’arbre avec six millilitres de solution d’ARNdb diluée avec de l’ADN, de l’eau sans ARN. Percez des trous dans les agrumes à l’aide d’un foret de 10 millilitres et veillez à ne pas dépasser deux centimètres, soit environ la moitié du diamètre de la tige. Ensuite, injectez la solution dans le tronc de l’arbre et laissez l’injecteur dans le tronc pendant six à 10 heures pour permettre l’absorption de la solution d’ARNdb.Laissez les insectes se nourrir des boutures des arbres traités 3, 10 et 30 jours après le traitement. Versez 30 grammes de l’absorbant d’argile dans un tube conique de 50 millilitres jusqu’à la marque de 35 millilitres. Versez 20 millilitres de solution d’ARNdb diluée dans de l’eau sans ADN et ARN dans le tube pour mouiller tout l’absorbant.Fermez le tube conique, inclinez le tube pour aider à évacuer l’air, placez le tube à la verticale et laissez-le reposer pendant une à deux minutes pendant que les particules d’argile absorbent la solution. Ajoutez suffisamment d’argile imbibée d’ARNdb dans le mélange de sol pour remplir un pot d’un gallon. Mélangez et retournez le sol à la main pour bien mélanger l’argile imbibée de dsRNA dans le sol.Utilisez le sol pour rempoter les semis sélectionnés pour le traitement à l’ARNdb. Arrosez le sol avec 200 millilitres d’eau plate, sans ARNdb, après 30 minutes à une heure. Poursuivez avec 100 millilitres d’eau plate.Après 24 heures, mettez la plante sur un calendrier d’arrosage normal. Testez quatre à six feuilles des plantes en pot traitées avec des absorbants d’argile et de l’ARNdb chaque mois, après le traitement de l’ARNdb, en prélevant les feuilles les plus apicales de la nouvelle croissance de la plante. La QPCR de segments de haricots verts immergés dans de l’ARNdb synthétisé in vitro, spécifique de la punaise marbrée, ou ARNm de la punaise marbrée, a indiqué que l’induction réussie de l’ARNi était réussie car l’expression des cibles JHAMT et Vg était significativement réduite in vivo.Ce mode d’administration est également efficace sur un autre ravageur hémiptère, la punaise arlequin. Comme l’indiquent leurs excréments de couleur verte. Après avoir regardé ces démonstrations visuelles, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de délivrer de l’ARN double brin aux insectes par ingestion orale pour induire des insectes ARNi in vivo.Les progrès réalisés dans la technologie des nucléotides de l’ARNi continuent d’accroître les capacités des chercheurs à moduler l’ARN, l’expression des gènes et les niveaux de protéines dans un large éventail d’organismes vivants. Cela va des plantes aux insectes, en passant par les micro-organismes les plus difficiles. Ainsi, alors que le coût de production de l’ARN double brin continue de diminuer et que les méthodes d’administration et de stabilité continuent de s’améliorer, l’avenir des technologies ARNi continuera d’être utilisé pour résoudre des problèmes émergents et complexes.

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ARNi médiée double inactivation génique et de mesure de la perception gustative chez les abeilles (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

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Ce manuscrit montre l’épuisement d’expression de gène dans l’intestin moyen de la blatte germanique par ingestion orale de l’ARN double brin encapsulée dans des liposomes.

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