Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la capacité des adjuvants d’intérêt à générer des lymphocytes T cytotoxiques en surveillant la prolifération des lymphocytes T OT1 CD8 positifs colorés au CFSE transférés par adoption dans les ganglions lymphatiques drainants et la rate des animaux receveurs immunisés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la vaccinologie, comme la puissance d’un adjuvant pour générer une réponse cellulaire de cytotoxicité. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez déterminer non seulement la capacité CTL d’un adjuvant, mais aussi si celle-ci est locale ou systémique et vous ne pouvez le faire qu’en quatre jours.

La démonstration de la procédure sera assurée par une technicienne de notre laboratoire, Elena Reinhard. Pour isoler les lymphocytes T CD8 positifs de la cuisse 1,1 de souris OT1, prélevez d’abord la rate et les ganglions lymphatiques inguinaux, axillaires et cervicaux conformément aux protocoles standard, en plaçant tous les organes dans une crépine de 100 micromètres dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant trois à cinq millilitres de milieu complet sur glace par souris au fur et à mesure qu’ils sont collectés. Ne pas prélever dans les grandes rates ou les ganglions lymphatiques d’OT1, car les lymphocytes T de ces tissus lymphatiques peuvent être leucémiques et proliférer même sans stimulation confondant les résultats du test.

Lorsque tous les organes ont été prélevés sur chaque animal donneur, utilisez un piston de seringue pour écraser les échantillons à travers le filtre à mailles et transférez les suspensions simples résultantes dans un tube conique de 15 millilitres par souris. Granulez les cellules par centrifugation, suivie d’un lavage par centrifugation dans 10 millilitres de PBS froid. Lysez la pastille de globule rouge dans un millilitre de tampon de chlorure d’ammonium par tube sur de la glace.

Après 90 secondes, lavez les cellules dans 10 millilitres supplémentaires de PBS et remettez en suspension les cellules dans un millilitre de PBS plus 5 % FBS par tube. Ensuite, utilisez un kit sélectif négatif pour isoler les lymphocytes T CD8 positifs conformément aux protocoles d’isolement standard des billes magnétiques et comptez le nombre de lymphocytes T CD8 positifs triés par billes magnétiques. Ensuite, diluez les lymphocytes T à une concentration de PBS de une à cinq par 10 à sept cellules par millilitre dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et colorez chaque échantillon de cellule avec cinq micromolaires CFSE pendant sept minutes à 37 degrés Celsius et à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, éteignez la réaction de coloration avec un volume égal de FBS et remettez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant sept minutes supplémentaires. À la fin de la deuxième incubation, lavez les cellules deux fois dans 10 millilitres de PBS par lavage et remettez les cellules en suspension dans trois à cinq cellules par 10 à sept cellules par millilitre de volumes de PBS. Pour le transfert adoptif des cellules T OT1 marquées CFSE, chargez les cellules dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 25 par échantillon de cellule expérimentale et immobilisez la première souris receveuse dans un dispositif de contention.

Ensuite, lorsque les veines de la queue se sont vasodilatées, délivrez 100 microlitres de cellules via la veine latérale ou dorsale de la queue. Pour l’immunisation des animaux transférés adoptivement, rasez la fourrure sur le fessier superficiel de la souris transplantée de cellules T OT1 et utilisez une aiguille de calibre 25 pour injecter par voie sous-cutanée 50 microlitres d’OVA exempt d’endotoxines dans la zone rasée. Il est important d’utiliser des OVA sans endotoxines, car des traces d’endotoxines dans les OVA peuvent vous conduire à de faux résultats.

Quarante-huit heures après l’immunisation, prélever les ganglions lymphatiques inguinaux et la rate de chaque animal receveur selon les protocoles standard et générer des suspensions individuelles de cellules uniques pour chaque échantillon de ganglions lymphatiques et de rate, comme nous venons de le démontrer. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS par échantillon. Pour colorer les échantillons pour l’analyse cytométrique en flux, incubez les cellules avec 100 microlitres de cocktail principal d’anticorps primaires conjugués aux fluorophores pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois dans 10 millilitres de PBS et remettre les échantillons en suspension dans 0,5 à un millilitre de PBS par tube. Filtrez les cellules à travers des crépines de 70 à 100 micromètres dans des tubes d’analyse de cytométrie en flux de cinq millimètres et acquérez les commandes de compensation de coloration uniques ainsi que les échantillons dans le cytomètre en flux. Pour bloquer les échantillons, ouvrez un graphique de hauteur de diffusion vers l’avant en fonction de la zone de dispersion vers l’avant et un graphique et une porte pour exclure les doublets.

Générer un graphique FITC en fonction de l’autofluorescence afin de distinguer la population de cellules véritablement colorées au CSFE des cellules à haute autofluorescence. Identifiez ces cellules colorées au CSFE OT1 comme les populations qui s’étendent principalement sur l’axe FITC. Pour distinguer les cellules dérivées d’animaux donneurs de celles d’animaux receveurs, il faut contrôler les cellules 1,1 plus CD90 de la cuisse 0,1 plus les cellules T CD8 plus et réintroduire la population de CD8 plus pour exclure les cellules T CD4 plus.

Ensuite, affichez cette population de lymphocytes T CD8 proliférés dans un histogramme en fonction de leur expression CSFE et répartissez les populations proliférées d’une intensité de 10 à la seconde jusqu’à l’intensité de la population témoin non divisée. Acquérir au moins 5 000 événements pour les contrôles de compensation et 10 000 événements pour chaque échantillon à un débit faible ou moyen. Dans cette expérience, deux groupes de souris ont été vaccinés avec l’un des deux adjuvants différents.

Les souris à qui on a injecté de l’OVA plus le deuxième adjuvant ont présenté une capacité de génération de lymphocytes T cytotoxiques plus élevée localement dans les ganglions lymphatiques drainants par rapport aux souris auxquelles on a injecté le premier adjuvant plus l’OVA, l’OVA seul ou le vaccin témoin PBS. En revanche, chez les souris auxquelles on a injecté le deuxième adjuvant plus OVA n’a pas généré de réponse cytotoxique des lymphocytes T dans un compartiment systémique, tandis que les lymphocytes T CD8 positifs isolés de la rate des souris adjuvantes un plus OVA ont montré des niveaux de prolifération plus élevés que les lymphocytes T CD8 positifs spléniques isolés de l’OVA seul, du contrôle PBS et des animaux vaccinés avec l’adjuvant deux plus OVA. Une fois maîtrisée, cette technique vous permettra de déterminer la capacité CTL d’une molécule adjuvante en utilisant l’antigène OVA en seulement quatre jours de travail.

Après avoir effectué cette technique, vous serez en mesure d’appliquer davantage toutes les autres techniques aux lymphocytes T isolés, puis de phénotyper le profil cytokinique ou le profil métabolique de la réponse CTL de votre adjuvant.